Name: Microscopía de fluorescencia de vida o fijadas y teñidas a base de hoja de luz Tribolium castaneum Los embriones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Aprende microscopía de fluorescencia de hoja de luz para estudiar la morfogénesis en embriones de Tribolium castaneum. Este método permite la observación no invasiva a largo plazo con mínima fototoxicidad.

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Agradecemos a Sven Plath para soporte técnico. La línea transgénica glía-azul fue una especie de regalo de Gregor Bucher (Göttingen, Alemania). La investigación fue financiada por el Cluster de Excelencia Frankfurt am Main de complejos macromoleculares (CEF-MC, EXC 115, altavoz Volker Dötsch) otorgado en parte a EHKS en el Instituto Buchmann Molecular Life Sciences (BMLS, director Enrico Schleiff) en el Goethe Universität Frankfurt am Main por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

Los autores no tienen nada que revelar. Contribuciones de autor FS y EHKS concibieron la investigación. FS generado las líneas AGOC transgénicas. imágenes de fluorescencia basado en lámina de luz se realizó por FS y SK. FS y EHKS escribió el manuscrito con el aporte de SK.

Control de calidad En los ensayos de formación de imágenes en vivo, el procedimiento de preparación y la grabación debe ser no invasivo, es decir, ni la mecánica y manipulación de productos químicos (recogida, dechorionation, de montaje en el soporte de la muestra), ni la carga integrada de energía durante la observación debe afectar a la viabilidad de la muestra. Para los estudios que caracterizan el desarrollo WT, se recomienda el uso de datos sólo a partir de exp...

