Microscopía de fluorescencia de vida o fijadas y teñidas a base de hoja de luz Tribolium castaneum Los embriones

El objetivo general de este protocolo es observar el desarrollo de embriones de Tribolium castaneum de forma no invasiva durante períodos de tiempo muy largos. La microscopía de fluorescencia basada en láminas de luz ayuda a responder a las preguntas relacionadas con la morfogénesis en el organismo modelo de insecto emergente Tribolium castaneum, abordando los patrones de migración y proliferación celular desde el blastodermo temprano hasta el inicio del movimiento muscular. La principal ventaja de este método es que los factores críticos, como el fotoblanqueo y la fototoxicidad, se mantienen al mínimo, incluso cuando los embriones se observan durante varios días.

Para montar un embrión en la cámara de muestras usando una columna de agarosa, primero llene una jeringa de un milímetro con agua destilada y use una pequeña manguera de goma para conectar la jeringa a un capilar de vidrio. Llene el capilar hasta la mitad con agua destilada, luego use un pincel para transferir un embrión al lado interno de la abertura capilar de vidrio y pegue el capilar en la agarosa líquida dibujando lentamente unos pocos microlitros de agarosa junto con el embrión en el capilar. Cuando el embrión está en su lugar, debe haber unos pocos microlitros de agarosa tanto por encima como por debajo del embrión.

Cuando la agarosa se haya solidificado, acorte el capilar a una longitud de unos cinco milímetros. El fragmento restante debe estar completamente lleno de agarosa y el embrión debe encontrarse dentro del segundo cuartil. A continuación, inserte el cilindro de acero con el alfiler en la cámara de muestra y pegue el fragmento capilar encima del alfiler, la columna de agarosa debe sobresalir unos milímetros de la región del fragmento capilar que contiene el embrión.

Para montar el embrión en la cámara de muestras usando un hemisferio de agarosa, primero extraiga 200 microlitros de agarosa líquida en una jeringa de un milímetro y use la jeringa para llenar el tubo de acero con la cámara de muestra con agarosa desde la parte superior del tubo hasta que se forme un hemisferio en la abertura inferior. Cuando la agarosa se haya solidificado, tome un embrión con la punta de un pincel y reorganice el embrión para que el extremo anterior sea accesible. Sumerja el hemisferio de agarosa en agarosa líquida para cubrir el hemisferio con una película delgada y coloque el embrión con su extremo anterior en posición vertical en el polo del hemisferio de agarosa.

Gire el tubo de acero y use el cepillo para corregir la posición del embrión según sea necesario. Lo ideal es que menos de la mitad de la superficie del embrión esté cubierta de agarosa y que los flancos sean lo más empinados posible. Demasiada agarosa en la superficie del embrión conduce a una constricción mecánica y a una reducción del intercambio de gases e iones, lo que tiene un efecto dramático en la tasa de supervivencia del embrión.

A continuación, inserte lentamente el tubo de acero en la cámara de muestras. Para montar el embrión en la cámara de muestras con un soporte de telaraña, primero seleccione un embrión con el pincel y deje el pincel a un lado. A continuación, cubra el orificio ranurado del soporte de telaraña con cinco a ocho microlitros de agarosa líquida y luego retire la mayor parte de la agarosa hasta que solo quede una película delgada de agarosa.

Coloque el embrión sobre la película de agarosa y ajuste su posición con cuidado, moviendo el embrión al centro del eje x del orificio ranurado y alineando su eje anterior posterior alargado con el eje alargado del orificio ranurado. Asegúrese de colocar el embrión sobre la película de agarosa dentro de los 10-15 segundos posteriores a su aplicación, es decir, mientras la agarosa aún está líquida o de lo contrario no se adherirá correctamente. A continuación, inserte lentamente el soporte de telaraña en la cámara de muestras, colocando el soporte de modo que no interfiera con la luz de excitación y emisión.

