Name: Imágenes de células vivas de desgranulación plaquetaria y secreción bajo flujo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-10T10:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Aprende a estudiar la desgranulación y secreción plaquetaria en células vivas bajo flujo mediante microscopía de fluorescencia. Este método permite investigar el contenido subcelular en tiempo real para investigación mecanicista sobre trombosis y hemostasia.

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CM reconoce el apoyo financiero de la Organización Internacional del Paciente para las deficiencias del inhibidor C1 (HAEi), Stichting Vrienden van Het UMC Utrecht y la Fundación Landsteiner para la Investigación de la Transfusión Sanguínea (LSBR).

El comité médico ético local del centro médico de la universidad Utrecht aprobó el drenaje de la sangre para los propósitos ex vivo de la investigación, incluyendo los de este estudio. 1. Preparación de la solución <ol><li> Preparar un tampón de Tyrode del ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanosulfónico (HEPES) disolviendo HEPES 10 mM, Na2HPO4 0,5 mM, NaCl 145 mM, KCl 5 mM, MgSO $ ₄ $ 1 mM y D5- Glucosa en agua destilada. <ol><li> Hacer dos variantes de la memoria intermedia: establecer los niveles de pH en 6,5 y en 7,4, respectivamente. Hacer buffer fresco para cada día de experimentos. Suplemento con 10 ng / mL de prostaciclina cuando se indique. </li></ol></li><li> Preparar solución salina tamponada con TRIS (TBS) disolviendo Tris 50 mM y NaCl 150 mM en agua destilada y ajustar el pH a 9,0. </li><li> Preparar ácido citrato dextrosa (ACD) disolviendo 85 mM Tri-sodio citrato, 71 mM de ácido cítrico, y 111 mM D-glucosa en disAgua labrada </li><li> Preparar una solución fijadora mediante la adición de paraformaldehído (PFA) al 2% (v / v) al tampón de HEPES Tyrode, pH 7,4. Calentar para disolver (50 - 70 ° C) y ajustar el pH a 7,4. Alícuotas y almacenar a -20 ° C. Descongele a 37 ° C antes de usar. </li><li> Preparar tampón de bloqueo disolviendo albúmina de suero humano (HSA) al 1% (m / v) en tampón HEPES Tyrode, pH 7,4 </li><li> Hacer una solución de alcohol polivinílico añadiendo 4,8 g de alcohol polivinílico a 12 g de glicerol y mezclar bien. Añadir 12 ml de agua destilada y dejarla en un rotador a temperatura ambiente durante la noche. <ol><li> Añadir 24 ml de Tris-HCl 0,2 M, pH 8,5. Calentar a 50 ° C mientras se mezcla durante 30 min. Añadir 1,25 g de 1,4-diazabiciclo [2.2.2] octano (DABCO) y mezclar bien. Centrifugar a 1.500 xg durante 5 min. Alícuota del sobrenadante (1 ml es suficiente para 15-20 diapositivas) y almacenar a -20 ° C. Utilice las alícuotas una vez. </li></ol></li></ol> 2. Preparación del cristal de la cubierta <ol><li> Desgrasar la cubierta(25 x 50 mm ^ { 2} ) incubando durante la noche en ácido cromosulfúrico no diluido. Enjuagar los cristales de la cubierta con agua destilada y secarlos durante la noche a 60 ° C en un horno. </li><li> Adherir una tira de una película de parafina (10 x 15 cm 2 ) en la parte superior de un banco de laboratorio con una gota de agua y eliminar el aire alisando la película de parafina. Pipetee 80 μL de gotas de 10 μg / mL VWF o 100 μg / mL de fibrinógeno sobre la película de parafina. Coloque los vasos sobre las gotas; La solución de proteína se extenderá entre las dos superficies para cubrir toda la parte posterior del vidrio. Incubar durante 1,5 h a temperatura ambiente (RT). </li><li> Retire la película de parafina y bloquear los vidrios de cubierta colocándolos, con el lado recubierto hacia arriba en una placa de 4 pocillos con tampón de bloqueo. Incubar durante 1 ha 37 ° C o durante la noche a 4 ° C. Como control, bloquee un vidrio de cubierta que no haya sido recubierto con VWF o fibrinógeno. </li></ol> 3. Preparación de plasma rico en plaquetas (PRP) </p&gt; <ol><li> Recoger la sangre entera citratada (concentración final: 0,32% de citrato sódico (M / V)) por punción venosa. </li><li> Centrifugar la sangre durante 15 min a 160 xg y RT sin freno. Recoger el sobrenadante ( es decir, el PRP) con una pipeta Pasteur de plástico. NOTA: Después de la centrifugación, se pueden observar tres capas (de arriba hacia abajo): PRP, glóbulos blancos y glóbulos rojos. Asegúrese de no incluir las células blancas y rojas. Típicamente, se pueden recoger 3 ml de PRP después de la centrifugación de un tubo de sangre de 9 ml. </li><li> Continúe con la sección 4 si el experimento se realiza con plaquetas lavadas. Si se desea PRP, continúe con el siguiente paso. </li><li> Después de la recolección de PRP, centrifugar el resto de la sangre (que contiene el sedimento de glóbulos rojos) de nuevo durante 10 min a 2.000 xg sin freno. Recoger el sobrenadante que contiene el plasma pobre en plaquetas (PPP). NOTA: Típicamente, se pueden recoger 2 ml después de esta segunda etapa de centrifugación. </li><li> Cuente el número de pLatelets en el PRP en un analizador de células y diluirlo con el PPP (paso 3.4) hasta una concentración de 150.000 plaquetas / μl. NOTA: El volumen total de PRP diluido depende del recuento de plaquetas del donante. Los recuentos de plaquetas varían ampliamente entre los donantes, y la dilución de PRP requiere una evaluación individual. Los recuentos de plaquetas se consideran normales cuando están dentro de 150.000 y 450.000 plaquetas / μl. </li><li> Continúe con la sección 5. </li></ol> 4. Preparación de plaquetas lavadas <ol><li> Determine el volumen medio de plaquetas (MPV) en el PRP usando un analizador de células. NOTA: Este es un indicador de la pre-activación plaquetaria 11 . Un MPV normal para las plaquetas en reposo es 7,5-11,5 fL 11 . El MPV no debe aumentar en más de 1,5 fL durante el procedimiento de lavado de plaquetas. </li><li> Añadir un volumen 1/10 de ACD a PRP para prevenir la pre-activación de las plaquetas y centrifugar durante 15 min a 400 xg y RT sin freno. Quitar el suY volver a suspender el gránulo cuidadosamente en tampón HEPES Tyrode, pH 6,5, al volumen original de PRP. </li><li> Descongele una alícuota de prostaciclina añadiendo TBS a una concentración de 10 μg / mL; Mantenerlo en hielo. </li><li> Para prevenir la activación plaquetaria, añada prostaciclina