Name: Determinación de alta afinidad anticuerpo-antígeno Cinética de unión usando cuatro plataformas Biosensor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: Aprenda a medir la cinética de unión anticuerpo-antígeno de alta afinidad utilizando cuatro plataformas de biosensor diferentes. Este método compara Biacore T100, ProteOn XPR36, Octet RED384 e IBIS-MX96 para obtener datos cinéticos confiables en descubrimiento de fármacos.

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Los autores agradecen a Noah Ditto y Adam Miles de asistencia técnica en el IBIS MX96.

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</ol>

las tasas de publicación de este video-artículo fueron pagados por Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals.

Nuestro estudio comparación cabeza a cabeza muestra que cada plataforma biosensor tiene sus propias fortalezas y debilidades. A pesar de que los perfiles de unión de los anticuerpos son similares por comparación visual (Figuras 3 - 6), y el orden de rango de las constantes de velocidad cinética adquirida son altamente consistentes a través de los instrumentos (Figura 7), nuestros resultados muestran que los instrumentos SPR-basa con fluidos de flujo continuo) son mejores en la resolución de interacciones de alta afinidad con velocidades de disociación lentas. Deriva hacia arriba durante la fase de disociación se observa en conjuntos de datos (por ejemplo, mAb 2, mAb 5, y mAb 9; Figura 5) generado por el BLI instrumento-fluídica libres. Este hallazgo puede atribuirse en gran parte a la evaporación de la muestra con el tiempo en la microplaca, lo que es una limitación principal del sistema. Con esta limitación inherente, el tiempo experimental también se limita a menos de 12 h; por lo tanto, los experimentos se programan con shveces Örter (Asociación 500 s y 30 min de disociación) en comparación con los de las otras plataformas (asociación 10 min y 45 min de disociación). Sin embargo, la reducción del tiempo experimental no parece mitigar el impacto de la evaporación en la calidad de datos / consistencia, ya que las constantes de velocidad generados por el instrumento basado en el BLI muestran menos linealidad como resultado de las fluctuaciones en algunas de las velocidades de disociación (Figura 8C ). Además de la evaporación de la muestra, las diferencias en los reactivos de captura utilizados pueden también han contribuido a las diferencias en los resultados obtenidos. Mientras que la proteína A / G se usó en las tres plataformas de SPR basados ​​en fluídicos, los sensores AHC se utilizaron en la plataforma BLI no-fluídica. Dado que la proteína A / G es probable que tenga una afinidad más débil para los mAbs que lo hace el AHC, una superficie biosensor basado en anticuerpos, las velocidades de disociación del complejo mAb-antígeno de la / las superficies de proteína A G puede aparecer artificialmente más rápido que aquellos obtenido a partir de la superficie AHC. Esta posibilidad es apoyada by los datos experimentales que muestran que los valores fuera de la tasa generados por la plataforma BLI fueron consistentemente inferiores a los obtenidos a partir de los otros instrumentos (Figura 7, línea roja). Sin embargo, la plataforma BLI tiene diferentes ventajas sobre las otras plataformas. Por ejemplo, es muy flexible con respecto a la elección del sensor y configuración de ensayo debido a los diversos sensores de pre-revestido para su uso inmediato. En nuestros experimentos, el uso de los sensores de AHC eliminó la necesidad de pasos ligando de inmovilización, reduciendo el tiempo de preparación. Además, la plataforma de BLI requiere mucho menos mantenimiento en comparación con las otras plataformas de fluidos SPR, que cuentan con configuraciones de tubos y conmutador de valor complicados. Esta característica es una ventaja para los experimentos que implicaban muestras crudas que pueden causar problemas de obstrucción y de contaminación. Como la demanda de la identificación eficiente, rápida y precisa de candidatos terapéuticos aumenta, la necesidad de birendimiento osensor también está aumentando. Entre las cuatro plataformas de biosensores, el rendimiento del biosensor capaz de 96-ligando de impresión de matriz es el más alto, seguido por el biosensor acoplada a un entrecruzándose formato de 36-ligando y el biosensor basado en BLI con lectura simultánea de 16 canales, que en última instancia aumentar el número de interacciones medidos en un único ciclo de unión a 96, 36 y 16, respectivamente. Estas capacidades de rendimiento son significativamente más altas que la de la plataforma de SPR tradicional, que está limitado por tener sólo cuatro células de flujo conectados por un único flujo en serie. Desde nuestros experimentos incluyeron un conjunto relativamente pequeño de la muestra de 10 mAb evaluados en varias densidades de superficie con tiempos largos de disociación, los rendimientos instrumentales jugaron un papel moderado en la determinación de la eficiencia de los experimentos. No hubo diferencias significativas en los tiempos experimentales de las tres plataformas de alto rendimiento, y en todos los casos se realizaron los experimentos en un día. Por otra parte, los experimentos tradicionales SPR de flujo en serie requieren 3 días para completar, a pesar de la automatización del walk-away de adquisición de datos después de la instalación. En otros estudios que implican un gran número de muestras (es decir, en los cientos o miles), para los propósitos de clasificación de disociación / detección cinética o de agrupación de epítopos, el rendimiento se convierte en un factor crítico. Aunque el rendimiento en el IBIS MX96 es órdenes de magnitud más alta que la de los otros biosensores y por lo tanto es una elección óptima para estos propósitos, tiene una serie de deficiencias. En particular, la matriz de impresión por el CFM muestra grandes inconsistencias de superficie (Figura 1) y la reducción de reproducibilidad de datos (Figura 8D y 8E). Para mediciones cinéticas exactas, la cantidad de ligando en la superficie biosensor es un parámetro crítico que debe ser controlado para asegurar que las respuestas de unión no se vean perturbadas por factores secundarios, tales comola transferencia de masa o impedimento estérico. Para el Biacore T100 y ProteOn XPR36, los niveles óptimos R L se determinaron sobre la base del cálculo estándar de los valores max conjunto R como se describe en el artículo de investigación 17. Por otro lado, para las plataformas Octeto RED384 y IBIS MX96, los niveles de mAb de captura se alcanzaron empíricamente usando una serie de anticuerpos de 2 veces diluidas en serie a veces constantes. La falta de conocimiento o el control de la etapa de captura resultó en una superficie de alta densidad y las señales de alta unión de respuesta (Figura 2) que puede haber comprometido la exactitud de las constantes cinéticas de velocidad. Además, la separación de la impresora desde el detector SPR también presenta un desafío cuando se realizan varias mediciones de ciclo de unión que implican regeneraciones. La única manera de realizar la configuración de la cinética de multi-ciclo fue a través de acoplamiento de aminas directa de los mAbs, en contraposición a capturar a través del mAb Fc por la proteína inmovilizada A / Gsuperficie en las otras tres plataformas biosensor. Como resultado, se requiere un experimento regeneración de exploración adicional para determinar las condiciones óptimas de regeneración. El resultado de esta configuración se relacionó con un 90% menor actividad superficial observada ~ en comparación con el método de captura de Fc (Figura 9), además de un tiempo de experimentación más tiempo. Para ejecutar el método de captura de Fc, se adoptó un enfoque cinética de un solo ciclo alternativo. Este enfoque implica la inyección secuencial de analito a concentraciones crecientes sin regeneración entre cada inyección (Figura 2). Este enfoque altamente conveniente, pero menos comúnmente aplicado no sólo acorta el tiempo experimental y redujo el consumo de reactivos, sino que también produjo constantes cinéticas muy similares a las de los otros biosensores (Figura 7). Por lo tanto, la aplicación de este enfoque cinética de ciclo único supera la limitación de configuración inherente del instrumento y presenta unaoportunidad para la obtención de alta resolución constantes de velocidad cinética en una forma de alto rendimiento. A pesar del rendimiento de ser una limitación importante en el Biacore T100, nuestros resultados muestran colectivamente que generó los datos más consistentes con la más alta calidad. Esto fue seguido por la ProteOn XPR36, que tiene ~ 10 veces mayor rendimiento. Su capacidad para generar datos de alta calidad se convierte en una ventaja cuando la caracterización de las interacciones anticuerpo-antígeno de alta afinidad que pueden ser técnicamente difícil cuando se alcanzan los límites de detección de los instrumentos. Si bien las limitaciones sistemáticas en la instrumentación del octeto RED384 obstaculizan la medición precisa de las constantes de velocidad de disociación (es decir, por debajo de la sensibilidad para resolver suficiente degradación de señal para lenta fuera de tarifas), tanto el Biacore T100 y ProteOn XPR36 puede proporcionar sensible y fiable detección para la diferenciación.