Para los ensayos de imágenes en vivo, primero configure el lapso de tiempo, luego, en el modo de luz de transmisión, coloque el embrión a lo largo de los ejes X e Y en el centro del campo de visión sin exponer el embrión al láser. Gire el embrión 360 grados en pasos de 90 grados para examinar el tejido en busca de cualquier daño que pueda haber ocurrido durante el proceso de montaje. En el modo de florescencia, defina la pila Z para cada dirección, agregando un tampón espacial de 25 a 50 micrómetros delante y detrás del embrión, y defina el espaciado Z.

Para la obtención de imágenes a largo plazo, asegúrese de que la cámara de muestras esté llena de suficiente tampón de imágenes y cubra la abertura de la cámara de muestras. A continuación, inicie el proceso de obtención de imágenes, supervisando la correcta adquisición en todas las direcciones en todos los canales de todos los embriones. Al final del período de imagen, retire el soporte de la muestra de la cámara de muestras y transfiera el embrión a un portaobjetos.

Si se utilizó una columna de agarosa, use una cuchilla afilada para extraer los embriones de la agarosa circundante. Si se utilizó una semiesfera de agarosa, transfiera la semiesfera con un lado plano a la corredera del objeto. Para el método del soporte de telarañas, use un pincel para desmontar suavemente el embrión de la película de agarosa.

A continuación, incubar el objeto cargado de embriones en un pequeño plato de vidrio en una atmósfera de humedad saturada en condiciones estándar hasta que las larvas eclosionen. Para procesar los datos del embrión observado, abra los archivos de interés en el software de análisis de imágenes adecuado y gire las pilas Z para alinear el eje anteroposterior del embrión con el eje Y, según sea necesario. Recorte las pilas Z a lo largo de los ejes X e Y para que solo quede un fondo mínimo, luego calcule la proyección máxima Z para cada pila Z.

Luego, dependiendo de la línea transgénica y las modalidades de imagen, realice los ajustes de intensidad dinámica apropiados de las pilas de tiempo para corregir cualquier fotoblanqueo o flora para las fluctuaciones de expresión, según sea necesario. Utilizando una línea transgénica que expresa una proteína de fusión Histona 2B M-Emerald bajo el control del promotor de alfa-tubublina, se registraron 66 horas de desarrollo embrionario a temperatura ambiente, desde la retracción de la banda germinal hasta el cierre dorsal. Esta línea de trampa potenciadora se puede utilizar para visualizar grupos neuronales dentro de los apéndices de la cabeza y la dinámica de la migración de la cirrosa durante el cierre dorsal.

Al obtener la imagen de una línea transgénica similar que porta el mismo transgén pero en una ubicación genómica diferente, las secciones ópticas de la transición de la gastrulación a la elongación de la banda germinal muestran la disposición celular interna de la banda germinal emergente. Utilizando la línea transgénica glia-blue, la adquisición de Z-Stacks a lo largo de múltiples direcciones a través de la rotación de la muestra permite la observación de la reorganización de las células gliales a lo largo y alrededor del cordón nervioso ventral, así como su dinámica de proliferación del lado dorsal de los lóbulos de la cabeza en el mismo embrión. Los pequeños tintes fluorescentes también se pueden utilizar para el etiquetado específico de las estructuras intercelulares para resaltar ciertas características embrionarias como la cirrosis gar, las células de cirrosis ventral posterior o la tricapa de tejido de banda germinal de serosa amnios que emerge durante el cierre de la ventana de serosa.

La tinción con tinte fluorescente de doble color permite una mayor visualización de dos estructuras intercelulares en el mismo embrión. Por ejemplo, el citoesqueleto de actina y la envoltura nuclear. Una vez finalizada la grabación, es importante para el control de calidad del experimento recuperar los embriones y criarlos hasta convertirlos en adultos sanos y fértiles.

Este procedimiento se puede combinar con otras técnicas como la Diferencia de ARN Parental para analizar fenotipos derribados.