a una concentración final de 10 ng / ml a las plaquetas re-suspendidas e inmediatamente centrifugue durante 15 min a 400 xg y RT sin freno. Se retira el sobrenadante y se vuelve a suspender el gránulo cuidadosamente en tampón HEPES Tyrode, pH 7,4. </li><li> Contar el número de plaquetas (paso 3.5) y determinar el cambio en MPV (paso 4.1) (el MPV no debe cambiar más de 1,5 fL). </li><li> Ajustar el número de plaquetas con el tampón HEPES Tyrode, pH 7,4, hasta una concentración de 150.000 plaquetas / μl. Dejar las plaquetas para recuperar durante 30 minutos a RT antes de los experimentos. Utilizar plaquetas lavadas para experimentos dentro de las 4 h después del aislamiento. </li></ol> 5. Montaje de la Cámara de Flujo 12 . Se puede usar una variedad de cámaras de flujo producidas comercialmente, siempre y cuando puedan contener un vidrio de cubierta, que preferentemente es removible para análisis adicionales. La cámara de flujo usada para los experimentos descritos está hecha de poli (metacrilato de metilo) para adaptarse con precisión a una etapa de inserción de microscopio. Contiene una entrada y salida ( Figura 1A - C , 1, 2), así como una conexión de vacío ( Figura 1A y C , 3). Una hoja de silicona personalizada ( Figura 1A y D , 4) se coloca en la parte superior. Dos recortes forman canales de vacío ( Figura 1A y D , 5) para fijar firmemente el vidrio de cubierta ( Figura 1A , 6) a la cámara. Un corte central forma el canal de flujo ( Figura 1A </strong&gt; Y D ; 7; 2,0 mm de ancho y 0,125 mm de altura). La entrada y la salida están conectadas al canal de flujo, y el vacío está conectado al canal de vacío. <ol><li> Cubra la parte superior de la cámara de flujo con agua destilada y coloque la hoja de silicona a medida con el lado suave hacia abajo sobre el agua. Flote la hoja en su posición eliminando el exceso de agua mientras mantiene la hoja en su posición. NOTA: Esta hoja de silicona es reutilizable (la silicona es conocida por sus propiedades inertes); Generalmente, no se ha observado que las plaquetas se unan a ella. Las hojas pueden limpiarse con detergente y reutilizarse hasta que el material se dañe ( es decir, desgarro, especialmente en el área entre canales). Generalmente, una hoja puede usarse durante 20 días con múltiples experimentos por día. </li><li> Incubar la cámara de flujo durante 1 h a 60 ° C para evaporar el agua residual para adherir firmemente la hoja de silicona a la cámara de flujo. </li><li> Con una pipeta Pasteur de plástico, agregue una gota deHEPES Tyrode&#39;s buffer, pH 7,4, en el canal de flujo. Coloque el cristal de cubierta (ver sección 2) con el lado recubierto hacia abajo, en el canal de flujo. Conecte la bomba de vacío a la conexión de vacío ( Figuras 1A y C ; 3). Aplicar ~ 10 kPa de presión. </li></ol> 6. Pre-tinción de las plaquetas y preparación de los anticuerpos <ol><li> Tinción de plaquetas <ol><li> Incubar las plaquetas lavadas con DAPI 10 μ g / mL durante 30 minutos a 37 ° C en la oscuridad. Para lavar el DAPI no unido y para prevenir la activación plaquetaria, añadir prostaciclina a una concentración final de 10 ng / mL e inmediatamente centrifugar durante 15 min a 400 xg y RT sin freno. </li><li> Reconstituir el sedimento de plaquetas en el tampón HEPES Tyrode, pH 7,4, a una concentración plaquetaria de 150.000 plaquetas / μl. </li></ol></li><li> Preparación de anticuerpos <ol><li> Mezclar anticuerpo marcado con biotina con estreptococos marcados con AlexaTavidina en una relación molar de 1: 1. Incubar durante un mínimo de 10 minutos a temperatura ambiente antes de usar (paso 7.6). NOTA: La eficiencia del etiquetado de biotina puede variar entre diferentes lotes. En caso de que haya problemas con la visualización de las moléculas diana, deben realizarse experimentos de control para confirmar la biotinilación exitosa, así como las propiedades de unión a diana del anticuerpo biotinilado específico. </li></ol></li></ol> 7. Perfusión <ol><li> Iniciar el microscopio de fluorescencia, así como el software del microscopio. Utilice los ajustes del microscopio que se muestran en la Tabla 1 . NOTA: Inicie el microscopio y los ajustes de grabación para la visualización de células vivas y el registro de las plaquetas y los anticuerpos y / o tintes marcados fluorescentemente elegidos cargando un experimento apropiado en el software del microscopio. Realizar experimentos de flujo a RT. </li><li> Bloquee el tubo de entrada conectando una jeringa de 10 ml a la tubería y aspirando 1% de HSA bloCking en el tubo de entrada. Incubar durante 15 min a RT. Enjuague el tubo de entrada aspirando el tampón de HEPES Tyrode, pH 7,4, en el tubo de entrada. </li><li> Conecte el tubo de entrada bloqueado y el tubo de salida no tratado, ambos con un diámetro de 1,02 mm y una longitud de ~ 20-30 cm a la entrada y salida de la cámara. Conecte una jeringa de 10 ml (o un volumen más bajo para mayor precisión) a la tubería de salida. Encienda la bomba de la jeringa. NOTA: El diámetro de la jeringa, en combinación con el caudal establecido en la bomba, determina el caudal volumétrico. Junto con el área superficial del canal de flujo, la velocidad de cizallamiento se puede calcular de acuerdo con la fórmula 13 abajo. Por lo tanto, es posible manipular la velocidad de cizalladura cambiando el caudal de la bomba de jeringa o alterando las dimensiones del canal de flujo. Una velocidad de corte de 800-1.600 s -1 típicamente modelos para el flujo sanguíneo arterial, mientras que 25 - 100 s-1 modelos de sangre venosafluir. Para esta configuración, un caudal de 7,5 μL / min da como resultado una velocidad de cizallamiento de 25 s -1 . Frecuencia de corte = 6Q / h 2 w en s -1 Donde: Q = caudal volumétrico (ml / s), h = altura del canal (cm) (0,0125 cm, es el espesor de la lámina de silicona), w = anchura del canal (cm) (0,2 cm en esta cámara). </li><li> Coloque una gota de aceite de inmersión en un objetivo 100X (amplificación total de 1.000 X) y monte la cámara en el microscopio con la superficie de vidrio hacia abajo. </li><li> Coloque el tubo de entrada en un tubo que contenga el tampón de HEPES Tyrode, pH 7,4. Tire manualmente del émbolo de la jeringa conectado a la tubería de salida y tire