Name: Evaluación del flujo autofágico midiendo la co-localización de LC3, p62 y LAMP1 usando citometría de flujo de imágenes multiespectrales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Aprende a cuantificar la co-localización de LC3, p62 y LAMP1 mediante citometría de flujo de imágenes multiespectrales en células Jurkat. Este método objetivo y robusto mejora la evaluación del flujo autofágico.

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Me gustaría dar las gracias a mis compañeros de trabajo en MilliporeSigma, Philip J. Morrissey y Sherree L. Friend, por su apoyo y orientación a lo largo de los años. También quiero dar las gracias a Vidya Venkatachalam y Bryan R. Davidson por su ayuda con la función BDC3 en el software IDEAS , Ryan P. Jessup para ayudar a la edición de este manuscrito, Raymond Kong para ayudar en el día de rodaje, y un agradecimiento especial A la artista de maquillaje Cynthia Xamonthiene.

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</ol>

Soy empleado de MilliporeSigma, el fabricante de la marca Amnis ImageStream, que se utilizó en este estudio.

Al realizar este análisis, hay algunas cosas a considerar. Es importante tener muestras de control apropiadas. Para este experimento, se utilizaron dos controles diferentes: Control y Control + Cloroquina. La muestra de control se utilizó para establecer el umbral para las regiones. Representa el nivel basal de autofagia sin detener la degradación lisosomal y es el control de la muestra Starved. Sin embargo, la muestra Control no es un control apropiado para comparar con los resultados de la muestra de Starved + Cloroquina porque la propia cloroquina influye en la muestra de control. Por lo tanto, fue necesario tener una muestra Control + Cloroquina. Antes de realizar cualquier análisis para la autofagia, es importante analizar / gate solo en las células individuales que están en foco ( es decir, gradiente RMS mayor de 60), ya que los resultados podrían verse afectados si hay más de una célula o las imágenes son fuera de foco. Es crucial que el autofagosomaEs y los lisosomas están en foco para el recuento apropiado del punto y el análisis de BDC3. Las células apoptóticas deben ser removidas antes del análisis de autofagia, ya que pueden sesgar los resultados y no deben ser incluidas. Debe haber tinción apropiada para los tres marcadores ( es decir, LC3, p62 y LAMP1). Por ejemplo, los tres marcadores son intracelulares y deben tener una señal punteada; Si la señal no es punteada, o si está en la superficie de la célula, la tinción no sería apropiada y el experimento / tinción debe ser rehecho. Además, para que la BDC3 sea precisa, es esencial que las células de las celdas que son brillantes para los tres marcadores fluorescentes de interés. Para evitar la medición de BDC3 en la fijación no específica, los artefactos de formación de imágenes y / o el ruido es necesario disponer de eventos positivos. Esto es crucial, ya que BDC3 potencialmente puede amplificar artefactos que no son señales verdaderas. Debido a que BDC3 sólo puede realizarse en eventos positivos brillantes, muchas células pueden no ser incluidas en el análisis final; Esto es especRealmente es cierto para las células de control que no tienen acumulación de LC3, p62 y / o LAMP1. Por lo tanto, una limitación de este ensayo es que BDC3 sólo examina las células que son positivas para los tres marcadores, que podría no ser apropiado para todos los experimentos de autofagia. Al igual que BDS, que se ha informado previamente 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , BDC3 solo no tiene en cuenta el número de organelas de autofagia que se co-localizan, dando lugar en gran medida De variabilidad en el número de autofagosomas. Por lo tanto, el enfoque bivariado presentado por Rajan et al. fue empleado. En cuanto a las parcelas bivariadas, uno podría preguntar siLas células deben ser positivas para LC3, p62 y LAMP1; ¿Por qué hay tantas células que tienen 0 puntos? Esto se debe a que la señal LC3 puede ser lo suficientemente brillante para la co-localización, pero puede no satisfacer el umbral establecido por la máscara de pico (Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) lugar. El protocolo presentado aquí utiliza MIFC para contar LC3 puncta y la co-localización de tres marcadores de autofagia para medir el flujo autofágico. Bajo condiciones basales (muestra de control), el número de autofagosomas era bajo, y pocas células se encontraron con &quot;High Spots&quot;. Con la adición de cloroquina, que inhibe la fusión de autofagosomas / lisosomas, hubo un aumento en el número de manchas de LC3. Dado que el lisosoma es incapaz de romper el autofagosoma y el p62, que reside en el autofagosoma, esto conduce a un aumento en la co-localización de la LC5, p62 y LAMP1 autolysosome acumulación. Este efecto se amplificó bajo el rostro de nutrientesIon, que induce la autofagia. Sin embargo, sin la adición de cloroquina, no hubo un aumento significativo en el número de autofagosomas, muy probablemente debido a un aumento en la tasa de rotación autofágica. Cuando las células se someten a hambre en presencia de cloroquina, hubo un aumento en la co-localización y el número de autofagosomas, lo que apoya la conclusión de que la inanición aumenta el flujo autofágico. EBSS es conocido por ser un poderoso inductor de la autofagia. Por lo tanto, se espera que el aumento sea grande. Si se usa otro método, como la inducción del fármaco, para inducir la autofagia, la diferencia entre las muestras control y tratada puede ser más sutil. Este protocolo particular fue diseñado para medir la autofagia en líneas celulares humanas, pero el ensayo podría adaptarse a otras especies cambiando a anticuerpos para esa especie particular. Además, el método de análisis podría utilizarse para cualquier aplicación intracelular que requiera la co-localizaciónDe tres sondas / marcadores.

