Name: FRET de alta precisión a nivel de molécula única para la determinación de estructuras de biomoléculas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Aprende FRET de alta precisión a nivel de molécula única para identificar estados conformacionales del receptor NMDA. Esta técnica permite construir modelos estructurales con mediciones de distancia exactas en neurociencia.

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VJ y HS reconocen el apoyo de NIH R01 GM094246 a VJ. HS reconoce fondos de puesta en marcha del Programa de Investigación Creativa de la Universidad de Clemson y el Centro de Ciencia de Materiales Ópticos y Tecnologías de Ingeniería en la Universidad de Clemson. Este proyecto también fue apoyado por una beca de formación del Centro Keck para el Entrenamiento Interdisciplinario en Biociencias de los Consorcios de la Costa del Golfo (NIGMS Subvención No. 1 T32GM089657-05) y la Beca de la Fundación Schissler para Estudios Traslacionales de Enfermedades Humanas Comunes a DD. El contenido es exclusivamente responsabilidad de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

Todos los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia con el contenido de este artículo.

En este trabajo se presenta el protocolo para alinear, calibrar y medir las distancias de interdye con alta precisión usando experimentos FRET de una sola molécula PIE-MFD. Al calibrar cuidadosamente todos los parámetros instrumentales, se puede aumentar la precisión de las distancias medidas y alcanzar la precisión de Angstrom. Para ello, se utilizan varios histogramas multidimensionales para analizar e identificar poblaciones para su posterior caracterización. Utilizando el tiempo macro medio para verificar la estabil...