de la solución a través de la cámara para eliminar el aire del sistema. Coloque la jeringa en la bomba de la jeringa ( Figura 1B y C ; 8) y haga funcionar la bomba brevemente para apretar el émbolo y asegurar un flujo estable. </li><li> Añadir anticuerpos y / o colorantes a la suspensión de plaquetas o PRP,Mezclar con una pipeta de plástico, y transferir la mezcla a un tubo de 1,5 ml. NOTA: Para una perfusión típica de 30 minutos a una velocidad de corte de 25 s-1 (7,5 μl / min), se necesita un mínimo de 225 μl de suspensión de plaquetas. Los anticuerpos utilizados para los resultados representativos se muestran en la Tabla 2 . </li><li> Mueva el tubo de entrada, mientras se aprieta, desde el tampón de HEPES Tyrode, pH 7,4, a un tubo de 1,5 ml que contiene PRP o las plaquetas lavadas y los anticuerpos y / o colorantes ( Figura 1B y C ; 9). NOTA: Es importante que, al transferir el tubo, el tubo se comprima (presionando el aire) para evitar que el aire entre en el tubo. Es posible tratar las plaquetas adherentes con una variedad de reactivos en una etapa subsiguiente moviendo el tubo de entrada a otro tubo de una manera similar. En la Tabla 3 se proporciona una lista de reactivos potencialmente útiles. </li><li> Seleccione la opción &quot;visualización en vivo&quot;N &quot;en el software, enfocar el microscopio en la superficie del vidrio cubierto y comenzar la bomba a una velocidad de corte de 1.600 s-1 (484 μl / min) hasta que las plaquetas lleguen a la cámara de flujo En este momento, Reducir la velocidad de cizalladura a 25 s-1 cambiando los ajustes de la bomba de la jeringa a un caudal de 7,5 μl / min. </li><li> Supervise la superficie del lado recubierto del vidrio de la cubierta, espere hasta que la primera plaquita empiece a adherirse, enfoque el microscopio sobre esta plaquita e inicie la grabación iniciando el experimento en el software. Consulte la Tabla 1 para ver los ajustes de grabación utilizados aquí. </li><li> Siga la grabación en vivo visualmente. Después de 30 minutos, detenga la bomba de la jeringa. NOTA: Asegúrese de que las plaquetas permanezcan enfocadas durante el transcurso del experimento. Típicamente, 20-30 plaquetas se fijan en el campo de visión con una ampliación de 1.000 X; Esto es alrededor de 2.000 a 3.000 plaquetas en todo el canal de flujo. </li><li> Fijación medianteLa cámara de flujo (opcional). <ol><li> Cuando el flujo se detiene después de detener la bomba de la jeringa, transfiera el tubo de entrada (libre de aire) a la solución fijadora. Reinicie la bomba y fluya el tampón de fijación a través del canal durante un mínimo de 10 min a la misma velocidad de flujo que se menciona en el paso 7.8. </li></ol></li><li> Retire la cámara del microscopio, limpie el aceite de inmersión del vidrio, desconecte el vacío y retire cuidadosamente el vidrio de la cubierta de la cámara con una aguja de 18 G. NOTA: Evite que el cristal de cubierta rompa y dañe la hoja de silicio. </li><li> Coloque la diapositiva de la cubierta (con las celdas dirigidas hacia arriba) en una placa de 4 pocillos sobre un tejido, previamente humedecida con agua destilada. NOTA: Esto evita que el vidrio de cubierta se adhiera a la superficie del pozo y evite el secado. </li><li> Pipetee 750 μl de solución fijadora en la parte superior del cristal de cubierta e incube durante 1 h a temperatura ambiente. En el caso de que las muestras no puedan ser analizadas directamente,Almacenarlos en PFA al 0,5% (diluido con tampón HEPES Tyrode, pH 7,4) a 4 ° C para asegurar una fijación estable. Proceda a la sección 8 para procesar el cristal de la tapa para obtener imágenes. </li><li> Después del uso, enjuague la cámara, el tubo y la lámina con agua destilada e incube durante la noche en una solución detergente. Antes de reutilizar la cámara y otros componentes, aclarar con agua destilada. </li><li> Guardar los archivos de datos crudos del microscopio que contienen todos los metadatos. Cuando sea necesario, exporte las películas a .MOV, h.264 comprimido o .AVI sin comprimir. Guarde marcos separados como archivos JPEG o TIF. </li></ol> 8. Preparación de Muestras para Microscopía de Fluorescencia Confocal <ol><li> Transferir los vidrios de tapa a las nuevas placas de 4 pocillos y enjuagar 5 veces con 3 mL de tampón de HEPES Tyrode, pH 7,4. Añadir 3 ml / pocillo de tampón de bloqueo e incubar durante 1 h a RT. </li><li> Quitar el tampón de bloqueo; Añadir 3 ml / pocillo de glicina al 0,15% (M / V) en tampón HEPES Tyrode, pH 7,4; E incubar durante 15 min en RT. </li><li> Eliminar la solución de glicina y lavar 5 veces en 3 ml / pocillo de tampón de bloqueo. Opcionalmente, añadir anticuerpos conjugados con fluoróforo diluidos en tampón de bloqueo para tinción adicional. Incubar durante 1 h a RT en la oscuridad. </li><li> Lavar 5 veces con tampón de bloqueo y 2 veces con agua destilada. Seque el vidrio quitando el exceso de líquido con un tejido (de los bordes hacia adentro), sin tocar las células. </li><li> Pipetee 60 μL de solución de alcohol polivinílico sobre una lámina de microscopio. Coloque el vidrio de cubierta, con las células hacia abajo, en la parte superior de la gota y dejar que el alcohol de polivinilo se extiende entre las dos superficies. Incubar durante la noche a RT en la oscuridad. </li><li> Analizar las células por microscopía confocal [ 14] . </li><li> Guarde los archivos de datos sin formato de los datos de la pila grabada que contengan todos los metadatos. Cuando sea necesario, procese los archivos de datos sin formato en archivos MOV, h.264 comprimidos o .AVI sin comprimir. Guarda pilas separadas como archivos JPEG o TIF. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En todo el mundo, la trombosis es una causa principal de muerte y morbilidad, y las plaquetas juegan un papel central en su desarrollo. Este trabajo describe un método para la obtención de imágenes de células vivas de la desgranulación plaquetaria bajo flujo. Generalmente se supone que, cuando las plaquetas se activan, todos los contenidos granulares se liberan directamente en la solución. Los resultados que acompañan sugieren que esto no es necesariamente el caso. Durante la adhesión y la desgranulación, las plaquetas ...