La macroautofagia, en adelante denominada autofagia, es una vía catabólica en la que los componentes dañados o disfuncionales, las proteínas de larga vida y los orgánulos se degradan a través del lisosoma y se reciclan 1 . La autofagia es un proceso dinámico de varios pasos que implica la formación de un autofagosoma; La fusión del autofagosoma con el lisosoma, formando el autolisosoma; Y la degradación de los contenidos del autolisosoma 2 . El marcador biológico crucial utilizado para identificar la autofagia en los sistemas de mamíferos es la proteína ligada a los microtúbulos 1A / 1B-cadena ligera 3 (LC3), que constituye la membrana autofagosomal. Durante la autofagia, el LC3-1 citosólico se conjuga con fosfatidiletanolamina para formar LC3-II; Entonces se incorpora LC3-II en la membrana autofagosomal 3 . Otro marcador ampliamente utilizado para el flujo autofágico es el receptor de autofagia sequestosome 1 (SQSTM1, p62) que físicamente liCarga autofágica a la membrana autofágica 4 , 5 . Métodos que se han utilizado tradicionalmente para medir la autofagia son Western blots y microscopía de fluorescencia [ 7] . Sin embargo, ninguno de estos métodos se considera el &quot;patrón oro&quot; , 2 , 6 ya que hay desafíos asociados con ambas técnicas. Western blots sólo dan un promedio porque utilizan una muestra homogeneizada, por lo que los observadores no pueden ver lo que está sucediendo en las células individuales. Por otro lado, la microscopía de fluorescencia proporciona una información del observador a nivel de célula única, pero carece de capacidades de rendimiento, lo que hace difícil obtener evaluaciones objetivas y estadísticamente rigurosas. En los últimos años, la medición de LC3 y p62 por citometría de flujo de imágenes multiespectrales (MIFC, véase la Tabla de Materiales ) ha ido ganando popularidadDebido a su poder cuantitativo, capacidades de alto rendimiento, potencial de multiplexación y capacidad de imagen de cada célula. Uno de los métodos más utilizados para medir la autofagia usando MIFC, junto con su software de análisis complementario (véase la Tabla de Materiales ), es a través del recuento puntual de LC3 puncta o autophagosomes 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Sin embargo, un aumento de autofagosomas no significa necesariamente que hay un aumento en la autofagia, ya que también podría representar un bloqueo en el proceso [ 2] . LC3-II volumen de negocios es un parámetro útil para medir el flujo autofágico mediante el análisis de las células en la presencia yAusencia de un inhibidor de degradación lisosómica, como la cloroquina. La cloroquina inhibe la fusión del autofagosoma con el lisosoma, permitiendo así la cuantificación de la formación de autofagosomas como una medida del grado de autofagia deteniendo el flujo autofágico antes de que se produzca la degradación lisosomal 18 . Además, p62 se degrada principalmente por autofagia, y si la degradación lisosomal del autofagosoma y su contenido se bloquea, se espera una acumulación de p62 17 , 19 . Autofagia es un proceso de varios pasos, y la medición de LC3 o p62 por sí sola no proporciona una imagen completa de lo que está sucediendo en las células. Publicaciones recientes han enfatizado la necesidad de examinar la formación concurrente del autolisosoma 2 , 17 , 20 , 21 . El MIFC esSingularmente capaz de medir la formación del autolisosoma mediante la imagen de la co-localización del autofagosoma al lisosoma 15 - 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 . Además, la co-localización de p62 y LC3 utilizando MIFC también se ha explorado para medir el flujo autofágico [ 5] . En el software de análisis referenciado, la &quot;característica&quot; que mide la co-localización se llama &quot;Bright Detail Similarity R3&quot; (BDS) y fue específicamente diseñada para comparar los detalles de imagen pequeños y brillantes de dos imágenes. BDS es el coeficiente de correlación log-transformado de Pearson de las manchas brillantes localizadas con un radio de 3 píxeles o menos; En otras palabras, BDS calcula el grado de oVerlapping pixels de dos canales fluorescentes diferentes. Los puntos brillantes están correlacionados ( es decir, la misma ubicación espacial) o no correlacionados ( es decir, diferentes ubicaciones espaciales). Por lo tanto, el coeficiente de correlación varía entre 0 (no correlacionado) y 1 (correlación perfecta). El coeficiente es log-transformado para aumentar el rango entre cero e infinito 26 , 27 . BDS solo puede no ser suficiente; Rajan et al. Encontró que el uso de sólo BDS podría conducir a falsos positivos o falsos resultados negativos [ 21] . BDS evalúa la co-localización de dos marcadores de autofagia, pero no considera el número de autofagosomas. Para explicar el número de autofagosomas, Rajan et al. Incluido el recuento puntual de las puntas de LC3 21 . Rajan et al. Propuesta utilizando un diagrama de dispersión bivariado de LC3 spot count versus BDS. Usando esta gráfica bivariada, dos poblaciones fueronE identificado por primera vez: uno con células que tienen un alto nivel de manchas LC3 y una con células que tienen un bajo nivel de manchas LC3. La población de puntos altos de LC3 se clasificó además en dos poblaciones: células con baja co-localización ( es decir, acumulación de autofagosomas) y células con alta co-localización ( es decir, acumulación de autolisosomas). Esta gráfica bivariada permite distinguir entre células con muy pocos autofagosomas y células con acumulación de autofagosomas y / o autolisosomas [ 21] . Hasta ahora, no era posible la co-localización simultánea de LC3, p62 y LAMP1 (marcador lisosómico) utilizando un solo &quot;Feature Type&quot; en el software de análisis de acompañamiento del MIFC (véase la Tabla de Materiales ). Sin embargo, una nueva característica, recientemente introducida en la versión 6.1, se llama Bright Detail Colocalization 3 (BDC3). BDC3 compara las imágenes de detalle brillante de cada una de las tres imágenes (en este caso, LC3, p62 y LAMP1) y cuantifica la co-localización de las tres sondas ( es decir, LC3, p62 y LAMP1). La característica BDC3 calcula el coeficiente de correlación de Pearson modificado para extenderse a tres imágenes. Como los puntos brillantes de las tres imágenes están correlacionados o no correlacionados, el coeficiente de correlación varía entre 0 (sin correlación) y 1 (correlación perfecta). El coeficiente es log-transformado para aumentar el rango dinámico entre 0 e infinito. Al cambiar la función BDS con la característica BDC3, el método de análisis presentado por Rajan et al. Ahora pueden incorporar los tres marcadores más usados ​​para medir la autofagia en un sistema al mismo tiempo. La capacidad de co-localizar estos tres marcadores de autofagia en un solo ensayo podría conducir a nuevos conocimientos sobre la inducción y regulación de la autofagia. El siguiente protocolo describe los pasos para inducir la autofagia en células Jurkat; Marcar las células con anticuerpos LC3, p62 y LAMP1; Adquirir datos en un sistema multispCitometría de flujo de imágenes ectrales; Y analizar los datos para evaluar el flujo autofágico.

