In Vitro Crecimiento de los folículos Preantral ratón bajo microgravedad simulada
17 de diciembre de 2017
Una técnica muy prometedora para generar tejido construye sin utilizar la matriz es a células en cultivo en condiciones de microgravedad simulada. Usando un sistema de cultivo rotatorio, examinamos crecimiento del folículo ovárico y la maduración de ovocitos en términos de supervivencia del folículo, morfología, crecimiento y función de ovocitos bajo la condición de microgravedad simulada.
Crecimiento in vitro de folículos preantrales de ratón bajo microgravedad simulada. Todo el procedimiento puede dividirse en cuatro partes. Parte uno, aislar mecánicamente los folículos de los ovarios utilizando agujas bajo un estereomicroscopio.
Paso dos, encapsular un folículo individual pipeteándolo al centro de cada perla de alginato. Paso tres, transferir las perlas de alginato que contienen los folículos individuales a la gota de medio de cultivo en el sistema de cultivo rotatorio que genera la microgravedad simulada. Paso cuatro, recoger las perlas de alginato y desencapsular los folículos de las perlas de alginato incubándolos en medio suplementado con alginato liasa durante 30 minutos a 37 grados centígrados.
Aislamiento y encapsulación de folículos. Recolecte los ovarios en medio de manejo y luego coloque los ovarios en una placa de pozo centralizada. Bajo un microscopio estereoscópico, los folículos se aíslan de los ovarios mediante dos agujas.
Tenga cuidado de no dañar la vasomembrana. Prepare un recipiente con gotas de medio y cúbralo con aceite. Transfiera los folículos al recipiente preparado.
Lave los folículos en el nuevo medio y luego transfiéralos a las gotas de medio. Una gota de medio contiene un solo folículo. Prepare una placa de cultivo centrada y agregue la solución de encapsulación en el círculo exterior.
Prepare un vial de la solución de alginato al cero con ocho por ciento. Añada cero con cinco microlitros de la solución de alginato en el centro del recipiente. Añada gotas de la solución de alginato a la solución de encapsulación en el círculo exterior del recipiente.
Transfiera el folículo a la solución de alginato en el centro del recipiente. Enjuague los folículos con la solución de alginato. Transfiera los folículos al centro de cada perla de alginato a través de la superficie blanda de la solución.
Cada perla de alginato contiene un único folículo. Lave las perlas de alginato con la solución de encapsulación para solidificarlas. Transfiera las perlas de alginato a un nuevo recipiente con medio de manipulación.
Cultivo in vitro de folículos encapsulados bajo tratamiento de microgravedad simulada. Para el grupo control, agregue 150 mililitros de medio de cultivo a un nuevo recipiente y cúbralo con aceite. Transfiera tres perlas de alginato al gota de medio.
Incube el recipiente en un incubador de dióxido de carbono para cultivo. Para el tratamiento de microgravedad simulada, prepare un recipiente con aceite, retire la tapa del puerto y agregue el aceite al recipiente a través del puerto abierto hasta que esté casi lleno. Añada un medio de cultivo de 50 mililitros al aceite.
Transfiera tres perlas de alginato al gota de medio. Reemplace la tapa del puerto abierto. Deben eliminarse las burbujas de aire en el recipiente.
Retire la tapa del puerto de la jeringa. Coloque dos jeringas con aceite en el puerto de la jeringa. Mueva las burbujas de aire debajo del puerto de la jeringa.
Extraiga las burbujas hacia la jeringa e inyecte el mismo volumen de aceite fuera de la otra jeringa. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en el recipiente. Cierre las válvulas, retire las jeringas y reemplace la tapa del puerto de la jeringa.
Ya hemos preparado cuatro recipientes con perlas de alginato. Ahora es el momento de fijar los recipientes en la base giratoria. Ajuste la velocidad de rotación hasta que la gota de medio esté en estado de equilibrio.
Transfiera tanto los recipientes como la base a un incubador de dióxido para cultivo. Cambio del medio de cultivo. Retire la tapa del puerto abierto, recoja las perlas de alginato y el aceite en un nuevo recipiente.
Localice y transfiera las perlas de alginato a una placa con el medio de manejo. Vuelva a establecer el sistema de cultivo en recipiente como antes. Recuperación de folículos.
Retire el tapón del puerto abierto, recolecte las perlas de alginato y el aceite en un nuevo recipiente. Recoga las perlas de alginato y los folículos desencapsulados a partir de las perlas de alginato mediante incubación en medio de manejo, suplementado con una alginasa durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Resultados. El ensayo de viabilidad celular mostró que los folículos individuales cultivados en condiciones de gravedad normal presentaron más células vivas y menos células muertas que los folículos cultivados en condiciones de microgravedad simulada.
El tamaño del folículo aumentó significativamente bajo ambas condiciones de gravedad. Conclusión. Nuestro método proporciona un modelo para estudiar los mecanismos implicados en los procesos de desarrollo in vitro de los ovocitos y las células de la granulosa bajo condiciones de microgravedad simulada.
Descripción general
Este estudio describe un protocolo para cultivar folículos preantrales de ratón bajo condiciones de microgravedad simulada utilizando un sistema de cultivo rotatorio. El enfoque consiste en aislar y encapsular folículos en perlas de alginato, cultivarlos tanto en condiciones normales como de microgravedad simulada, y evaluar la supervivencia, el crecimiento del folículo y la ultraestructura del ovocito. Los hallazgos destacan el impacto de la microgravedad en la viabilidad del folículo y el desarrollo del ovocito, proporcionando un modelo para investigar más a fondo la foliculogénesis in vitro bajo gravedad alterada.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología reproductiva
- Biología del desarrollo
- Ingeniería de tejidos
Antecedentes
- Los ambientes de microgravedad pueden afectar el desarrollo celular y tisular.