Un objetivo fundamental de los estudios de biología estructural es desentrañar la relación entre la estructura y la función de las máquinas biomoleculares. La primera impresión visual de las biomoléculas ( por ejemplo, proteínas y ácidos nucleicos) se produjo en la década de 1950 a través del desarrollo de la cristalografía de rayos X 1 , 2 . La cristalografía de rayos X proporciona información estructural estática de alta resolución restringida por el empaque de cristal. Por lo tanto, la inmovilidad inherente de los modelos estructurales de rayos X evita la naturaleza dinámica de las biomoléculas, un factor que afecta a la mayoría de las funciones biológicas [ 3 , 4 , 5] . La resonancia magnética nuclear (RMN) 6 , 7 , 8 proporcionó una solución alternativa al problema resolviendo modelos estructurales en soluciones acuosas. Una gran ventajaDe la RMN es su capacidad para recuperar la naturaleza intrínseca dinámica de las biomoléculas y conjuntos conformacionales, lo que ayuda a aclarar las relaciones intrínsecas entre la estructura, la dinámica y la función 3 , 4 , 5 . Sin embargo, la RMN, limitada por el tamaño de la muestra y grandes cantidades de muestra, requiere complejas estrategias de etiquetado para sistemas más grandes. Por lo tanto, existe una necesidad acuciante de desarrollar métodos alternativos en biología estructural. Históricamente, la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) 9 no ha tenido un papel importante en la biología estructural debido a la idea errónea de que FRET proporciona medidas de distancia de baja precisión. Es el propósito de este protocolo revisar la capacidad de FRET para determinar las distancias en la escala nanométrica, de tal manera que estas distancias pueden ser utilizadas para construir modelos estructurales de biomoléculas. El primer experimento verificLa dependencia de R - 6 de la eficiencia de FRET fue realizada por Stryer en 1967 10 midiendo poliprolinas de varias longitudes como una &quot;regla espectroscópica&quot;. Un experimento similar se llevó a cabo a nivel de una sola molécula en 2005 [ 11] . Las moléculas de poliprolina resultaron ser no ideales y, por lo tanto, las moléculas de ADN de doble cadena se utilizaron más tarde 12 . Esto abrió la ventana para medidas de distancia precisas y la idea de utilizar FRET para identificar las propiedades estructurales de las biomoléculas. FRET es óptimo cuando el rango de distancia entre interditos es de ~ 0.6-1.3 R 0 , donde R 0 es la distancia de Förster. Para fluoróforos típicos usados ​​en experimentos de FRET de molécula única, R $ . $ Es de aproximadamente 50 Å. Típicamente, FRET ofrece muchas ventajas sobre otros métodos en su capacidad de resolver y diferenciar las estructuras y la dinámica enHeterogéneos: i) Debido a la máxima sensibilidad de la fluorescencia, los experimentos FRET de una sola molécula 13 , 14 , 15 , 16 pueden resolver conjuntos heterogéneos contando directamente y caracterizando simultáneamente las estructuras de sus miembros individuales. (Ii) Las vías de reacción complejas pueden ser descifradas directamente en estudios FRET de molécula única porque no es necesaria la sincronización de un conjunto. (Iii) FRET puede acceder a una amplia gama de dominios temporales que abarcan más de 10 décadas en el tiempo, cubriendo una amplia variedad de dinámicas biológicamente relevantes. (Iv) Los experimentos de FRET pueden realizarse en cualquier condición de solución, tanto in vitro como in vivo . La combinación de FRET con microscopía de fluorescencia permite el estudio de estructuras moleculares y las interacciones directamente en las células vivas [ 15 , 16 , </<html> Sup&gt; 17 , 18 , 19 , incluso con alta precisión 20 . (V) FRET se puede aplicar a sistemas de casi cualquier tamaño ( por ejemplo, oligómeros de poliprolina 21 , 22 , 23 , 24 , Hsp9025, transcriptasa inversa 26 de HIV y ribosomas 27 ). (Vi) Por último, una red de distancias que contiene toda la dimensionalidad de las biomoléculas podría utilizarse para derivar modelos estructurales de moléculas estáticas o dinámicas 18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,Ref &quot;&gt; 35 , 36 , 37 . Por lo tanto, la espectroscopia FRET de una sola molécula se puede utilizar para derivar distancias que son lo suficientemente precisas para ser utilizado para modelado estructural restringido a distancia [ 26] . Esto es posible aprovechando la detección de fluorescencia multiparámetro 28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , que utiliza ocho dimensiones de información de fluorescencia ( es decir, espectro de excitación, espectro de fluorescencia, anisotropía, duración de la fluorescencia, rendimiento cuántico de fluorescencia, El tiempo macroscópico, las intensidades de fluorescencia y la distancia entre los fluoróforos) para proporcionar con exactitud y precisión las restricciones de distancia. Además, la excitación intercalada pulsada (PIE) se combina con MFD(PIE-MFD) 42 para monitorear la fluorescencia del aceptor de excitación directo y seleccionar eventos de molécula única que surgen de muestras que contienen una estequiometría de donante a aceptor de 1: 1. Una configuración típica de PIE-MFD usa láseres de excitación entrelazados de dos pulsos conectados a un cuerpo de microscopio confocal, donde la detección de fotones se divide en cuatro canales diferentes en diferentes ventanas espectrales y características de polarización. Más detalles se pueden encontrar en la Figura 1 . Es importante señalar que FRET debe combinarse con métodos computacionales para lograr atomístico-como los modelos estructurales que son coherentes con los resultados FRET 26 , 30 . No es el objetivo del presente protocolo revisar la metodología asociada para construir modelos estructurales con distancias derivadas de FRET. Sin embargo, estos enfoques se han aplicado en combinación con otras técnicas ( por ejemplo, dispersión de rayos X de ángulo pequeñoO la resonancia paramagnética electrónica), dando origen al campo de la biología estructural integradora 43 , 44 , 45 , 46 . El objetivo actual es allanar el camino para FRET como una herramienta cuantitativa en biología estructural. Como ejemplo, esta metodología se utilizó para identificar tres estados conformacionales en el dominio de unión al ligando (LBD) del receptor N-metil-D-aspartato (NMDA). El objetivo final es superar las limitaciones antes mencionadas y traer FRET entre los métodos integradores utilizados para la determinación estructural de biomoléculas proporcionando distancias medidas con alta precisión.