Las plaquetas son células anucleadas que circulan en el torrente sanguíneo. Su función principal es sellar las brechas vasculares en los sitios de lesión y prevenir la pérdida de sangre. En estos sitios de lesión, las fibras de colágeno subendoteliales quedan expuestas y son posteriormente cubiertas por la proteína multimérica, el factor de von Willebrand (VWF). VWF interactúa con las plaquetas en circulación en un mecanismo que depende de la glicoproteína Ibα-IX-V complejo en la superficie celular 1 , ralentizar la velocidad de las plaquetas. Esto es particularmente importante a altas velocidades de cizallamiento. Las plaquetas sufren posteriormente cambios morfológicos mientras reciben impulsos de activación del colágeno. Esto conduce a la propagación irreversible y, finalmente, a la agregación plaquetaria. Ambos procesos dependen de la secreción del contenido de gránulos para facilitar la diafonía plaquetaria-plaquetas. Entre otros, los gránulos alpha de plaquetas contienen fibrinógeno y VWF para ayudar a la adhesión de las plaquetas y para puentearPlaquetas juntas de una manera dependiente de la integrina. Los gránulos densos de plaquetas contienen compuestos inorgánicos 2 , incluyendo calcio y difosfato de adenosina (ADP), que ayudan a reforzar la activación plaquetaria. Además, las plaquetas contienen mediadores de la inflamación (alérgica) 3 , proteínas 4 de control del complemento, y factores de angiogénesis 5 , 6 , planteando la cuestión de si y cómo estos contenidos se liberan diferencialmente en condiciones variables. Desde la década de 1980, el estudio de la función plaquetaria en los modelos de flujo ha sido valiosa para la investigación de los mecanismos trombóticos [ 7] . Desde entonces, se ha hecho mucho progreso técnico y modelos de flujo que incluyen formación de fibrina se desarrollan actualmente para ensayar el potencial hemostático de los concentrados plaquetarios terapéuticos ex vivo 8 oInvestigar la influencia de las alteraciones en las tasas de cizallamiento en la morfología del trombo [ 9] . Las diferencias en los mecanismos moleculares y biológicos celulares que impulsan la adhesión estable y la formación de trombos fisiológicos (hemostasia) frente a la formación de trombos patológicos (trombosis) pueden ser muy sutiles y motivar el desarrollo de modelos de flujo que permitan la visualización en tiempo real de estos subcelulares Procesos. Un ejemplo de un proceso para el cual tal disposición sería valiosa es la (re) distribución de polifosfato intracelular y el reclutamiento de factores de coagulación para descubrir el impacto dependiente del tiempo que esto tiene sobre la ultraestructura de fibrina 10 . Los estudios se limitan a menudo a análisis de los puntos finales. El objetivo principal del método descrito es permitir la investigación visual en tiempo real de procesos subcelulares dinámicos que tienen lugar durante la activación plaquetaria bajo flujo.

