Aprovechamiento del fenotipo de población lateral desencadenado por tinte de ADN para detectar y purificar células madre de cáncer a partir de muestras biológicas

El objetivo general de este procedimiento es detectar poblaciones putativas de células madre cancerosas en muestras biológicas en función de la capacidad de extrusión de colorante de las células de la población lateral. Este método aborda una pregunta clave en la investigación de células madre cancerosas con respecto a los medios confiables para la detección y purificación de células madre cancerosas a partir de muestras biológicas. La principal ventaja de esta técnica es que despliega marcadores funcionales y, por lo tanto, proporciona una mejor resolución.

Además, la expresión de estos transportadores de fármacos ABC está muy conservada entre las células madre cancerosas y, por lo tanto, podemos utilizar esta técnica para muchas entidades cancerosas diferentes. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el descubrimiento de terapias contra el cáncer con células madre, ya que facilita el análisis posterior, como el perfil de expresión génica y la validación de objetivos en células cancerosas altamente purificadas. Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre las características de las células madre cancerosas.

También podemos utilizar este método para caracterizar como un sistema que comprende transportadores de fármacos ABC que expresan poblaciones como la médula ósea. Elisabeth Hoflehner, una técnica de mi laboratorio, demostrará el procedimiento. Para comenzar, cultive la línea celular de cáncer humano deseada a 37 grados centígrados en 10 a 30 mililitros de medio RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS, dos milímetros de L-glutamina y antibióticos.

Cuando las células alcancen aproximadamente el 70 al 90% de confluencia, retire el medio y agregue dos mililitros de tripsina-EDTA al 0,05% para separar las células de la superficie de la placa de cultivo. Luego, lave las células con 10 mililitros de medio de cultivo, transfiera la suspensión a un tubo limpio de 15 mililitros y gírelo a 250 veces G a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Una vez que las células estén granuladas, deseche el suprendante y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de medio de cultivo.

Mezcle una pequeña alícuota de la suspensión celular con una solución de azul de tripán y cuente las células con un hemocitómetro. Para preparar muestras de prueba, suspenda las células en un medio de cultivo fresco para obtener una suspensión celular de una vez diez a seis células por mililitro. Después de ajustar la densidad de la celda, transfiera tres mililitros de la muestra a un tubo de fondo redondo de 15 mililitros etiquetado como prueba.

A continuación, añade 10 micromolares de tinte violeta a la muestra y vórtice suavemente la suspensión. A continuación, prepare los controles de inhibición transfiriendo 500 microlitros del colorante que contiene la suspensión celular a dos tubos de citometría de flujo etiquetados como control. Añade 50 micromolares de verapamilo al primero.

Y 20 micromolares de Fumitremorgin C al segundo tubo. Y mezcle las soluciones pipeteando suavemente. Cubra todos los tubos con tapas e incube a 37 grados centígrados en la oscuridad durante 90 minutos.

Agite suavemente las muestras cada 15 minutos. Una vez completada la tinción, lave los controles de inhibición en tres o cuatro mililitros de PBS helado. Y preparar alícuotas de la muestra de prueba para su posterior administración de anticuerpos.

Lave también estas alícuotas y filtre todas las muestras a través de filtros cortados de 70 micras para eliminar posibles agregados celulares. Y luego centrifugar las suspensiones a 250 veces G a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Después de resuspender el pellet resultante en 100 microlitros de PBS, mantenga las células en hielo protegidas de la luz.

A continuación, añada un panel adecuado de anticuerpos conjugados con flurocromo a las células previamente teñidas con colorante violeta. Agite las suspensiones e incube a cuatro grados centígrados en la oscuridad durante 20 a 30 minutos. Después de la incubación, lave las células en tres o cuatro mililitros de PBS helado, filtre la muestra si lo desea.

Y luego centrifugar a 250 veces G a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células peletizadas en 100 microlitros de PBS. Por último, añadir 7-AAD a las células previamente teñidas con tinte violeta.

E incubar las muestras durante cinco a 10 minutos en la oscuridad. Para analizar las células utilizando el citómetro de flujo, dirija una población de células adecuada en un diagrama de puntos FSC SSC. A continuación, utilizando diferentes señales FSC, excluya de la población seleccionada todos los agregados de células.

Excluya las células que revelen una tinción positiva de 7-AAD para obtener la población de células viables. Para crear un diagrama de puntos para la emisión de tintes azules y rojos, muestre el canal fluorescente azul en el eje Y y el canal fluorescente rojo en el eje X. Cambie ambos canales al modo lineal y ajuste el voltaje del detector en consecuencia para que la población lateral se encuentre en la parte inferior izquierda del gráfico.

A continuación, bloquea la población lateral. Y detener la adquisición. A continuación, cargue los controles de inhibición y adquiera los datos.

Finalmente, cree un diagrama de puntos que muestre la florescencia roja del tinte violeta en el eje x y un canal de florescencia apropiado en el eje y trazado en modo logarítmico. Cargue la muestra, luego ajuste los voltajes del detector en consecuencia e identifique la facción de las celdas de población lateral que expresan la superficie investigada. A continuación, registre los datos.

Aquí se presentan resultados representativos del análisis de poblaciones laterales realizado en células de cáncer de ovario humano. La población lateral distinguida por el análisis de emisión azul y rojo-violeta se identificó en el cuadrante inferior izquierdo del diagrama de puntos y constituyó el 0,70% de toda la población analizada. El uso posterior de inhibidores de eflujo resultó en la desaparición de la señal de florescencia observada para las células previamente identificadas, lo que confirma su fenotipo de población lateral.

Por último, las células ováricas humanas también se caracterizaron en términos de expresión de ABCG2. Se observó tinción positiva de ABCG2 en el 0,67% de las células correspondientes a la población lateral identificada. Una vez dominado, este procedimiento se puede realizar en aproximadamente dos o tres horas si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el fenotipo de la población lateral depende estrictamente de una relación óptima entre la concentración de colorante y la densidad celular. Por lo tanto, se recomienda encarecidamente la hidratación de ambas variables antes del experimento. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el perfil de expresión génica, para caracterizar aún más las células de la población lateral y, por lo tanto, identificar nuevos objetivos específicos de células madre cancerosas para el desarrollo futuro de fármacos.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología de las células madre exploraran las características de las células madre de tejidos y las células madre cancerosas, tanto en ratones como en hombres. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar la SA de población lateral desencadenada por tinte violeta y cómo detectar células madre cancerosas putativas en muestras biológicas en su propio laboratorio. No olvide que trabajar con muestras biológicas puede ser extremadamente peligroso y que se deben tomar precauciones como el uso de EPI y cabinas de seguridad biológica al trabajar con este procedimiento.