<table><tbody><tr><td>Tubo de centrífuga de 15 mL</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>tubo de centrífuga de 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>AF647 etiquetado Donkey anti-Mouse - IgG&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-31571</td><td>Burro anti-ratón Anticuerpo secundario IgG (H+L), Alexa Fluor 647. Concentración 2 mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571</td></tr><tr><td>clon antihumano CD107a-PE (LAMP1)</td><td>BioLegend</td><td>328607</td><td>H4A3. Concentración 400 y micro; g/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td></tr><tr><td>clon antihumano CD45- AF488</td><td>BioLegend</td><td>304017</td><td>HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html</td></tr><tr><td>CD45- PE&nbsp; antihumano</td><td>BioLegend</td><td>304008</td><td>Clon HI30.&nbsp; http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html</td></tr><tr><td>anti-humano CD45-AF647&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>304018</td><td>Clon HI30.&nbsp; http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html</td></tr><tr><td>Anti-LC3 (Humano) clon mAb 4E12</td><td>MBL International Corporation</td><td>M152-3</td><td>Clon 4E+12.&nbsp; Concentración 2 mg/mL.&nbsp; https://www.mblintl.com/products/m152-3</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-SQSTM1 / p62 [EPR4844] - Marcador de autofagosomas (Alexa Fluor 488)</td><td>abcam</td><td>ab185015</td><td>Clon EPR4844. Concentración 0,5 mg/mL. http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html</td></tr><tr><td>Sal de difosfato de cloroquina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6628-25G</td><td></td></tr><tr><td>Limpiador - Coulter Clenz&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546931</td><td>Llene el recipiente con 200 mL de Limpiador.&nbsp; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td></tr> <tr><td>DAPI Stain 5 mg/mL</td><td>MilliporeSigma</td><td>508741</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741</td></tr><tr><td>Deburbujeador - 70% Isopropanol</td><td>MilliporeSigma</td><td>1.3704</td><td>Llene el recipiente con 200 mL de Deburbujeador.&nbsp; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco 10x</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-2010-B</td><td>&nbsp; Ca++Mg++ Libre&nbsp;</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco 1x</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>PBS Ca++Mg++ Free&nbsp;</td></tr><tr><td>Earle's Balanced Salt Solution 1x</td><td>Gibco</td><td>14155</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído, 10%, libre de metanol, Ultra Pure</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>04018</td><td>Esto es lo que se utiliza para el 4% y el 1% de formalina. PRECAUCIÓN: La formalina/formaldehído es tóxica por inhalación y si se ingiere. Irritante para los ojos, el sistema respiratorio y la piel. Puede causar sensibilización por inhalación o contacto con la piel. Riesgo de daños graves en los ojos. Riesgo potencial de cáncer.&nbsp; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td></tr> <tr><td>Solución salina equilibrada de Hanks 1x</td><td>Gibco</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat, clon E6-1 (ATCC TIB-152)</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx</td></tr><tr><td>MEM aminoácidos no esenciales 100x</td><td>HyClone</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>MIFC - ImageStreamX Mark II</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>Se utilizó una cámara ImageStreamX Mark II de 2 cámaras con láseres de 405 nm, 488 nm y 642 nm. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006</td></tr><tr><td>software de análisis MIFC - IDEAS 6.2</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>El software complementario del MIFC (ImageStreamX MKII).&nbsp; IDEAS versión 6.2</td></tr><tr><td>Software MIFC - INSPIRE</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>Este es el software que ejecuta el MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE versión 200.1.388.0</td></tr><tr><td>PE anti-humano CD107a (LAMP-1) clon de anticuerpo H4A3</td><td>BioLegend</td><td></td><td>328608 http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td></tr><tr><td>Solución de penicllina/estreptomicina/glutamina 100x</td><td>HyClone</td><td>SV30082.1</td><td></td></tr><tr><td>Enjuague - Agua ultrapura o agua desionizada</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Puede usar cualquier agua ultrapura o agua desionizada. Llene el recipiente con 900 mL de enjuague.</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medio 1x</td><td>HyClone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Funda - PBS</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>Esto es lo mismo que la solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco 1X&nbsp; Libre de Ca++MG++. Llene el recipiente con 900 mL de funda.</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de polipropileno siliconado</td><td>Fisherbrand</td><td>02-681-320</td><td>Fisherbran Tubos de microcentrífuga siliconados de baja retención 1,5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936</td></tr><tr><td>solución de piruvato de sodio (100 mM)</td><td>Esterilizador HyClone</td><td>SH30239.01</td><td></td></tr><tr><td>- 0.4 - 0.7% Hipoclorito</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td>Este es esencialmente un blanqueador de Clorox al 10% que se puede hacer diluyendo el blanqueador de Clorox con agua. Llene el recipiente con 200 ml de Sterilzer.</td></tr><tr><td>Reactivo de calibración del sistema - SpeedBead</td><td>MilliporeSigma</td><td>400041</td><td>Cada tubo contiene ~10 mL.&nbsp; https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav&nbsp;</td></tr><tr><td>Matraz T75</td><td>Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>TRITON X-100, Detergente PROTEIN GRADE, Solución al 10%, Filtro estéril</td><td>MilliporeSigma</td><td>648463-50ML</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463</td></tr><tr><td>Agua, Grado de Cultivo Celular&nbsp;</td><td>HyClone</td><td>SH30529.03</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación del flujo autofágico midiendo la co-localización de lc3, p62 y lamp1 usando citometría de flujo de imágenes multiespectrales