El escarabajo de la harina Tribolium castaneum rojo, que pertenece a la gran familia de escarabajos negros (Tenebrionidae), tiene una larga historia dentro de las ciencias agrícolas y de la vida y es el organismo modelo modelo de insectos segunda mejor estudiado después de la mosca de la fruta Drosophila melanogaster. Durante las últimas cuatro décadas, se convirtió en un poderoso y popular organismo modelo en la genética del desarrollo de insectos, en la biología del desarrollo evolutivo y, durante los últimos veinte años, en la morfogénesis embrionaria para una variedad de razones: Drosophila y Tribolium ambos pertenecen a la Holometabola, pero se separaron hace aproximadamente 300 millones de años 1, 2, 3, 4. Mientras que el desarrollo embrionario de Drosophila se considera comúnmente como altamente derivada, Tribolium muestra un modo más ancestral de develrrollo que se encuentra en una proporción considerablemente mayor de especies de insectos 5, 6, 7, 8, 9. En primer lugar, Tribolium exhibe desarrollo de la cabeza no involutiva, es decir, sus partes de la boca y las antenas ya surgen durante la embriogénesis 10, 11, 12, 13, 14, 15. En segundo lugar, Tribolium sigue los principios de desarrollo a corto germen, es decir, segmentos abdominales se añaden secuencialmente a partir de una zona de crecimiento posterior durante la elongación germband 16, 17, 18, 19. En tercer lugar, Tribolium desarrolla y se degrada más tardedos membranas extraembrionarias es decir, el amnios, que cubre el embrión solamente ventralmente, y la serosa, que envuelve el embrión completamente 20, 21, 22. Ambas membranas juegan un morfogenética fundamental 23 así como la función de protección contra los microorganismos 24, 25 y la desecación 26. En cuarto lugar, las piernas embrionaria en desarrollo son totalmente funcionales durante la etapa de la vida de las larvas y sirven como los primordios de las piernas de adultos durante la metamorfosis de pupa 27, 28, 29, 30, 31. Debido a su tamaño y modestos pequeñas demandas, el cultivo de Tribolium en el laboratorio es bastante sencillo. Los cultivos de tipo salvaje (WT) cepas o líneas transgénicas consisten típicamente de alrededor de 100-300 adultos y puede mantenerse dentro de botellas de un litro de vidrio (la huella de 80 cm 2) lleno de tres a cuatro centímetros de alto (aproximadamente 50 g) con medio de crecimiento que consiste en trigo de grano completo harina suplementado con levadura seca inactiva. Un suministro de agua no es necesario. Esto permite que incluso pequeños laboratorios para mantener docenas de culturas escarabajo dentro de incubadoras de insectos comercialmente disponibles pequeñas o medianas. Etapas de desarrollo posteriores de Tribolium (larvas después de aproximadamente el cuarto instar, pupas y adultos) se separan fácilmente del medio de crecimiento por tamizado. embriones sincronizados se obtienen mediante la incubación de los adultos, por períodos cortos en medio de puesta de huevos. Para el desarrollo rápido, culturas escarabajo se mantienen a 32 ° C (alrededor de cuatro semanas por generación), mientras se mantiene de stock se realiza típicamente a 22-25 ° C (aproximadamente diez semanas por generación). En la última década, muchos tec normahniques se han ido adaptando y optimizado para Tribolium, que se resumen en los libros Emergentes organismos modelo 32. De gran importancia son avanzados métodos genéticos tales como embrionario 33, larval 34, 35 o parental 36, 37 de ARN basado en la interferencia desmontables gen, la transformación de la línea germinal, ya sea con la piggyBac 38, 39 o el sistema de transposasa de Minos 40 y CRISPR / genoma basado en Cas9 ingeniería 41. Además, el genoma Tribolium ha sido secuenciado hace aproximadamente una década 42, y ahora está en la tercera ronda del genoma conjunto de liberación 43, que permite la identificación eficiente y de todo el genoma y el análisis sistemático de los genes 44 </sarriba&gt; u otros elementos genéticos 45, 46. Además, los genomas de otras cuatro especies de coleópteros están disponibles para los enfoques genéticos comparativos 47, 48, 49, 50. En asociación con el genoma secuenciado, dos análisis genéticos a gran escala se han realizado, es decir, una pantalla de mutagénesis de inserción 51 y una pantalla gen desmontables basado en la interferencia de ARN sistemática 52, 53. Fluorescencia de imágenes en vivo con campo amplio, confocal o microscopía basada en la lámina de luz (LSFM) permite observar la morfología embrionaria de Tribolium como una función del tiempo (es decir, la morfogénesis) en un contexto multi-dimensional (Tabla 1). En campo amplio y fluorescencia confocal de microscopía, la Excitación y la emisión de luz se guía a través de la misma lente objetivo. En ambos enfoques, la muestra entera se ilumina para cada plano de dos dimensiones grabado. Por lo tanto, las muestras se someten a niveles muy altos de energía. En LSFM, sólo los fluoróforos en el plano focal se excitan debido a un desacoplamiento de la iluminación y la detección mediante el uso de dos lentes de objetivo perpendicularmente dispuestas (Figura 1). LSFM viene en dos implementaciones canónicas - el plano único de iluminación de microscopio (SPIM) y el microscopio de fluorescencia basada en la lámina de luz láser escaneado digital (DSLM, la Figura 2) - y ofrece varias ventajas cruciales sobre los enfoques tradicionales: (i) capacidad de seccionamiento óptico intrínseco, (ii) resolución buena axial, (iii) fuertemente reducido nivel de foto-blanqueo, (iv) muy bajo foto-toxicidad, (v) alta relación señal-ruido, (vi) relativamente alta velocidad de adquisición, (vii) de formación de imágenes a lo largo de múltiples direcciones y (viii) la penetración de tejido más profundo debido a la utilización de apertura numérica iluminación baja lentes de objetivo 54, 55, 56. LSFM ya se ha aplicado con éxito en Tribolium para documentar casi toda la morfogénesis embrionaria 57 y para analizar los principios de la ruptura de la membrana extra-embrionario al inicio del cierre dorsal 23. Para aumentar el atractivo de LSFM en la comunidad Tribolium y para la ciencia de insectos en general, es de gran importancia para establecer procedimientos normalizados de trabajo y para mejorar los métodos, protocolos y el conjunto de recursos a un nivel en el microscopio se convierte en una facilidad de -use herramienta estándar en los laboratorios de biología del desarrollo, y las cuestiones biológicas permanecen en el centro de atención. Este protocolo comienza con los fundamentos de Tribolium &lt;/ em&gt; cultivo, es decir, el mantenimiento, la reproducción y la recolección de los embriones. A continuación, se ilustran dos estrategias experimentales: (i) de formación de imágenes en vivo de las líneas transgénicas a medida y (ii) de formación de imágenes de embriones fijos que se tiñeron con colorantes fluorescentes (Tabla 2). Posteriormente, tres técnicas de montaje con ligeramente diferentes propósitos se explican en detalle (Figura 3 y en la Tabla 3): (i) la columna de agarosa, (ii) el hemisferio agarosa y (iii) el nuevo soporte de tela de araña. El protocolo a continuación se explica el procedimiento de adquisición de datos con LSFM. modalidades de imagen y consideraciones clave se describen. Por último, la recuperación de embriones se explica y se proporcionan sugerencias para el procesamiento de datos básicos. En los resultados representativos, datos de imágenes en vivo de dos novela hechos a medida y se muestran las 58 líneas transgénicas Glia-azul y los respectivos conjuntos de datos de formación de imágenes se proporcionan como un recurso descargable. Además, una imagense presentan los datos de los embriones fijos que se tiñeron con una variedad de colorantes fluorescentes. La discusión se centra en el control de calidad, las limitaciones actuales del enfoque de imágenes en vivo y la adaptación del protocolo con otras especies. El protocolo está escrito para microscopios de fluorescencia basada en la lámina de luz que están equipadas con una cámara de muestra y un mecanismo de abrazadera giratoria para los titulares estandarizados de muestra 54, 59, 60, que son típicamente elementos en forma de cilindro de metal, plástico o vidrio con un diámetro en el rango de milímetros. El protocolo también es adecuado tanto para las implementaciones canónicas, es decir, SPIM y DSLM, así como para configuraciones con dos o más brazos de iluminación y detección 61, 62, 63. Los resultados representativos muestran datos de dos canales espectrales, verde (ILlumination con un láser de 488 nm, la detección a través de un filtro de 525/50 de paso de banda) y rojo (iluminación con un láser de 561 nm, la detección a través de un filtro de 607/70 de paso de banda), pero el protocolo se puede ampliar a tres o cuatro canales espectrales.