<table><tbody><tr><td>ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfónico (HEPES)&nbsp;</td><td>VWR</td><td>441476L</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S-0876</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>31248</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Merck KGaA</td><td>1.05886</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosa</td><td>Merck KGaA</td><td>1.04074</td><td></td></tr><tr><td>Prostaciclina&nbsp;</td><td>Cayman Chemical</td><td>18220</td><td></td></tr><tr><td>Citrato trisódico</td><td>Merck KGaA</td><td>1.06448</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico&nbsp;</td><td>Merck KGaA</td><td>1.00244</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Menzel-Gl&auml; ser</td><td>BBAD02400500#A</td><td>24 x 50 mm, Nº 1 = 0,13 - 0,16 mm de espesor.</td></tr><tr><td>Ácido cromosulfúrico (2% CrO3)</td><td>Riedel de Haen</td><td>07404</td><td>CAS [65272-70-0].</td></tr><tr><td>Factor de Von Willebrand (VWF)</td>Laboratorio de investigación de enzimas de fibrinógeno <td>purificado</td><td></td><td></td>internamente</tr><tr><td></td><td></td><td>FIB3L</td><td></td></tr><tr><td>Plato de 4 pocillos, sin tratar</td><td>Thermo Scientific</td><td>267061</td><td></td></tr><tr><td>Fracción de albúmina sérica humana V</td><td>Haem Technologies Inc.</td><td></td><td></td>823022</tr><tr><td>Tubos de extracción de sangre, 9 mL, 9NC Citrato de sodio para la coagulación 3,2%</td>Analizador de células de <td>455322</td><td></td> <td>Greiner Bio-One</td></tr><tr><td>&nbsp;</td>Analizador <td></td><td>de hematología CELL-DYN</td> de <td>Abbott Diagnostics</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma</td><td>30525-89-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de jeringa</td><td>Harvard Apparatus, Holliston, MA</td><td>Harvard apparatus 22</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 10 mL con 14,5 mm de diámetro</td><td>BD biosciences</td><td>305959</td><td>Luer-Lok jeringa</td></tr><tr><td>Anti-CD63-biotin&nbsp;</td><td>Abcam&nbsp;</td><td></td><td></td>AB134331</tr><tr><td>Anti-CD62P-biotina&nbsp;</td><td>R& D Systems</td><td>Dy137</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-fenilindol diclorhidrato (DAPI)</td><td>Polysciences Inc.&nbsp;</td><td>9224</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidina, Alexa Fluor 488 conjugado</td><td>Thermo Scientific</td><td>S11223&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Aceite de inmersión</td><td>Zeiss</td><td>444963-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Solución detergente</td><td>Unilever, Biotex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>56-40-6&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol polivinílico</td><td>Sigma</td><td>9002-89-5</td><td>Mowiol 40-88.</td></tr><tr><td>Clorhidrato de Tris</td><td>Sigma</td><td>1185-53-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1,4-diazabicíciclo[2.2.2]octano (DABCO)</td><td>Sigma</td><td>280-57-9</td><td></td></tr><tr><td>Ovejas Anti-hVWF pAb</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>AB9378</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488-NHS</td><td>Thermo Scientific</td><td>A20000</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15523-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>Película Parafinn</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td>4 pulgadas x 125 pies Rollo.</td></tr><tr><td>Lámina de silicona no reforzada</td><td>Nagor</td><td>NA 500-1</td><td>200 mm x 150 mm x 0,125 mm.</td></tr><tr><td>Lámina de silicona cortada a medida con canales de perfusión y vacío</td><td>de fabricación</td><td></td> propia <td>Fabricado en lámina de silicona no reforzada (Nagor, NA 500-1)</td></tr><tr><td>Tubos de 1,5 mL</td><td>Eppendorf AG</td><td>T9661-1000AE</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente</td><td>Zeiss Observer Z1&nbsp;</td><td></td><td>Equipado con luces LED de excitación.</td></tr><tr><td>Software de microscopio</td><td>Zeiss ZEN 2</td><td>edición</td><td></td>azul</tr><tr><td>Aguja de 18 G (18 G x 1 1/2")</td><td>BD biosciences</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Riedel de Haen</td><td>31248375</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roche</td><td>10708976</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta pasteur de plástico</td><td>VWR</td><td>612-1681</td><td>&nbsp; 7 mL no estériles, graduados hasta 3 mL.</td></tr><tr><td>Tubo de silicona</td><td>VWR</td><td>228-0656</td><td>Diámetro interior. x Diámetro exterior x Espesor de pared = 1,02 x 2,16 x 0,57 mm.</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>Thermo Scientific</td><td>ABAA000001##12E</td><td>76 x 26 x 1 mm, bordes rectificados 45 &deg;, extremo esmerilado.</td></tr></tbody></table>