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

La autofagia es una vía catabólica en la que los componentes celulares normales o disfuncionales que se acumulan durante el crecimiento y la diferenciación se degradan a través del lisosoma y se reciclan. Durante la autofagia, la proteína LC3 citoplasmática se lipide y se recluta en las membranas autofagosómicas. El autofagosoma se fusiona con el lisosoma para formar el autolisosoma, donde se produce la ruptura de la vesícula autofagosoma y su contenido. La proteína p62 asociada a la ubiquitina, que se une a LC3, también se usa para monitorizar el flujo autofágico. Las células sometidas a autofagia deben demostrar la co-localización de p62, LC3 y marcadores lisosómicos. La microscopía de inmunofluorescencia se ha utilizado para identificar visualmente LC3 puncta, p62, y / o lisosomas sobre una base por célula. Sin embargo, una evaluación objetiva y estadísticamente rigurosa puede ser difícil de obtener. Para superar estos problemas, se utilizó citometría de flujo de imágenes multiespectrales junto con una característica analítica que comparaCola de tres marcadores de autofagia (LC3, p62 y lysosomal LAMP1) y cuantifica su co-localización, en combinación con el recuento de puntos LC3 para medir la autofagia de manera objetiva, cuantitativa y estadísticamente robusta.

Este método de análisis utiliza múltiples características para evaluar el flujo autofágico. Para entender completamente la gráfica bivariada final, primero deben investigarse las características de análisis individuales. El contar de autofagosomas es una forma lógica de medir la autofagia; Sin embargo, el tamaño / forma / brillo de LC3 puncta puede variar drásticamente entre las células. La variación puede dificultar el conteo manual de los autofagosomas o el uso de una función de recuento de puntos en el software de análisis. Por lo tanto, ninguna función de recuento de puntos será perfecta debido a esta gran variabilidad en los autofagosomas. Sin embargo, una buena función de recuento de puntos funcionará en la mayoría de las celdas 26 . La Figura 3 muestra ejemplos de enmascaramiento puntual de LC3 puncta en células Jurkat usando diferentes mascarillas. La función de recuento de puntos seleccionada para este conjunto de datos es Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4, lo que significa que la función de recuento de puntos contó los puntos que el peAk máscara identificada dentro de la máscara de canal 11 por defecto (M11) en el canal 11 (Ch11-LC3-AF647) con una relación de fondo de 4 a 4 (Bright, 4). La Figura 4 muestra histogramas de conteo de puntos e imágenes representativas para el recuento de puntos medios para las células Jurkat Control, Control + Cloroquina, Starved y Starved + Cloroquina marcadas con anti-LC3-AF647. Los recuentos medios de control y Starved no son significativamente diferentes; Con la adición de cloroquina, hay una gran diferencia en la media del Control + Cloroquina en comparación con el Starved + Cloroquina. La siguiente característica a investigar es BDC3. BDC3 es una medida de la co-localización de tres marcadores / sondas, en este caso, LC3, p62 y LAMP1. La Figura 5A - 5D muestra histogramas BDC3 para las células Jurkat Control, Control + Cloroquina, Starved y Starved + Cloroquina etiquetadas con anti-p62-AF488, Anti - LAMP1 - PE, y anti - LC3 - AF647. Hay un desplazamiento entre la media de Control a la media de Starved, así como la media de Control + Cloroquina a la media de Starved + Cloroquina. Sin embargo, mirando las imágenes de las células de la media BDC3 puntuaciones en la Figura 5E - 5H , hay una mayor diferencia entre las muestras que los histogramas pueden conducir a uno a creer. Esto se debe a que BDC3 no considera el número de organelas de autofagia que co-localizan, dando como resultado un gran grado de variabilidad en el número de autofagosomas para la misma puntuación BDC3. En la mayoría de los casos, hay superposición entre las tres sondas porque, incluso en los niveles basales, p62, LAMP1 y LC3 deberían, en cierta medida, co-localizar o residir en regiones similares en las células. Como contraste, un ejemplo de tres sondas que no deberían co-localizarse son el colorante nuclear anti-p62-AF488, anti-LC3-AF647 y DAPI para la muestra de Starved + Cloroquina, mostrada en la Figura 6. &lt;Pabellón Cuando se combinan la función de conteo de puntos y la característica de BDC3, son evidentes la presencia de diferentes subpoblaciones que mejoran la capacidad de distinguir entre las diversas muestras / condiciones. La Figura 7 muestra la gráfica bivariada del recuento de puntos de LC3 frente a BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 para las cuatro muestras: Control, Control + Cloroquina, Starved y Starved + Cloroquina. La muestra de control se utilizó para establecer la estrategia de bloqueo para tres poblaciones: puntos bajos, puntos altos / bajo BDC3 y puntos altos / alto