<table><tbody><tr><td>harina de trigo integral</td><td>Demeter e.V.</td><td>1.13E+08</td><td>EE. UU.: harina de trigo integral, Reino Unido: harina de harina integral</td></tr><tr><td>405 harina de trigo</td><td>fina Demeter e.V.</td><td>1.13E+08</td><td>EE. UU.: harina de repostería, Reino Unido: harina blanda</td></tr> levadura <tr><td>seca inactiva</td><td>Flystuff / Genesee Scientific</td><td>62-106</td><td></td></tr><tr><td>Saine tamponado con fosfato (PBS), pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>hipoclorito de sodio, ~12% activo Cl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>425044-250ML</td><td>Precaución: el hipoclorito de sodio es agarosa corrosiva</td></tr><tr><td>de bajo punto de fusión</td><td>Carl Roth</td><td>6351.2</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 pocillos</td><td>Orange Scientific</td><td>4430500</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 24 pocillos</td><td>Orange Scientific</td><td>4430300</td><td></td></tr><tr><td>capilares de vidrio, internos &Oslash; 0,46 mm</td><td>Marca GmbH + Co KG</td><td>7087 09</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX</td><td>Green Thermo Fisher Scientific</td><td>57020</td><td>La preparación de la solución de tinción se explica en la Tabla 2</td></tr><tr><td>Yoduro YOYO-1</td><td>La</td> preparación de la solución de tinción de Thermo Fisher <td>Scientific Y3601</td><td>se explica en la Tabla 2</td></tr><tr><td>BOBO-3 Yoduro Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>B3586</td><td>La preparación de la solución de tinción se explica en la Tabla 2</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td>La preparación de la solución de tinción se explica en la Tabla 2</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A22283</td><td>La preparación de la solución de tinción se explica en la Tabla 2</td></tr><tr><td>tamiz, 800 y micro; m tamaño de malla</td><td>VWR International</td><td>200.025.222-051</td><td></td></tr><tr><td>tamiz, 710 y micro; m tamaño de malla</td><td>VWR International</td><td>200.025.222-050</td><td>para la preparación del medio de crecimiento (paso 1.1)</td></tr><tr><td>tamiz, 300 y micro; m tamaño de malla</td><td>VWR International</td><td>200.025.222-040</td><td></td></tr><tr><td>tamiz, 250 y micro; m tamaño de malla</td><td>VWR International</td><td>200.025.222-038</td><td>para la preparación del medio de puesta de huevos (paso 1.2)</td></tr><tr><td>plato de vidrio, &Oslash; 100 mm &veces; 20 mm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS70165102</td><td></td></tr><tr><td>colador de celdas, 100 &micro; m tamaño de malla</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>pincel, cabeza y Oslash; 2 mm</td><td>Jeringa VWR International</td><td>149-2121</td><td></td></tr><tr><td>, 1,0 mL</td><td>B. Braun Medical AG</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>viales de centelleo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1152-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehído (PFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127</td><td>Precaución: el paraformaldehído es tóxico y corrosivo</td></tr><tr><td>N-heptano &GE; 99%</td><td>Carl Roth</td><td>8654.1</td><td>Precaución: el n-heptano es inflamable y tóxico</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td>Precaución: Trition X-100 es corrosivo</td></tr></tbody></table>

