Actuador basado en las células musculares cardíacas y auto-estabilizante Biorobot - Parte 2

El objetivo general de este estudio es poblar dispositivos microfabricados con células de músculo cardíaco y caracterizar las propiedades bioquímicas y biomecánicas de las células en estos dispositivos, así como su rendimiento a lo largo del tiempo. El material descrito aquí puede modificarse fácilmente para otros experimentos que requieren la adición de células de alta densidad en dispositivos microfabricados. La principal ventaja del bioactuador desarrollado en este vídeo es que se puede adoptar fácilmente para cuantificar las fuerzas de contracción celular de cualquier otro tipo de célula.

También se puede utilizar para estudiar los cambios en las características biomecánicas de las células madre a medida que se diferencian. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de siembra de células son difíciles de aprender con descripciones de textos. Deben llevarse a cabo correctamente para garantizar la fijación confluente de las células en los brazos en voladizo, que es esencial para el correcto funcionamiento biológico.

La demostración del procedimiento estará a cargo de Neerajha Nagarajan de mi laboratorio. Con el biorobot, comience en el matraz T25. Use un imán para mantenerlo en su lugar en el fondo del matraz.

El imán no es necesario para los actuadores biológicos, ya que no se moverán debido al peso de la perla de vidrio en la base. Enrolle una pequeña lámina de plástico cuadrada para usarla como embudo y coloque el embudo estéril sobre los actuadores de los biorobots. Ajuste el diámetro en el extremo más ancho para que se ajuste al dispositivo y la altura para que quede bien ajustado cuando se apriete la parte superior del matraz.

Use un matraz separado para probar y ajustar el ajuste del embudo. El ajuste ceñido del embudo asegurará que no haya fugas de las celdas como se mencionó en el resto de los medios. Esto es esencial para proporcionar una cobertura confluente del brazo en voladizo.

Con el embudo en su lugar, resuspenda los cardiomiocitos en DMEM completo a una densidad de 16 millones de células por mililitro y deje caer lentamente 400 microlitros de la suspensión en los dispositivos a través de cada embudo. A continuación, vuelva a colocar lentamente los matraces en la incubadora sin alterar los dispositivos ni los embudos que contienen. Deje que las celdas se adhieran durante 24 horas a 37 grados centígrados.

Después del período de incubación, retire lentamente el embudo. Lave suavemente las muestras con PBS y vuelva a llenar cada matraz con 10 mililitros de DMEM completo fresco. A continuación, retira el imán del biorobot para que quede a flote y vuelve a colocar los matraces en la incubadora.

Monte una cámara equipada con una lente de zoom en la incubadora para visualizar los dispositivos en cultivo. Luego, agregue una tira de luz LED para usar como fuente de luz. A continuación, conecte la cámara a una computadora y abra el programa de imágenes.

Una vez en el programa, haga clic en la imagen de la cámara en la pestaña Archivo para abrir todas las opciones de la cámara y elija la cámara conectada. En la lista de pestañas, elija En vivo y enfoque manualmente la imagen ajustando el dial del lente. A continuación, seleccione el recorte de la región de interés en el panel superior.

A continuación, dibuje manualmente un rectángulo en el fotograma de vídeo que encierra el dispositivo actuador biológico y los brazos en voladizo para marcar la región de interés. En el caso de los biorobots, captura toda la pantalla para registrar el movimiento de natación del dispositivo. A continuación, seleccione Configuración de la cámara y establezca la velocidad de fotogramas ajustando la exposición y la proporción de píxeles de la imagen en vivo.

Establezca las velocidades de fotogramas en unos 30 fotogramas por segundo. Finalmente, haga clic en el botón de grabación para comenzar a grabar los videos. Abra el software de programación haciendo clic en el icono.

Una vez cargado, haga clic en Archivo, Abrir y seleccione el archivo de script m para ejecutar el análisis de imágenes. Asegúrese de que las imágenes TIF grabadas y sus versiones AVI estén en la misma carpeta que el archivo m y, a continuación, haga clic en Ejecutar para ejecutar el script. Presione Reproducir para iniciar el programa real.