BDC3. Las muestras de control demostraron que más del 98% de las células tenían 1 o menos manchas. La frontera entre los High Spots / Low BDC3 y High Spots / High BDC3 se ajustó a una puntuación BDC3 de 1 porque más del 91% de la muestra Control tenía una puntuación BDC3 menor de 1. Un resumen de los resultados para las parcelas bivariadas Se muestra en la Tabla 1 . Edad = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig1.jpg" /> Figura 1: Configuración del instrumento MIFC. Una captura de pantalla de los ajustes del instrumento MIFC utilizados para este experimento, descritos en el paso 8 del protocolo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig2.jpg" /> Figura 2: Estrategia de control de software de análisis. Una captura de pantalla del esquema de gating de software de análisis, descrito en el paso 9 del protocolo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3: Mascarilla de punto LC3. Imágenes y máscaras de celdas Jurkat utilizadas para crear la función de recuento de puntos. Se muestran BrightField (BF), LC3-AF647, Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 2), Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4), Peak (M11, Ch11-LC3-AF647 , Brillante, 5), Spot (M11, Ch11 - LC3 - AF647, Brillante, 5,3,1) y Spot (M11, Ch11 - LC3 - AF647, Bright, 6,2,1). La máscara que funcionó mejor para todas las células mostradas era Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig4.jpg" /> Figura 4: Histogramas de conteo puntual LC3. Utilizando la función de contaje spot Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4 y los histogramas de conteo de puntos LC3-AF647 para Control ( A , azul claro), Control + CloroquinoE ( B , azul), Starved ( C , rosa), y Starved + Cloroquina ( D , rojo). Los recuentos medios para Control, Control + Cloroquina, Starved y Starved + Cloroquina son 0,07, 1,13, 0,10 y 2,77, respectivamente. BF, LC3-AF647 (rojo), DAPI colorante nuclear (azul) y un compuesto de las imágenes LC3-AF647 y DAPI de células representativas para el recuento de puntos promedio se muestran para Control ( E , 0 puntos), Control + Cloroquina F , 1 punto), Starved ( G , 0 manchas), y Starved + Cloroquina ( H , 3 manchas). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig5.jpg" /> Figura 5: Histogramas BDC3 de p62 / LAMP1 / LC3. BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 histogramas paraR Control ( A , azul claro), Control + Cloroquina ( B , azul), Starved ( C , rosa), y Starved + Cloroquina ( D , rojo). La puntuación media de BDC3 para Control, Control + Cloroquina, Starved y Starved + Cloroquina es de 0,57, 0,82, 0,74 y 0,98, respectivamente. BF; P62 - AF488 (verde); LAMP1 - PE (amarillo); LC3 - AF647 (rojo); Y un compuesto de las imágenes p62-AF488, LAMP1-PE y LC3-AF647 de células representativas para la media BDC3 se muestran para Control ( E ), Control + Cloroquina ( F ), Starved ( G ) y Starved + Cloroquina H ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig6.jpg" /> Figura 6: Histogramas BDC3 de p62 / LC3 / DAPI para la muestra de Starved + Cloroquina. ( A ) se muestra el histograma BDC3 p62 / LC3 / DAPI para la muestra de Starved + Cloroquina. La puntuación media de BDC3 es 0,07. ( B ) BF; P62 - AF488 (verde); LC3 - AF647 (rojo); DAPI (azul); Y se muestra un compuesto de las imágenes p62-AF488, LC3-AF647 y DAPI de células representativas para la BDC3 media para la muestra de Starved + Cloroquina. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig7.jpg" /> Figura 7: Parcelas bivariadas del recuento de puntos de LC3 frente a BDC3 p62 / LAMP1 / LC3. ( A ) Parcelas bivariadas del recuento de puntos LC3 frente a BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 para las células Control, Control + Cloroquina, Starved y Starved + Cloroquina Jurkat. ( B ) BF; P62-AF488 (verde); LAMP1 - PE (amarillo); LC3 - AF647 (rojo); Y se muestra un compuesto de las imágenes p62-AF488, LAMP1-PE y LC3-AF647 de tres regiones ( es decir, Puntos Bajos, Puntos Elevados / Bajo BDC3 y Puntos Elevados / Alto BDC3) para la muestra de Chorroquina Starved +. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Conteo de células </td><td> Detalle brillante Colocalización 3 Media </td><td> Cuenta puntual LC3 Media </td><td> % Punto bajo </td><td> % Punto alto / bajo BDC3 </td><td> % High Spot / High BDC3 </td></tr><tr><td> Controlar </td><td> 439 </td><td> 0,57 </td><td> 0,07 </td><td> 98,2 </td><td> 1.8 </td><td> 0,0 </td></tr><tr><td> Control + Cloroquina </td><td> 1432 </td><td> 0,82 </td><td> 1,13 </td><td> 68,9 </Td&gt; <td> 19,5 </td><td> 11,7 </td></tr><tr><td> Famélico </td><td> 1204 </td><td> 0,74 </td><td> 0,10 </td><td> 98,4 </td><td> 0,6 </td><td> 1.0 </td></tr><tr><td> Starved + Cloroquina </td><td> 1811 </td><td> 0,98 </td><td> 2,77 </td><td> 32,1 </td><td> 36,9 </td><td> 31,0 </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Resumen de Jurkat LC3 punto Count frente BDC3 p62 / LÁMPARA1 / LC3 Bivariadas Terreno