- El cultivo in vitro de folículos es una herramienta valiosa para estudiar el desarrollo del ovocito y de las células de la granulosa.
- Los sistemas de microgravedad simulada permiten investigar el papel de la gravedad en la foliculogénesis.
- La encapsulación con alginato favorece el cultivo tridimensional de folículos.
Objetivo del estudio
- Establecer un protocolo para el cultivo de folículos preantrales de ratón bajo microgravedad simulada.
- Comparar la supervivencia y el desarrollo folicular entre condiciones de gravedad normal y microgravedad simulada.
- Evaluar los efectos de la microgravedad sobre el desarrollo del ovocito y de las células foliculares granulosas.
Métodos Utilizados
- Aislamiento mecánico de folículos preantrales de ovarios de ratón de 14 días de edad utilizando agujas bajo un microscopio estereoscópico.
- Encapsulación de folículos individuales en geles de alginato al 0,8 %.
- Cultivo de folículos encapsulados en un sistema de recipiente rotatorio para simular microgravedad, con cultivos control paralelos a gravedad normal.
- Recuperación y desencapsulación de folículos utilizando alginato liasa.
- Evaluación de la supervivencia folicular, medición de los diámetros del folículo y del ovocito, y análisis ultraestructural de los ovocitos.
Resultados Principales
- Los folículos cultivados bajo gravedad normal mostraron una mayor viabilidad celular en comparación con aquellos bajo microgravedad simulada.
- El tamaño de los folículos aumentó significativamente bajo ambas condiciones de gravedad.
- La microgravedad simulada provocó una disminución en la supervivencia de los folículos y una regulación negativa de la expresión del antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA) y del factor de crecimiento y diferenciación 9 (GDF9).
- Los ovocitos del grupo de microgravedad exhibieron anomalías ultraestructurales.
Conclusiones
- El método descrito permite el estudio del desarrollo folicular y ovocitario in vitro bajo microgravedad simulada.
- La microgravedad simulada afecta negativamente la supervivencia folicular y la calidad del ovocito.
- Se necesita una mayor optimización del sistema de cultivo para modelar mejor la foliculogénesis in vitro bajo condiciones de gravedad alterada.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El cultivo en microgravedad simulada de folículos preantrales de ratón proporciona un sistema controlado para investigar el impacto mecanicista de fuerzas físicas alteradas en la folículo génesis temprana. Este modelo permite la evaluación cuantitativa de la supervivencia folicular, el crecimiento del ovocito y los marcadores moleculares, lo que respalda la confianza predictiva en estudios de biología del desarrollo. El enfoque orienta decisiones ajustadas al riesgo en investigaciones traslacionales dentro de las líneas de investigación en reproducción y bioingeniería de tejidos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la desestimación mecanicista de riesgos en el desarrollo del folículo y del ovocito bajo condiciones de gravedad alterada.
- Apoya la validación funcional de marcadores moleculares como PCNA y GDF9 en la maduración de las células de la granulosa y del ovocito.
- Proporciona una plataforma cuantitativa para la comprobación de hipótesis en biología reproductiva e ingeniería de tejidos.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Establece un sistema de cultivo 3D reproducible para evaluar la viabilidad de los folículos y las métricas de crecimiento.
- Facilita la estandarización de lecturas cuantitativas, incluidos los diámetros del folículo y del ovocito.
- Permite el análisis comparativo de la supervivencia y la expresión molecular bajo condiciones físicas variables.
Investigación Traslacional y Preclínica
- Ofrece un modelo para estudiar mecanismos relacionados con enfermedades que afectan la calidad del ovocito y la supervivencia del folículo.
- Apoya la correlación entre hallazgos in vitro y el desarrollo de biomarcadores traslacionales en salud reproductiva.
- Proporciona información para estrategias preclínicas destinadas a optimizar sistemas de cultivo de tejidos en entornos no estándar.
Integración de la Línea de Proceso y Flujo de Trabajo
Este método se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la etapa preclínica al permitir estudios mecanicistas en etapas tempranas y el desarrollo de ensayos cuantitativos en biología reproductiva e ingeniería de tejidos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la investigación basada en hipótesis sobre el efecto de la gravedad en la foliculogénesis y la maduración de los ovocitos.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos estandarizados sobre viabilidad y crecimiento en condiciones controladas.
- Análisis: Ofrece puntos finales medibles, como tasas de supervivencia, expresión de marcadores moleculares y análisis ultraestructural.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos in vitro con modelos preclínicos en medicina reproductiva y regenerativa.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para estudios mecanicistas en diversos tipos de tejidos y células.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva en los modelos de biología del desarrollo y reproductiva.
- Valor operativo: Fomenta la estandarización y la reproducibilidad en los flujos de trabajo de cultivo 3D y evaluación cuantitativa.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de avance o interrupción en programas de ingeniería de tejidos y salud reproductiva.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de iniciativas de investigación mecanicista y traslacional.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en aislamiento folicular, encapsulación y técnicas de cultivo tridimensional.
- Exige acceso a sistemas de cultivo rotatorios especializados e infraestructura analítica para la evaluación cuantitativa.
- Necesita la estandarización entre equipos de ensayos de viabilidad y análisis de marcadores moleculares.
- Puede requerir adaptación para diferentes tipos de tejidos o especies según el enfoque de la investigación.
- La optimización de los parámetros de simulación de microgravedad es fundamental para la fiabilidad y reproducibilidad del modelo.