<table><tbody><tr><td>carbón vegetal</td><td>Merck KGaA</td><td>K42964486 320</td><td></td></tr><tr><td>filtro de jeringa</td><td>Fisherbrand</td><td>09-719C</td><td>tamaño: 0.20 y micro; </td></tr><tr><td>cubreobjetos con cámara</td><td>Fisher Scientific</td><td>155409</td><td>vidrio de borosilicato de 1,5, 8 pocillos cubreobjetos de</td></tr><tr><td>microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>063014-9</td><td>tamaño: 24 x 60-1,5</td></tr><tr><td>Agua libre de nucleasa</td><td>Fisher Scientific</td><td>148859</td><td>sin nucleasa</td></tr><tr><td>tween-20</td><td>Thermo Scientific</td><td>28320</td><td>Solución al 10% de hebra de ADN aceptor de polisorbato 20</td></tr><tr><td>( High FRET)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>178124895</td><td>5&agudo;-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td></tr><tr><td>hebra de ADN aceptora (FELL bajo)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>177956424</td><td>5&acute;-d (CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC</td></tr><tr><td>)hebra de ADN del donante</td><td>integrada Tecnologías de ADN</td><td>177951437</td><td>5&agudo; -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)</td></tr><tr><td>hebra de ADN (sin FRET)</td><td>Tecnologías</td><td></td> de ADN integradas <td>5&agudo; -d (CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td></tr><tr><td>termociclador</td><td>Eppendorf</td><td>E6331000025</td><td>gradiente</td></tr> <tr><td>de nexoAlexa Fluor 488 C5&nbsp; Maleimide</td><td>Thermo Scientific</td><td>A10254</td><td>denominado fluoróforo verde cian en el manuscrito</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 C2&nbsp; Maleimida</td><td>Thermo Scientific</td><td>A20347</td><td>denominado fluoróforo rojo lejano en el manuscrito</td></tr><tr><td>Rhodamine 110</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83695-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine 101</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83694-500MG</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth, Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426</td><td>Para el cultivo de E. coli</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td>Usado en 100 &micro; concentración final g/mL en medio LB selectivo para mantener la selección de plásmidos</td></tr><tr><td>Tetraciclina&nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>58346</td><td>utilizado en 12.5 y micro; concentración final de g/mL en medio LB selectivo para mantener la mutación de gor (flutatión reductasa) en cepas de Origami B(DE3) para facilitar la oxidación del enlace disulfuro</td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td>Utilizado en 15 &micro; concentración final de g/mL en medio LB selectivo para mantener la mutación trxB (rhiorredoxina reductasa) en tinciones de B(DE3) para facilitar la oxidación del enlace disulfuro</td></tr><tr><td>Células competentes de origami B(DE3)</td><td>Millipore</td><td>70837-3</td><td>Células competentes E. coli para la expresión de proteínas con puentes disulfuro</td></tr><tr><td>Isopropil-&beta;-D-tiogalactopiranósido (IPTG)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755</td><td>Para la inducción de la expresión de proteínas E. coli</td></tr><tr><td>Quelante HiTrap HP</td><td>GE Life Sciences</td><td>17-0409-01</td><td>Para la purificación a gran escala de FPLC de la proteína marcada con His</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56749</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 Columna de desalinización</td><td>GE Life Sciences</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>AktaPurifier</td><td>GE Life Sciences</td><td>28406264</td><td>FPLC Instrumento Tubo</td></tr><tr>de<td>diálisis</td><td>Laboratorios de espectro</td><td>132562</td><td>15 kD MWCO 24 mm Ancho de aFlanca, 10 metros/rollo</td></tr><tr><td>Dicroicos</td><td>Semrock</td><td>FF500/646-Di01-25x36</td><td>500/646 BrightLight</td></tr><tr><td>50/50 Polarizador divisor de haz</td><td>Qioptiq Linos&nbsp;</td><td>G33 5743 000</td><td>Polarizador de película de 10 x 10</td></tr><tr><td>Filtro de paso verde Chroma</td><td></td><td>ET525/50m</td><td>ET525/50m Montaje de 25 mm de diámetro</td></tr><tr><td>Filtro de paso rojo</td><td>Chroma</td><td>ET720/150m</td><td>ET720/150m Montaje de 25 mm de diámetro</td></tr><tr><td>Medidor de potencia</td><td>ThorLabd</td><td>PM200</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro UV-Vis</td><td>Varian</td><td>Cary300Bio</td><td></td></tr><tr><td>Fluorolog 3 Horiba</td><td></td><td>FL3-22-R3</td><td></td></tr><tr><td>Fluorohub Controlador TCSPC</td><td>Horiba</td><td>Fluorohub-B</td><td>TCSPC electrónica para mediciones de conjuntos</td></tr><tr><td>NanoLed 485L</td><td>Horiba</td><td>485L</td><td>Láser de diodo azul</td></tr><tr><td>NanoLed 635L</td><td>Horiba</td><td>635L</td><td>Láser de diodo rojo</td></tr><tr><td>Microscopio Olympus IX73</td> Marco de <td>microscopio</td><td>Olympus</td><td>IX73P2F</td></tr><tr><td>Detector híbrido PMA 40</td><td>PicoQuant GmbH</td><td>932200, PMA 40</td><td>Optimizado para la detección de verde</td></tr><tr><td>PMA 50 Detector híbrido</td><td>PicoQuant GmbH</td><td>932201, PMA 50</td><td>Optimizado para la sensibilidad del cambiador de dientes láser de</td></tr><tr><td>485 nm</td><td>PicoQuant GmbH</td><td>LDH-D-C-485</td><td></td></tr><tr><td>láser de 640 nm</td><td>PicoQuant GmbH</td><td>LDH-D-C-640</td><td></td></tr><tr><td>Hydraharp 400 y software de adquisición TTTR</td><td>PicoQuant</td><td>930021</td><td>Temporizador de eventos de picosegundos y unidad de coutning de fotón único correlacionado con el tiempo, incluye el software de adquisición TTTR</td></tr><tr><td>SEPIA II SLM 828 y el software SEPIA</td><td>PicoQuant</td><td>910028</td><td>Laser driver para pulsos de picosegundos, incluye controlador de software SEPIA.</td></tr><tr><td></td><td>computadora Dell</td><td>optiplex 7010</td><td>cpu: i7-3770 Memoria RAM: 16 GB</td></tr><tr><td>FRET Software de posicionamiento y detección (FPS)</td><td>Heinrich Heine Unviersity</td><td></td><td>Incluye el Accesibel Volume clacualtor disponible en http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html</td></tr><tr><td>suite MFD</td><td>Heinrich Heine Unviersity</td><td></td><td>Incluye el paquete de software BIFL Paris; Margarita para la visualización de las imágenes multiparamétricas, y el software de Análisis de Distribución de Probabilidad disponible en http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html</td></tr></tbody></table>

