Aprovechamiento del fenotipo de población lateral desencadenado por tinte de ADN para detectar y purificar células madre de cáncer a partir de muestras biológicas

El objetivo general de este procedimiento es detectar poblaciones de células madre cancerosas putativas en muestras biológicas, basándose en la capacidad de extrusión de colorante de las células de la población lateral. Este método aborda una pregunta clave en la investigación de células madre cancerosas sobre medios confiables para la detección y purificación de células madre cancerosas a partir de muestras biológicas. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza marcadores funcionales, proporcionando así una mejor resolución.

Además, la expresión de estos transportadores de fármacos ABC está altamente conservada entre las células madre cancerosas, por lo que podemos utilizar esta técnica para muchas entidades cancerosas diferentes. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el descubrimiento de terapéuticos contra las células madre cancerosas, ya que facilita análisis posteriores, como el perfilado de expresión génica y la validación de dianas, en células cancerosas altamente purificadas. Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre las características de las células madre cancerosas.

También podemos utilizar este método para caracterizar sistemas que comprenden poblaciones expresoras de transportadores de fármacos ABC, como la médula ósea. Quien demostrará el procedimiento será Elisabeth Hoflehner, una técnica de mi laboratorio. Para comenzar, cultive la línea celular de cáncer humano deseada a 37 grados celsius en 10 a 30 mililitros de medio RPMI 1640 suplementado con 10% FBS, L-glutamina 2 milimolar y antibióticos.

Cuando las células alcancen aproximadamente entre el 70 y el 90 % de confluencia, retire el medio y agregue dos mililitros de tripsina-EDTA al 0,05 % para separar las células de la superficie del recipiente de cultivo. A continuación, lave las células con 10 mililitros de medio de cultivo, transfiera la suspensión a un tubo limpio de 15 mililitros y centrifugue a 250 ×g a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Una vez que las células hayan formado el botón, deseche el sobrenadante y resuspenda el botón en un mililitro de medio de cultivo.

Mezcle una pequeña alícuota de la suspensión celular con la solución de azul de tripano y cuente las células utilizando un hemocitómetro. Para preparar las muestras de prueba, suspenda las células en medio de cultivo fresco para obtener una suspensión celular de un tiempo diez a la seis células por mililitro. Después de ajustar la densidad celular, transfiera tres mililitros de la muestra a un tubo cónico de 15 mililitros etiquetado como prueba.

Luego, agregue 10 micromolar de colorante violeta a la muestra y vortexe suavemente la suspensión. A continuación, prepare controles de inhibición transfiriendo 500 microlitros de la suspensión celular que contiene el colorante a dos tubos de citometría de flujo etiquetados como control. Agregue 50 micromolar de verapamilo al primero.

Y 20 micromolar de Fumitremorgin C al segundo tubo. Y mezcle las soluciones pipeteando suavemente. Tape todos los tubos y colóquelos a incubar a 37 grados celsius en la oscuridad durante 90 minutos.

Agite suavemente las muestras cada 15 minutos. Una vez finalizada la tinción, lave los controles de inhibición con tres a cuatro mililitros de PBS frío con hielo. Y prepare alícuotas de la muestra de prueba para la costinción subsiguiente con anticuerpos.

Lave también estas alícuotas y filtre todas las muestras a través de tamices con corte de 70 micrones para eliminar posibles agregados celulares. Luego, centrifugue las suspensiones a 250 × g a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Después de resuspender el precipitado resultante en 100 µL de PBS, mantenga las células en hielo protegidas de la luz.

A continuación, agregue un panel adecuado de anticuerpos conjugados con fluorocromos a las células previamente teñidas con el colorante violeta. Vortexee las suspensiones e incúbelas a cuatro grados celsius en la oscuridad durante 20 a 30 minutos. Tras la incubación, lave las células con tres a cuatro mililitros de PBS frío con hielo y filtre la muestra si se desea.

Y luego centrifugue a 250 × g a cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Descarte el sobrenadante y resuspenda las células sedimentadas en 100 µL de PBS. Finalmente, agregue 7-AAD a las células previamente marcadas con colorante violeta.

Y incubar las muestras durante cinco a 10 minutos en la oscuridad. Para analizar las células utilizando el citómetro de flujo, seleccionar una población celular apropiada en un gráfico de puntos FSC SSC. Luego, utilizando diferentes señales de FSC, excluir de la población seleccionada todos los agregados celulares.

Excluya las células que presentan tinción positiva con 7-AAD para obtener la población de células viables. Para crear un gráfico de dispersión para la emisión de colorantes azul y rojo, muestre el canal fluorescente azul en el eje y y el canal fluorescente rojo en el eje x. Cambie ambos canales al modo lineal y ajuste el voltaje del detector en consecuencia para que la población lateral se ubique en la parte inferior izquierda del gráfico.

Luego, seleccione la población lateral. Y detenga la adquisición. A continuación, cargue los controles de inhibición y adquiera los datos.

Finalmente, cree un gráfico de puntos que muestre la fluorescencia roja del colorante violeta en el eje x y un canal de fluorescencia apropiado en el eje y, representado en modo logarítmico. Cargue la muestra, ajuste los voltajes del detector en consecuencia e identifique la fracción de células de la población lateral que expresan la superficie investigada. Luego, registre los datos.

Se presentan aquí resultados representativos del análisis de la población lateral realizada en células de cáncer ovárico humano. La población lateral distinguida mediante el análisis de la emisión azul y rojo-violeta se identificó en el cuadrante inferior izquierdo del diagrama de dispersión y representó el 0,70 % de la población total analizada. La posterior utilización de inhibidores de la bomba de eflujo provocó la desaparición de la señal de fluorescencia observada en las células previamente identificadas, confirmando su fenotipo de población lateral.

Finalmente, las células ováricas humanas también se caracterizaron en cuanto a la expresión de ABCG2. Se observó tinción positiva para ABCG2 en el 0,67 % de las células correspondientes a la población lateral identificada. Una vez dominado, este procedimiento puede realizarse en aproximadamente de dos a tres horas si se lleva a cabo correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el fenotipo de la población lateral depende estrictamente de una relación óptima entre la concentración del colorante y la densidad celular. Por lo tanto, se recomienda encarecidamente optimizar ambas variables antes del experimento. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el perfilado de la expresión génica para caracterizar aún más las células de la población lateral y así identificar nuevos objetivos específicos de células madre cancerosas para el desarrollo futuro de fármacos.

Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología de células madre exploraran las características de las células madre tisulares y de las células madre cancerosas, tanto en ratones como en humanos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión sobre cómo realizar el ensayo de población lateral inducido por colorante violeta y cómo detectar células madre cancerosas putativas en muestras biológicas en su propio laboratorio. No olvide que trabajar con muestras biológicas puede ser extremadamente peligroso y que se deben tomar precauciones, como el uso de EPP y cabinas de seguridad biológica, al realizar este procedimiento.