imágenes de células vivas de desgranulación plaquetaria y secreción bajo flujo

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Las plaquetas de la sangre son actores esenciales en la hemostasia, la formación de trombos para sellar las brechas vasculares. También están implicados en la trombosis, la formación de trombos que ocluyen la vasculatura y lesionan los órganos, con consecuencias potencialmente mortales. Esto motiva la investigación científica sobre la función de las plaquetas y el desarrollo de métodos para rastrear los procesos celulares y biológicos a medida que se producen en condiciones de flujo. Una variedad de modelos de flujo están disponibles para el estudio de la adhesión de las plaquetas y la agregación, dos fenómenos clave en la biología de plaquetas. Este trabajo describe un método para estudiar la desgranulación de plaquetas en tiempo real bajo flujo durante la activación. El método hace uso de una cámara de flujo acoplada a una instalación de bomba de jeringa que se coloca bajo un microscopio de fluorescencia de LED de gran campo, invertido. La configuración descrita aquí permite la excitación simultánea de múltiples fluoróforos que son suministrados por anticuerpos marcados fluorescentemente o fluorescentesColorantes. Después de experimentos de formación de imágenes de células vivas, los vidrios de cubierta se pueden procesar y analizar posteriormente usando microscopía estática ( es decir, microscopía confocal o microscopía electrónica de barrido).

La figura 1 muestra imágenes de la cámara de flujo y disposición experimental; La posición y dimensiones de la lámina de silicio; Y conexiones de tubería. La figura 2 proporciona detalles sobre las dimensiones de la cámara de flujo. La Figura 3 y la Pelıcula 1 muestran una serie cronológica de imágenes de adhesión y esparcimiento de plaquetas sobre VWF inmovilizado. CD63 es una prot...

Este trabajo describe un método basado en microscopía de fluorescencia para el estudio de la adhesión plaquetaria, la extensión y la secreción bajo flujo. Esta plataforma versátil permite la investigación de la función plaquetaria para la investigación mecánica sobre trombosis y hemostasia.