fret de alta precisión a nivel de molécula única para la determinación de estructuras de biomoléculas

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Aquí se presenta un protocolo sobre cómo realizar mediciones de distancia interdye de alta precisión utilizando la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) a nivel de molécula única en el modo de detección de fluorescencia multiparámetro (MFD). MFD maximiza el uso de todas las &quot;dimensiones&quot; de la fluorescencia para reducir los artefactos fotofísicos y experimentales y permite la medición de la distancia interdye con una precisión de hasta 1 Å en biomoléculas rígidas. Este método se utilizó para identificar tres estados conformacionales del dominio de unión al ligando del receptor N-metil-D-aspartato (NMDA) para explicar la activación del receptor tras la unión del ligando. Al comparar las estructuras cristalográficas conocidas con mediciones experimentales, acordaron dentro de menos de 3 Å para biomoléculas más dinámicas. La reunión de un conjunto de restricciones de distancia que cubre toda la dimensionalidad de las biomoléculas haría posible proporcionar un modelo estructural de biomolécula dinámicaEs

En experimentos típicos de smFRET usando una configuración de MFD (líneas de láser: 485 nm a 60 μW y 640 nm a 23 μW, sección 5.1), la muestra de fluorescencia se diluye a una concentración picomolar baja ( 10-12 M = 1 pM) y se coloca En un microscopio confocal, donde un pulso de láser sub-nanosegundo excita las moléculas marcadas que se difunden libremente a través de un volumen de excitación. Un volumen confocal típico es &lt;4 femtolitros (fL). A concentraciones tan bajas, s...

Aquí se presenta un protocolo para experimentos FRET de alta precisión en el nivel de una sola molécula. Además, esta metodología puede usarse para identificar tres estados conformacionales en el dominio de unión al ligando del receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA). Determinar las distancias exactas es el primer paso hacia la construcción de modelos estructurales basados ​​en experimentos FRET.

FRET de alta precisión a nivel de molécula única para la determinación de estructuras de biomoléculas

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

El objetivo general de este protocolo es realizar mediciones de distancia entre colorantes de alta precisión utilizando la detección de fluorescencia multiparamétrica de F

high-precision-fret-at-single-molecule-level-for-biomolecule

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

En este artículo se describe cómo obtener FRET rastros de moléculas individuales de ADN inmovilizado en una superficie utilizando un microscopio confocal de barrido automático.

