Actuador basado en las células musculares cardíacas y auto-estabilizante Biorobot - Parte 2

El objetivo general de este estudio es poblar dispositivos microfabricados con células musculares del corazón y caracterizar las propiedades bioquímicas y biomecánicas de las células en estos dispositivos, así como su desempeño a lo largo del tiempo. El procedimiento descrito aquí puede modificarse fácilmente para otros experimentos que requieran la adición de células a alta densidad en dispositivos microfabricados. La principal ventaja del bioactuador desarrollado en este video es que puede adaptarse fácilmente para cuantificar las fuerzas de contracción celular de cualquier otro tipo celular.

También puede utilizarse para estudiar los cambios en las características biomecánicas de las células madre mientras se diferencian. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de siembra celular son difíciles de aprender únicamente mediante descripciones textuales. Es necesario realizarlos correctamente para garantizar la adhesión confluyente de las células en los brazos del micromuelle, lo cual es esencial para una adecuada función biológica.

La procedura será demostrada por Neerajha Nagarajan de mi laboratorio. Con el biorrobot, comience en el matraz T25. Utilice un imán para mantenerlo en su lugar en el fondo del matraz.

No se necesita el imán para los actuadores biológicos, ya que no se moverán debido al peso de la perla de vidrio en la base. Enrolle una pequeña lámina de plástico en forma de cuadrado para usarla como embudo y coloque el embudo estéril sobre los actuadores en los biorrobots. Ajuste el diámetro en el extremo más ancho para que coincida con el dispositivo y la altura para que encaje firmemente cuando se apriete la parte superior del matraz.

Utilice un matraz separado para probar y ajustar la colocación del embudo. Un ajuste firme del embudo garantizará que no haya fugas de las células al resto del medio, como se mencionó. Esto es esencial para lograr una cobertura uniforme y completa del brazo en voladizo.

Con el embudo en su lugar, resuspenda los cardiomiocitos en DMEM completo a una densidad de 16 millones de células por mililitro y deposite lentamente 400 microlitros de la suspensión sobre los dispositivos a través de cada embudo. A continuación, mueva lentamente los frascos de vuelta al incubador sin perturbar los dispositivos ni los embudos dentro. Deje que las células se adhieran durante 24 horas a 37 grados Celsius.

Después del período de incubación, retire lentamente el embudo. Lave suavemente las muestras con PBS y rellene cada matraz con 10 mililitros de DMEM completo fresco. A continuación, retire el imán del biorrobot para que queden flotando y coloque los matraces de nuevo en el incubador.

Coloque una cámara equipada con un objetivo zoom dentro del incubador para visualizar los dispositivos en cultivo. Luego, agregue una tira de luces LED para usar como fuente de iluminación. A continuación, conecte la cámara a una computadora y abra el programa de adquisición de imágenes.

Una vez dentro del programa, haga clic en la imagen de la cámara en la pestaña Archivo para abrir todas las opciones de la cámara y seleccione la cámara conectada. En la lista de pestañas, elija Directo y enfoque manualmente la imagen ajustando el dial del objetivo. A continuación, seleccione el recorte de la región de interés desde el panel superior.

A continuación, dibuje manualmente un rectángulo en el fotograma del video que encierre el dispositivo actuador biológico y los brazos en voladizo para marcar la región de interés. En el caso de los biorrobots, capture toda la pantalla con el fin de registrar el movimiento de nado del dispositivo. A continuación, seleccione Configuración de la cámara y establezca la velocidad de fotogramas ajustando la exposición y la relación de píxeles de la imagen en vivo.

Configure las velocidades de fotogramas a aproximadamente 30 fotogramas por segundo. Finalmente, haga clic en el botón de grabación para comenzar a grabar los videos. Abra el software de programación haciendo clic en el icono.

Una vez cargado, haga clic en Archivo, Abrir y seleccione el archivo de script m para ejecutar el análisis de imágenes. Asegúrese de que las imágenes TIF grabadas y sus versiones AVI estén en la misma carpeta que el archivo m y luego haga clic en Ejecutar para iniciar el script. Presione Reproducir para comenzar el programa real.