Una vez ejecutado, haga clic en el botón Abrir y localice el archivo TIF o AVI que se va a analizar. A continuación, haga clic en el botón base. Seleccione el punto donde el voladizo se une a la base en la parte superior y presione Enter.

Esto colocará un marcador cuadrado en la imagen para cada fotograma para indicar la ubicación de la base en voladizo. A continuación, haga clic en el botón de escala y luego haga clic manualmente en un borde de la cuenta de vidrio. Lleve el puntero del ratón al lado opuesto de la cuenta de vidrio y pulse Intro.

Esto dibujará una línea que mide el diámetro de la cuenta de vidrio y relacionará el diámetro con los píxeles que se muestran. Haga clic en el botón Analizar. A continuación, haga clic a lo largo del voladizo a una corta distancia del primer marcador cuadrado que representa la base del voladizo.

Continúe haciendo clic a lo largo del voladizo, incluida la punta, y presione Enter cuando haya terminado. Esto colocará una X en cada punto en el voladizo. Por último, compruebe si el círculo superpuesto traza correctamente el perfil del voladizo.

Si es correcto, haga clic en el botón siguiente fotograma. Esto cambiará al siguiente fotograma en el archivo TIF. Repita este proceso para todos los fotogramas.

Una vez que se hayan procesado todos los fotogramas, haga clic en el botón Exportar. Comience abriendo el software de análisis de imágenes y cargando el archivo de video del biorobot de natación. A continuación, abre el software de la hoja de cálculo.

En el video del biorobot cargado, ubique una referencia de tamaño, como la cuenta de vidrio. Utilice la herramienta Recto para dibujar una línea a través de la cuenta de vidrio. A continuación, haga clic en Analizar y seleccione Establecer escala.

Establezca el campo Distancia conocida en 3.000 micrómetros y haga clic en Aceptar. Elija un punto en un dispositivo que no se tambalee entre fotogramas para que actúe como marcador y registre las coordenadas X e Y de este punto en la hoja de cálculo. Vuelva a la ventana del software de análisis de imágenes y pulse la tecla de flecha derecha para cambiar al siguiente fotograma. Vuelva a colocar el marcador y registre las nuevas coordenadas X e Y en la hoja de cálculo.

Repita este proceso para todos los fotogramas y utilice los datos para analizar el movimiento del biorobot como se describe en el protocolo de texto adjunto. Las tensiones estáticas y dinámicas del actuador se extrajeron de la tensión superficial cada día. La tensión estática es la tensión contráctil que las células exhiben en la superficie en el estado de reposo y la tensión dinámica es la tensión generada por las células en la máxima contracción.

A medida que las células maduraban en cultivo, se observó un aumento gradual de las tensiones estáticas y dinámicas a lo largo del tiempo. Exhibieron una fuerza de tracción máxima de la celda de 50 milinewtons por metro y una fuerza de contracción máxima de aproximadamente 165 milinewtons por metro en el sexto día. Paralelamente a las tensiones estáticas y dinámicas, los marcadores de maduración, crecimiento y propagación de los cardiomiocitos, y la interconectividad celular también aumentan hasta el sexto día.

Con base en el análisis de video, aquí se muestra la comparación de la velocidad promedio de nado, la frecuencia de batido y la distancia recorrida por brazada para tres biorobots con diferentes perfiles de natación. Aunque los biorobots verticales tienen la frecuencia de batido más pequeña, exhibieron la mayor velocidad de natación y distancia recorrida. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo sembrar células de músculo cardíaco en dispositivos microfabricados que podrían funcionar como actuadores biológicos y biorobots.

El proceso de adquisición de imágenes y el posterior análisis de datos descrito en este vídeo demuestra una forma cómoda de caracterizar el comportamiento de la célula, así como el rendimiento del dispositivo. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la vida útil de los cardiomiocitos es limitada y la actividad de las células alcanza su punto máximo al sexto día. Después de lo cual, disminuye con el tiempo.