microscopía de fluorescencia de vida o fijadas y teñidas a base de hoja de luz<em&gt; tribolium castaneum</em&gt; los embriones

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

El escarabajo rojo de la harina Tribolium castaneum se ha convertido en un importante organismo modelo de insectos en la genética del desarrollo y la biología del desarrollo evolutivo. La observación de embriones Tribolium con microscopía de fluorescencia basada en la lámina de luz tiene múltiples ventajas sobre widefield convencional y microscopía de fluorescencia confocal. Debido a las propiedades únicas de un microscopio a base de lámina de luz, imágenes en tres dimensiones de los especímenes vivos se pueden grabar con altas relaciones de señal a ruido y redujeron significativamente foto-blanqueo, así como foto-toxicidad a lo largo de múltiples direcciones durante períodos que duran varios días. Con más de cuatro años de desarrollo metodológico y un aumento continuo de datos, el tiempo parece conveniente establecer procedimientos operativos estándar para el uso de la tecnología de lámina de luz en la comunidad Tribolium, así como en la comunidad de insectos en general. Este protocolo describe tres técnicas de montaje adecuadas fo diferentes propósitos, presenta dos nuevas líneas Tribolium transgénicos medida apropiada para imágenes en vivo a largo plazo, sugiere cinco colorantes fluorescentes para etiquetar las estructuras intracelulares de embriones fijos y proporciona información acerca de post-procesamiento de datos para la evaluación oportuna de los datos registrados. Los resultados representativos se concentran en imágenes en vivo a largo plazo, seccionamiento óptico y la observación del mismo embrión a lo largo de múltiples direcciones. Los respectivos conjuntos de datos se proporcionan como un recurso descargable. Por último, el protocolo analiza los controles de calidad para los ensayos de formación de imágenes en vivo, las limitaciones actuales y la aplicabilidad de los procedimientos que se indican a otras especies de insectos. Este protocolo está destinado principalmente a los biólogos del desarrollo que buscan soluciones de imágenes que superan a equipo de laboratorio estándar. Promueve el intento continuo para cerrar la brecha entre los laboratorios / comunidades técnicamente orientada, que se desarrollan y refinan microscopiar metodológicamente, y los laboratorios de ciencias de la vida / comunidades, que requieren soluciones &#39;plug-and-play&#39; a los desafíos técnicos. Además, es compatible con un enfoque axiomático que mueve las cuestiones biológicas en el centro de atención.