Una vez iniciado, haga clic en el botón Abrir y localice el archivo TIF o AVI que se va a analizar. Luego, haga clic en el botón base. Seleccione el punto donde la ménsula se une a la base en la parte superior y presione Entrar.

Esto colocará un marcador cuadrado en la imagen para cada fotograma con el fin de indicar la ubicación de la base del cantilever. A continuación, haga clic en el botón de escala y luego haga clic manualmente en un borde de la perla de vidrio. Lleve el puntero del ratón al lado opuesto de la perla de vidrio y presione Intro.

Esto trazará una línea que mide el diámetro de la perla de vidrio y relacionará el diámetro con los píxeles mostrados. Haga clic en el botón Analizar. Luego, haga clic a lo largo del cantiléver a una corta distancia del primer marcador cuadrado que representa la base del cantiléver.

Continúe haciendo clic a lo largo del cantiléver, incluyendo la punta, y presione Intro cuando termine. Esto colocará una X en cada punto seleccionado sobre el cantiléver. Finalmente, verifique si el círculo superpuesto traza correctamente el perfil del cantiléver.

Si es correcto, haga clic en el botón del siguiente cuadro. Esto cambiará al siguiente cuadro en el archivo TIF. Repita este proceso para todos los cuadros.

Una vez que se hayan procesado todos los fotogramas, haga clic en el botón Exportar. Comience abriendo el software de análisis de imágenes y cargando el archivo de video del biorrobot nadador. Luego, abra el software de hojas de cálculo.

En el video cargado del biorrobot, localice una referencia de tamaño, como el gránulo de vidrio. Utilice la herramienta Línea para trazar una línea a través del gránulo de vidrio. A continuación, haga clic en Analizar y seleccione Establecer escala.

Establezca el campo de distancia conocida en 3.000 micrómetros y haga clic en Aceptar. Elija un punto en un dispositivo que no oscile entre cuadros para que actúe como marcador y registre las coordenadas X e Y de este punto en la hoja de cálculo. Regrese a la ventana del software de análisis de imágenes y presione la tecla de flecha derecha para cambiar al siguiente cuadro. Señale nuevamente el marcador y registre las nuevas coordenadas X e Y en la hoja de cálculo.

Repita este proceso para todos los fotogramas y utilice los datos para analizar el movimiento del biorrobot según se describe en el protocolo de texto adjunto. Los esfuerzos estático y dinámico del actuador se extrajeron diariamente del esfuerzo superficial. El esfuerzo estático es el esfuerzo contráctil que las células ejercen sobre la superficie en estado de reposo, y el esfuerzo dinámico es el esfuerzo generado por las células durante la contracción máxima.

A medida que las células maduraban en cultivo, se observó un aumento gradual de los esfuerzos estáticos y dinámicos con el tiempo. Exhibieron una fuerza máxima de tracción celular de 50 milinewtons por metro y una fuerza máxima de contracción de aproximadamente 165 milinewtons por metro en el día seis. Paralelamente a los esfuerzos estáticos y dinámicos, los marcadores de maduración de cardiomiocitos, crecimiento y expansión celular, y conectividad intercelular también aumentaron hasta el día seis.

En función del análisis del video, aquí se muestra la comparación de la velocidad media de nado, la frecuencia de latidos y la distancia recorrida por cada latido para tres biorrobots con diferentes perfiles de nado. Aunque los biorrobots verticales tienen la frecuencia de latidos más baja, presentaron la mayor velocidad de nado y la mayor distancia recorrida. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo sembrar células musculares cardíacas en dispositivos microfabricados que podrían funcionar como actuadores biológicos y biorrobots.

El proceso de adquisición de imágenes y el posterior análisis de datos descritos en este video demuestran una forma práctica de caracterizar el comportamiento celular así como el rendimiento del dispositivo. Al llevar a cabo este procedimiento, es importante recordar que la vida útil de los cardiomiocitos es limitada y que la actividad de las células alcanza su punto máximo el sexto día, después del cual disminuye con el tiempo.