En este sentido, se utilizó la citometría de flujo de imágenes multiespectrales con una característica analítica que compara imágenes detalladas de 3 marcadores de autofagia y cuantifica su co-localización, junto con el recuento de puntos LC3, para medir la autofagia de una manera objetiva, cuantitativa y estadísticamente robusta.

Evaluación del flujo autofágico midiendo la co-localización de LC3, p62 y LAMP1 usando citometría de flujo de imágenes multiespectrales

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

El objetivo general de este experimento es cuantificar la colocalización de tres marcadores de autofagia junto con la cuantificación de puntos LC3 para medir la autofagia de una manera objetiva, cuantitativa y estadísticamente robusta. Este método permite medir la colocalización de tres marcadores de autofagia en un solo ensayo, lo que podría conducir a nuevos conocimientos sobre la inducción y regulación de la autofagia. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden medir simultáneamente tres marcadores de autofagia de forma objetiva, cuantitativa y estadísticamente robusta.Comience añadiendo dos veces 10 a la sexta células Jurkat en tubos cónicos individuales de 15 mililitros etiquetados con los nombres apropiados de las muestras. A continuación, añada suficiente tampón de lavado a cada tubo para llevar el volumen final de cada muestra a 15 mililitros y haga pellet de las muestras mediante centrifugación. Re-suspenda los pellets en 100 microlitros de formalina al 4 %, luego transfiera las muestras a tubos de microcentrifugación de polipropileno silanizados y etiquetados.Después de 10 minutos a temperatura ambiente, lave las muestras con un mililitro de tampón de lavado fresco. Re-suspenda los pellet en 100 microlitros del primer anticuerpo de interés en tampón de permeabilización durante una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente, en la oscuridad y protegidos de la luz. Lave las células marcadas y permeabilizadas con un mililitro de tampón de permeabilización fresco y márquelas con el siguiente anticuerpo de interés, tal como se acaba de demostrar.Después de que todas las muestras hayan sido marcadas con el anticuerpo final, volver a suspender los pellets en solución de formalina al 1 %, seguido por la adición de 10 microlitros de colorante nuclear DAPI 10x. Mezclar las células con un vortex suave, luego incubar las muestras durante 10 minutos a temperatura ambiente, protegidas de la luz. Al final de la incubación, cargar la plantilla predeterminada en el citómetro de flujo con imágenes multiespectrales y seleccionar los láseres adecuados.Introduzca la potencia láser deseada en la ventana junto a cada botón láser, luego haga clic en el botón cargar para colocar el tubo de 1,5 mililitros en el instrumento. Cree un gráfico de puntos de área M01 frente a relación de aspecto M01 para toda la población y dibuje una región alrededor de las células. Asigne a esta región el nombre Célula.Configure los parámetros de adquisición. Especifique la carpeta de destino y el nombre del archivo, y cambie el número de eventos a 5.000; luego seleccione la población celular y haga clic en adquirir para obtener el archivo y procesar el resto de las muestras tal como se acaba de demostrar, utilizando los mismos ajustes del láser. Después de recopilar el archivo, haga clic en regresar para recuperar el tubo de muestra.Para analizar los datos de citometría de flujo con imágenes multiespectrales, haga clic en iniciar análisis para ejecutar el asistente de apertura de archivos en el software de análisis de imágenes, luego haga clic en el icono del asistente de apoptosis y en el botón seleccionar asistente para abrir el asistente de apoptosis. Después de que todas las células apoptóticas hayan sido eliminadas del análisis, cree una región alrededor de las células no apoptóticas y etiquete esta población como células. A continuación, haga clic en el icono de bloques de construcción.Seleccione las fluorescencias positivas de un color y la población de células y la intensidad del canal MC tres. Etiquete el eje X como intensidad lámpara uno y dibuje una región que incluya las células con intensidades mayores a 10,000. Etiquete esta región como lámpara uno positiva.Después de seleccionar las células positivas para P62 y LC3 de la misma manera, haga clic en la pestaña de análisis y seleccione máscara. Haga clic en nuevo y luego en función. En función, seleccione pico.Bajo máscara, seleccione M11. Bajo canal, seleccione el canal 11. Establezca la relación del punto con el fondo celular en cuatro.Luego, haga clic en aceptar para cerrar la ventana de la función de máscara definida, seguido de aceptar para agregar la máscara a la lista de máscaras. Haga clic en cerrar para salir del administrador de máscaras, luego haga clic nuevamente en la pestaña de análisis y seleccione características. Haga clic en nuevo.En el tipo de