Imágenes de células vivas de desgranulación plaquetaria y secreción bajo flujo

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

El objetivo general de este experimento es rastrear la degranulación y secreción de plaquetas bajo flujo utilizando imágenes de células vivas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de plaquetas. La principal ventaja de esta técnica es que permite una investigación versátil del contenido de las plaquetas a nivel subcelular en células vivas.Aunque este método puede proporcionar información sobre la función plaquetaria, también puede aplicarse a otros tipos celulares, como los mastocitos. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a problemas con el aislamiento de plaquetas en una forma de preactivación. Tuvimos la idea original para este método cuando nos dimos cuenta de que la secreción plaquetaria solo podía evaluarse en etapas finales.Las imágenes en tiempo real proporcionan información sobre la cinética de liberación de los gránulos plaquetarios. El procedimiento de aislamiento de plaquetas será demostrado por Silvia Pignatelli, una estudiante de nuestro instituto. A continuación, Arjan Barendrecht demostrará los experimentos de imágenes en tiempo real.Para comenzar, desengrase las láminas de vidrio incubándolas durante la noche en ácido cromosulfúrico sin diluir. Al día siguiente, enjuáguelas con agua destilada. Luego, colóquelas durante la noche a 60 grados Celsius en una estufa para secarlas.A continuación, coloque una gota de agua sobre una superficie de laboratorio y adhiera encima una tira de película de parafina de 10 centímetros por 15 centímetros, eliminando el aire entre la superficie y la película. Luego, pipetee gotas de 80 microlitros de factor de von Willebrand a 10 microgramos por mililitro o de fibrinógeno a 100 microgramos por mililitro sobre la película de parafina. Coloque las cubreobjetos secas sobre las gotas e incúbelas durante una hora y media a temperatura ambiente.A continuación, agregue tres mililitros de tampón de bloqueo en cada pocillo de una placa de cuatro pocillos. Transfiera las cubetas con la cara recubierta hacia arriba a los pocillos individuales de la placa. Incúbuelas durante la noche a cuatro grados Celsius.Centrifugar nueve mililitros de sangre total citratada durante 15 minutos a 160 × g sin interrupción. Luego, usar una pipeta Pasteur de plástico para recoger el sobrenadante que contiene el plasma rico en plaquetas. Añadir una parte de dextrosa citrato ácido por cada nueve partes de plaquetas en volumen para prevenir la preactivación plaquetaria.Luego, centrifugue las plaquetas durante 15 minutos a 400 veces G sin freno. A continuación, retire el sobrenadante, dejando un botón de plaquetas. Luego, resuspenda cuidadosamente el botón en tampón HEPES-Tyrode a un pH de 6,5 hasta el volumen original de la muestra de plaquetas.Luego, agregue prostaciclina a las plaquetas resuspendidas. Centrifugue inmediatamente la muestra y luego elimine el sobrenadante. Resuspenda cuidadosamente el sedimento en tampón HEPES-Tyrode a un pH de 7.4.A continuación, coloque las plaquetas lavadas en un analizador celular y cuente el número de plaquetas. Ajuste la cantidad de plaquetas en la muestra a una concentración de 150.000 plaquetas por microlitro con tampón HEPES Tyrode a un pH de 7,4. Después de la resuspensión, deje que las plaquetas se recuperen durante 30 minutos a temperatura ambiente antes del experimento.Cubra la parte superior de la cámara de flujo con agua destilada y coloque una lámina de silicona personalizada con el lado liso hacia abajo sobre el agua. Flote la lámina en su posición eliminando el exceso de agua mientras mantiene la lámina en su lugar. Incube la cámara de flujo durante una hora a 60 grados Celsius para evaporar el agua residual y adherir firmemente la lámina de silicona a la cámara de flujo.Con la pipeta Pasteur de plástico, agregue una gota de tampón HEPES Tyrode a un pH de 7,4 sobre el canal de flujo. Luego coloque el cubreobjetos preparado con el lado recubierto hacia abajo sobre el canal de flujo. Encienda la bomba de vacío hasta alcanzar una presión de aproximadamente 10 kilopascales y conecte la bomba de vacío a la conexión de vacío de la cámara de flujo.Añada 10 microgramos por mililitro de tinción con DAPI a las plaquetas lavadas y envuelva el tubo que contiene las plaquetas con papel de aluminio. Incube luego durante 30 minutos a 37 grados Celsius. Para prevenir la activación plaquetaria, añada prostaciclina a una concentración final de 10 nanogramos por mililitro y centrifugue inmediatamente las plaquetas durante 15 minutos a 400 veces G sin usar el freno, para eliminar el DAPI no unido.Reconstituir el sedimento de plaquetas y el tampón HEPES Tyrode a un pH de 7,4 hasta el volumen original con una concentración de 150.000 plaquetas por microlitro. A continuación, encender el microscopio de fluorescencia y cargar el software del microscopio. Configurar los parámetros de imagen según se describe en la tabla uno del protocolo de texto adjunto.Bloquee el tubo de entrada conectando una jeringa de 10 mililitros y aspirando tampón de bloqueo dentro del tubo de entrada. Incube durante 15 minutos a temperatura ambiente y luego enjuague el tubo de entrada aspirando tampón HEPES Tyrode 7,4 dentro del tubo de entrada. Conecte el tubo de entrada bloqueado y el tubo de salida sin tratar a la entrada y salida de la cámara.Luego conecte la jeringa de 10 mililitros al tubo de salida. Coloque una gota de aceite de inmersión sobre un objetivo de 100 aumentos y monte la cámara en el microscopio con la superficie de vidrio orientada hacia abajo. A continuación, coloque el tubo de entrada en un tubo que contiene tampón HEPES Tyrode a un pH de 7,4.Extraiga manualmente el émbolo de la jeringa conectada al tubo de salida para hacer pasar la solución a través de la cámara y eliminar el aire del sistema. A continuación, coloque la jeringa en la bomba de jeringa y active la bomba brevemente para ajustar el émbolo y asegurar un flujo estable. Con el sistema de flujo ya listo, agregue los anticuerpos y/o colorantes a la suspensión de plaquetas y mezcle cuidadosamente.Luego, comprima el tubo de entrada y muévalo desde el tampón hasta el tubo que contiene las plaquetas marcadas. Seleccione la visualización en vivo en el software. Enfoque el microscopio en la superficie del cubreobjetos e inicie la bomba a 484 microlitros por minuto.Encienda la bomba hasta que las plaquetas alcancen la cámara de flujo. A continuación, reduzca la velocidad de flujo a 7,5 microlitros por minuto. Monitoree la superficie del cubreobjetos.Una vez que la primera plaqueta comience a adherirse, enfoque el microscopio en esta plaqueta e inicie la grabación activando el experimento en el software. Grabe durante 30 minutos y luego detenga la bomba de jeringa. Guarde los archivos de datos brutos del microscopio que contienen todos los metadatos.Si es necesario, exporte las películas en formato MOV H 264 comprimido o AVI sin comprimir. Guarde cuadros individuales como archivos JPEG o TIF. Al terminar la adquisición de imágenes, retire la cámara del microscopio, limpie el aceite de inmersión del vidrio, desconecte el vacío y retire cuidadosamente el cubreobjetos de la cámara con una aguja de calibre 18.Coloque la laminilla con las células orientadas hacia arriba en una nueva placa de cuatro pocillos sobre un tejido previamente humedecido con agua destilada. Luego, agregue 750 microlitros de una solución fijadora encima del cubreobjetos e incube durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad. En caso de que las muestras no puedan analizarse directamente, almacénelas en paraformaldehído al 0,5% a cuatro grados Celsius para garantizar una fijación estable.Esto muestra la serie temporal de la adhesión y expansión de plaquetas sobre portaobjetos de vidrio recubiertos con factor de von Willebrand inmovilizado. En verde se muestra CD63, una proteína transmembrana que se moviliza hacia la superficie plaquetaria de manera dependiente del tiempo. De forma similar, en naranja, la P-selectina es también una proteína transmembrana insertada en la membrana de los gránulos alfa intracelulares que atrapan plaquetas.Tras un experimento de flujo, se puede utilizar microscopía de fluorescencia confocal para obtener una serie de inclinación de la adhesión plaquetaria. Aquí se observa que CD63 se localiza principalmente en el granulomero central, mientras que la P-selectina se distribuye en todo el cuerpo celular y parece concentrarse en los bordes. En estos experimentos, las plaquetas, que no poseen ADN nuclear, se incubaron previamente con DAPI, que aparece en azul.En este caso, el DAPI tiñe los polifosfatos y los gránulos densos. La movilización dependiente del tiempo del CD63 hacia la superficie de las plaquetas aparece posteriormente como tinción verde. A pesar de los signos evidentes de liberación de gránulos densos, el análisis a nivel de célula individual muestra que el polifosfato se retiene dentro o en el exterior de estas plaquetas.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en seis horas para cuatro experimentos de flujo individuales. Al intentar este procedimiento, es importante prevenir la preactivación de las plaquetas. Esto puede lograrse mediante una manipulación cuidadosa de la suspensión celular.Tras seguir este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos como la microscopía confocal para obtener una mayor comprensión sobre la distribución tridimensional de las moléculas diana. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo estudiar la función de las plaquetas bajo flujo a nivel de célula individual.