Sistema Automatizado de Soltero mediciones de fluorescencia de la molécula de superficie inmovilizada Biomoléculas

Fluoróforos individuales pueden ser localizados con precisión nanométrica utilizando FIONA. Aquí se reporta un resumen de la técnica de FIONA, y la forma de llevar a cabo experimentos de FIONA se describe.

Imágenes de fluorescencia con un nanómetros Precisión (FIONA)

Se presenta un protocolo para acoplar una gran variedad de moléculas individuales covalentemente en una punta AFM. Se proporcionan procedimientos y ejemplos para determinar la fuerza de adhesión y la energía libre de estas moléculas sobre soportes sólidos y bio-interfaces.

Investigando individual molécula de adhesión por espectroscopia de fuerza atómica

Presentamos la configuración y el procedimiento experimental para obtener datos smFRET de grandes redes de donantes-aceptores con un microscopio TIRF. El análisis paso a paso de estas mediciones con el software de inferencia bayesiana Fast-NPS proporciona información estructural de alta resolución mediante la aplicación de modelos de colorantes adaptados.

La información estructural a partir de una sola molécula de FRET experimentos utilizando el Nano-posicionamiento Sistema Rápido

Se describen los procedimientos y estrategias para medir las propiedades mecánicas y las vías despliegue mecánicas de las moléculas de proteína sola utilizando un microscopio de fuerza atómica. También mostramos resultados representativos como referencia para la selección y justificación de las grabaciones de molécula única de proteína buena.

Espectroscopia de la fuerza de las moléculas de proteína sola utilizando un microscopio de fuerza atómica

Este trabajo presenta un flujo de trabajo para el seguimiento de la posición atómica en imágenes de microscopía electrónica de transmisión de resolución atómica. Este flujo de trabajo se realiza utilizando una aplicación matlab de código abierto (EASY-STEM).

Seguimiento de posición atómica de precisión picométrica a través de microscopía electrónica

Este artículo proporciona instrucciones paso a paso para realizar mediciones FRET precisas y totalmente corregidas en biomoléculas individuales y de difusión libre utilizando el smfBox de código abierto y económico, desde el encendido, pasando por la alineación y el enfoque, hasta la recopilación y el análisis de datos.

Realización de mediciones FRET precisas y precisas de una sola molécula utilizando el smfBox de código abierto

La mejora de la fluorescencia inducida por proteínas de una sola molécula resuelta en el tiempo es un útil sensor de proximidad espectroscópico de fluorescencia sensible a los cambios estructurales locales en las proteínas. Aquí mostramos que se puede usar para descubrir conformaciones locales estables en α-sinucleína, que también se conoce como globularmente no estructurada e inestable cuando se mide utilizando la regla FRET de mayor alcance.

Utilizando la mejora de la fluorescencia inducida por proteínas resueltas en el tiempo para identificar conformaciones locales estables un monómero α-sinucleína a la vez

Este artículo presenta un método para el análisis espaciotemporal de sondas móviles basadas en la transferencia de energía de resonancia de Förster (smFRET) de una sola molécula utilizando microscopía de fluorescencia de campo amplio. El kit de herramientas de software recientemente desarrollado permite la determinación de trazas de tiempo smFRET de sondas en movimiento, incluida la eficiencia FRET correcta y las posiciones moleculares, como funciones del tiempo.

Análisis espaciotemporal bidimensional automatizado de sondas MÓVILES FRET de una sola molécula

El estudio detalla la metodología del mapeo FRET, incluida la selección de sitios de etiquetado, la elección de tintes, la adquisición y el análisis de datos. Esta metodología es efectiva para determinar los sitios de unión, los cambios conformacionales y los movimientos dinámicos en los sistemas de proteínas y es más útil si se realiza junto con la información estructural 3D existente.

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features

Aquí, presentamos el protocolo para estudiar la flexibilidad y dinámica local de biomoléculas utilizando anisotropía de fluorescencia resuelta en el tiempo a nivel de una sola molécula en modo de microscopía confocal.

Anisotropía de fluorescencia resuelta en el tiempo a partir de moléculas individuales para caracterizar la flexibilidad local en biomoléculas

Aprende FRET de alta precisión a nivel de molécula única para identificar estados conformacionales del receptor NMDA. Esta técnica permite construir modelos estructurales con mediciones de distancia exactas en neurociencia.

FRET de alta precisión a nivel de molécula única para la determinación de estructuras de biomoléculas

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