característica, seleccione recuento de puntos y seleccione la máscara de pico que acaba de crearse. Ingrese LC3 recuento de puntos como nombre y haga clic en aceptar. Haga clic en nuevo nuevamente.En el tipo de característica, seleccione colocalización de detalles brillantes tres o BDC3. En la máscara, seleccione MC. En la imagen uno, seleccione el canal dos para P62. En la imagen dos, seleccione el canal tres para lamp1.Bajo la imagen tres, seleccione el canal 11 para LC3. Ingrese BDC3p62/LAMP1/LC3 como nombre y haga clic en aceptar y cerrar para salir del administrador de características. Haga clic en el nuevo icono de gráfico de dispersión y seleccione la población positiva para LAMP1, positiva para p62 y positiva para LC3.Seleccione BDC3/p62/LAMP1/LC3 para el eje X y la característica de recuento de puntos LC3 para el eje Y, y haga clic en aceptar. En el menú archivo, seleccione guardar archivo de análisis de datos y haga clic en guardar y sí para guardar los datos de ayuno más cloroquina como un archivo de análisis de datos y para reemplazar la versión anterior del archivo. Ahora abra el archivo de control y seleccione la matriz de compensación adecuada y el archivo de análisis de datos de ayuno más cloroquina como plantilla.Haga clic en aceptar. Para crear regiones para la acumulación de autofagosomas y la acumulación de autofolisomas, abra la muestra de control y dibuje una región rectangular desde las coordenadas del eje X de 0,1 a 3 y las coordenadas del eje Y de 1,5 a 0,3. Asigne a esta región el nombre de puntos bajos.A continuación, dibuje una región desde las coordenadas del eje X de 0,1 a uno y desde las coordenadas del eje Y de 17,5 a 1,5, y denomine esta región punto alto, bajo BDC3; luego dibuje una región desde las coordenadas del eje X de uno a tres y desde las coordenadas del eje Y de 17,5 a 1,5, y denomine esta región puntos altos/alto BDC3. Guarde el archivo de control para que pueda utilizarse como plantilla, y luego abra los demás archivos, incluido el archivo de células en ayunas más cloroquina, utilizando el archivo de control como plantilla, tal como se mostró anteriormente. El tamaño, la forma y el brillo de los puntos de LC3 pueden variar drásticamente entre células, como se observa en estas máscaras de puntos de LC3 en células Jurkat utilizando diferentes máscaras de puntos.La máscara que funcionó mejor para este experimento fue la de pico con una relación de cuatro entre el punto y el fondo celular. En estos recuentos representativos de puntos en células Jurkat marcadas con anti-LC3, los recuentos promedio de puntos en el control y en condiciones de ayuno no son significativamente diferentes. Cuando se añade cloroquina, se observa una gran diferencia entre la media del control más cloroquina y la media del ayuno más cloroquina.En este experimento, se observó un desplazamiento entre la media de colocalización BDC3 del control medida y la media en condiciones de ayuno, así como entre la media del control más cloroquina y la media de ayuno más cloroquina. BDC3 no tiene en cuenta el número de orgánulos de autofagia que colocalizan, lo que resulta en un alto grado de variabilidad en el número de autofagocitos para un mismo puntaje BDC3. De hecho, en la mayoría de los casos existe superposición entre las tres sondas, ya que incluso a niveles basales, p62, LAMP1 y LC3 deberían, hasta cierto punto, colocalizar en regiones similares de las células.Como contraste, aquí hay un ejemplo de la característica BDC3 en tres sondas que no deberían colocalizarse: P62, LC3 y DAPI. Cuando se combinan el recuento de puntos y las características BDC3, resulta evidente la presencia de diferentes subpoblaciones que mejoran la capacidad de distinguir entre las diversas muestras y condiciones.Una vez dominada, esta técnica puede completarse en aproximadamente ocho horas si se realiza correctamente. Sin embargo, si se requiere una característica diferente de conteo de colonias, se necesitaría tiempo adicional de análisis. Al intentar este procedimiento, es importante recordar utilizar los controles adecuados.Por ejemplo, utilice la muestra de control para establecer los umbrales de niveles de Beyza y la muestra de control más cloroquina como control para la muestra en ayunas más cloroquina. Este procedimiento también puede utilizarse para otras aplicaciones intracelulares que requieran la colocalización de tres marcadores diferentes, simplemente cambiando a los anticuerpos específicos de interés. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo etiquetar células con marcadores de autofagia, adquirir datos en un citómetro de flujo con imágenes multiespectrales y analizar los datos para evaluar el flujo autofágico.No olvide que trabajar con formalina puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como usar equipo de protección personal adecuado, al realizar este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