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Investigación

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Biología

La cascada de adhesión de las plaquetas se lleva a cabo en presencia de flujo de tensiones, no es un factor en cuenta en convencional (estática) y placa-ensayos. Este artículo informa sobre un ensayo de agregación plaquetaria utilizando una placa de microfluidos bien en formato de imitar las condiciones fisiológicas de flujo de corte.

Adhesión y agregación plaquetaria bajo flujo con células de microfluidos de flujo

Aquí se presenta una técnica experimental de microscopía intravital de fluorescencia para visualizar heterotípicas plaquetas neutrófilos interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos. Esta tecnología microscópica será valiosa para estudiar el mecanismo molecular de la enfermedad vascular y para poner a prueba los agentes farmacológicos bajo condiciones fisiopatológicas.

Imágenes en tiempo real de heterotypic plaquetas neutrófilos Interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos

Los leucocitos atraviesan la monocapa endotelial usando el paracelular o la ruta transcelular. Hemos desarrollado un ensayo sencillo para seguir la distribución de la unión endógena VE-cadherina y PECAM-1 durante la migración de leucocitos transendotelial bajo flujo fisiológico de discriminar entre las dos vías de transmigración.

Imágenes en tiempo real de la célula-célula cruces endoteliales Durante neutrófilos Transmigración Bajo Flujo Fisiológica

La transfusión y hemostasia de plaquetas se modeló utilizando cámaras de reconstitución de sangre y flujo microfluídico para investigar la función de las plaquetas de los bancos de sangre. Los datos demuestran las consecuencias de la lesión por almacenamiento de plaquetas sobre la hemostasia, in vitro.

Flujo de microfluidos Cámaras utilizando sangre reconstituida a Modelo Hemostasia y Transfusión de Plaquetas<em&gt; In Vitro</em

En este trabajo se describe un modelo experimental de la hemostasia que mide simultáneamente la función plaquetaria y la coagulación. Plaquetas y fibrina de fluorescencia se mide en tiempo real, y la tasa de adhesión plaquetaria, la tasa de coagulación, y el inicio de la coagulación se determinan. El modelo se utiliza para determinar las propiedades procoagulantes de plaquetas bajo flujo en concentrados para la transfusión.

Una Cámara de microfluidos Modelo de Flujo de Transfusión de Plaquetas y hemostasia Medidas de deposición de plaquetas y la formación de fibrina en tiempo real

Leucocitos con avidez interactúan con las células vasculares y las plaquetas después de lesión de pared del recipiente o durante la inflamación. Aquí, describimos un análisis sencillo basado en el flujo laminar para caracterizar los mecanismos moleculares que subyacen a las interacciones entre los leucocitos y sus socios celulares.

Ensayos de flujo laminar para investigar el reclutamiento leucocitario en cultivos de células vasculares y las plaquetas adherentes

Describimos un método en solución para aplicar una cizalla uniforme a los receptores de superficie plaquetaria usando viscometry de placa cónica. Este método también se puede utilizar más ampliamente para aplicar cizallamiento a otros tipos de células y fragmentos de células y no necesita apuntar a un par de ligando-receptor específico.

Un ensayo de cizalla uniforme para los receptores humanos de plaquetas y de superficie celular a través de Viscometry de placa cónica

Describimos aquí el método para obtener imágenes de megacariocitos y proplatados en la médula del hueso del cráneo de ratones vivos utilizando microscopía de dos fotones.

In Vivo Imágenes de dos fotones de megacariocitos y proplatatos en la médula ósea del cráneo del ratón

La formación de plaquetas procoagulantes se ha correlacionado con un mayor riesgo de trombosis. Aquí se presenta un protocolo preciso para aislar plaquetas lavadas de la sangre humana, destinado a cuantificar la exposición a la fosfatidilserina y la liberación de microvesículas, que son características distintivas de las plaquetas procoagulantes.

Caracterización de plaquetas procoagulantes mediante la medición de la exposición a fosfatidilserina y la liberación de microvesículas de plaquetas humanas purificadas

Se puede evaluar la función plaquetaria bajo flujo y se puede modelar la reanimación hemostática simulada utilizando un dispositivo microfluídico, que tiene aplicaciones en medicina traumatológica y transfusional.

Microfluídica en la evaluación de la función plaquetaria

La citometría de flujo multicolor para plaquetas puede identificar nuevos subtipos de plaquetas dentro de las subpoblaciones de plaquetas clásicas, como las plaquetas en reposo, agregativas, procoagulantes y apoptóticas. Esto permite la comparación de diferentes patrones de subpoblación inducidos por varios agonistas plaquetarios. Aquí, se describe en detalle un procedimiento para establecer un panel de citometría de flujo multicolor.

Análisis de subpoblaciones de plaquetas mediante citometría de flujo multicolor

Aprende a estudiar la desgranulación y secreción plaquetaria en células vivas bajo flujo mediante microscopía de fluorescencia. Este método permite investigar el contenido subcelular en tiempo real para investigación mecanicista sobre trombosis y hemostasia.

Imágenes de células vivas de desgranulación plaquetaria y secreción bajo flujo

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