Este protocolo describe un marco experimental para formación de imágenes de fluorescencia de vida o embriones fijados y teñidos Tribolium con LSFM. Debido a los bajos niveles de foto-blanqueador y foto-toxicidad, una consecuencia directa de su capacidad de seccionamiento óptico, LSFM es particularmente muy adecuado para imágenes en vivo a largo plazo. La novela AGOC {ATub&#39;H2B-mEmerald} # 1 línea transgénica expres...

Imágenes de la morfogénesis de los embriones de insectos con microscopía de fluorescencia basada en la hoja de luz se ha convertido en estado de la técnica. Este protocolo describe y compara tres técnicas de montaje adecuadas para los embriones Tribolium castaneum, introduce dos nuevos líneas transgénicas medida muy adecuado para imágenes en vivo, discute los controles de calidad esenciales e indica limitaciones experimentales actuales.

Microscopía de fluorescencia de vida o fijadas y teñidas a base de hoja de luz<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Los embriones

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

El objetivo general de este protocolo es observar de forma no invasiva el desarrollo de embriones de Tribolium castaneum durante períodos de tiempo muy prolongados. La microscopía de hoja de luz basada en fluorescencia ayuda a responder preguntas relacionadas con la morfogénesis en el organismo modelo emergente de insectos Tribolium castaneum, abordando patrones de migración y proliferación celular desde el blastodermo temprano hasta el inicio del movimiento muscular. La principal ventaja de este método es que factores críticos como el fotoblanqueo y la fototoxicidad se mantienen al mínimo, incluso cuando los embriones se observan durante varios días.Para montar un embrión en la cámara de muestra utilizando una columna de agarosa, primero llene una jeringa de un milímetro con agua destilada y use una manguera pequeña de goma para conectar la jeringa a una capilar de vidrio. Llene la capilar hasta la mitad con agua destilada, luego use un pincel para transferir un embrión al interior de la abertura de la capilar de vidrio, e introduzca la capilar lentamente en la agarosa líquida, aspirando unos pocos microlitros de agarosa junto con el embrión hacia el interior de la capilar. Cuando

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Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Hemocitos Drosophila se dispersan sobre la totalidad del embrión en desarrollo. Este protocolo demuestra cómo montar y la imagen de estas migraciones el uso de embriones con hemocitos marcados con fluorescencia.

Imágenes en directo de Drosophila melanogaster Migraciones hemocitos embrionarias

Este artículo describe la preparación de muestras para la microscopía de fluorescencia de lámina de luz. También demuestra un método para montar embriones vivos de pez cebra para la obtención de imágenes a largo plazo, que permite la grabación de películas de largo lapso de tiempo de embriones vivos en condiciones casi fisiológicas.

Preparación de muestras de microscopía de lámina ligera: montaje de embriones vivos de pez cebra para la obtención de imágenes a largo plazo

Source: &lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/57546/visualization-of-motor-axon-navigation-and-quantification-of-axon-arborization-in-mouse-embryos-using-light-sheet-fluorescence-microscopy'&gt;Liau, E. S. et al. Visualización de la navegación de axones motores y cuantificación de la arborización de axones en embriones de ratón mediante microscopía de fluorescencia de lámina de luz. J. Vis. Exp. (2018). Este video demuestra el uso de la microscopía de fluorescencia de...

Visualización de proyecciones de neuronas motoras y ramificación de axones mediante microscopía de fluorescencia de lámina de luz

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Configuración de un microscopio de luz Hoja simple para<em&gt; En Toto</em&gt; Imágenes de<em&gt; C. elegans</em&gt; Desarrollo

La microscopía de fluorescencia de lámina de luz es una excelente herramienta para obtener imágenes del desarrollo embrionario. Permite la grabación de vídeos de largo lapso de tiempo de embriones vivos en condiciones casi fisiológicas. Demostramos su aplicación para obtener imágenes del desarrollo del ojo del pez cebra a través de amplias escalas espacio-temporales y presentamos una línea para la fusión y deconvolución de conjuntos de datos multivista.

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Hoja de luz fluorescencia microscopía para el estudio del corazón murino

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