La autofagia es un proceso ubicuo que permite a las células para degradar y reciclar las proteínas y orgánulos. Aplicamos microscopía de fluorescencia avanzada para visualizar y cuantificar la pequeña, pero, cambios físicos esenciales asociados con la inducción de la autofagia, incluyendo la formación y distribución de autofagosomas y lisosomas, y su fusión en autolisosomas.

Análisis cuantitativo de la autofagia mediante microscopía de fluorescencia avanzada 3D

Time-lapse microscopía de marcadores autofagia marcados con fluorescencia permite la monitorización de la respuesta de la autofagia dinámico con alta resolución temporal. Usando la autofagia específico y los marcadores de orgánulos en una combinación de 3 colores diferentes, podemos seguir la aportación de una proteína a la formación autophagosome en un contexto espacial y temporal robusto.

Imágenes de células vivas de las primeras autofagia Eventos: Omegasomes y más allá

La autofagia activa se asocia con la regeneración muscular productiva, que es esencial para la activación de las células madre musculares (MuSC). Aquí, proporcionamos un protocolo para la detección in situ de LC3, un marcador de autofagia en MyoD-positivos MuSCs de secciones de tejido muscular de control y los ratones lesionados.

Tinción Inmunofluorescente In Situ de Autofagia en Células Madre Musculares

Aquí se describe un protocolo simple y bien validado para medir la actividad de autofagia secuestro a granel en células de mamíferos. El método se basa en cuantificar la proporción de lactato deshidrogenasa (LDH) en fracciones celulares de sedimentables en comparación con los niveles de LDH celulares total.

El ensayo de secuestro del lactato deshidrogenasa, Es un método Simple y confiable para determinar la actividad de autofagia secuestro a granel en células de mamíferos

Describimos nuestro protocolo para medir los ritmos biológicos en el catabolismo proteico a través de la autofagia y el proteosoma en el hígado de ratón.

Medición de ritmos diurnos en flujo autofésico y proteasomal

La mitofagia es el principal mecanismo de control de calidad mitocondrial. Sin embargo, la evaluación de la mitofagia in vivo se ve obstaculizada por la falta de ensayos cuantitativos fiables. Aquí se presenta un protocolo para la observación de la mitofagia en células vivas utilizando un colorante mitocondrial verde-fluorescente permean celular y un colorante lisosómico rojo-fluorescente.

Visualización de la mitofagia con tintes fluorescentes para mitocondrias y lisosomas

El objetivo de este protocolo es determinar los niveles autofágicos en el cáncer de páncreas y las células acinares pancreáticas a través de la inmunofluorescencia LC3 y la cuantificación de puntos LC3.

Evaluación de los niveles de autofagia en dos modelos diferentes de células pancreáticas utilizando inmunofluorescencia LC3

Aquí, presentamos un protocolo para la microscopía correlativa de luz-electrónica optimizada en sección basada en el marcaje endógeno y fluorescente como herramienta para investigar la localización de proteínas raras en relación con la ultraestructura celular. El poder de este enfoque se demuestra mediante la localización ultraestructural de LC3 endógena en células hambrientas sin tratamiento con bafilomycina.

Localización ultraestructural de LC3 endógena mediante microscopía óptica correlativa en sección

En este trabajo se presenta la metodología para evaluar de forma concisa los niveles de LC3-II del marcador autofagosoma en vesículas extracelulares (VE) mediante inmunotransferencia. El análisis de los niveles de LC3-II en EV, la formación de autolisosomas y la formación de omegasomas sugiere el nuevo papel de STX6 en la liberación de EV positivos para LC3-II cuando se inhibe la fusión autofagosoma-lisosoma.

Evaluación de la liberación de LC3-II a través de vesículas extracelulares en relación con la acumulación de vesículas intracelulares LC3 positivas

El método IP-FCM se presenta, lo que permite un sensible, sólida evaluación, bioquímicos nativos de interacciones proteína-proteína, sin necesidad de la ingeniería genética o muestras de gran tamaño.

IP-FCM: inmunoprecipitación detectada por citometría de flujo

Aprende a cuantificar la co-localización de LC3, p62 y LAMP1 mediante citometría de flujo de imágenes multiespectrales en células Jurkat. Este método objetivo y robusto mejora la evaluación del flujo autofágico.

Evaluación del flujo autofágico midiendo la co-localización de LC3, p62 y LAMP1 usando citometría de flujo de imágenes multiespectrales (Video) | JoVE Journal

Evaluación del flujo autofágico midiendo la co-localización de LC3, p62 y LAMP1 usando citometría de flujo de imágenes multiespectrales

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