La adquisición de parámetros cinéticos fiables para caracterizar las interacciones anticuerpo-antígeno es un componente esencial del proceso de descubrimiento y desarrollo de fármacos1. Los biosensores de resonancia óptica de plasmón de superficie (SPR), el "estándar de oro" para la detección en tiempo real de estas interacciones, se han utilizado durante aproximadamente dos décadas para permitir la selección temprana de candidatos a anticuerpos terapéuticos que cumplan con los criterios2,3. Además de proporcionar una clasificación de afinidad de los candidatos a anticuerpos mediante el cribado rápido de unión de sobrenadantes crudos4, y rigurosas determinaciones de constantes cinéticas de preparaciones purificadas5, los biosensores pueden diferenciar aún más la actividad funcional de los candidatos principales a través de estudios de agrupación de epítopos6,7. 
Para satisfacer la creciente demanda de productos basados en anticuerpos para diversas indicaciones terapéuticas8, en los últimos años se han desarrollado una amplia variedad de innovadores instrumentos biosensores que aumentan la eficiencia de la identificación y caracterización de candidatos9,10. Estos instrumentos difieren en el diseño de la configuración de los canales microfluídicos y/o en los principios ópticos implicados en la detección de interacciones biomoleculares. En concreto, el Octet RED38411, ProteOn XPR3612 e IBIS MX967 han ampliado el número de interacciones medidas en un solo ciclo de enlace a 16, 36 y 96 respectivamente, lo que representa mejoras significativas en el rendimiento con respecto a la plataforma Biacore tradicional. Aunque todas estas plataformas de biosensores proporcionan datos cinéticos esenciales para caracterizar las interacciones anticuerpo-antígeno, difieren en la configuración experimental y los procedimientos operativos debido a las variaciones en las configuraciones instrumentales. Por ejemplo, en la plataforma de matriz de imágenes SPR del IBIS MX96, el paso de inmovilización del ligando multiplex se realiza en modo fuera de línea en un dispositivo de impresión externo separado del detector7,13; Por el contrario, las otras tres plataformas de biosensores utilizan una configuración "todo en uno", en la que la adición de un componente a la superficie del sensor, ya sea el reactivo de activación, el ligando o el analito, se registra en tiempo real y a través de comandos preprogramados en orden secuencial. En el Octet RED384, una característica única de esta plataforma basada en interferometría de biocapa (BLI) es la disponibilidad de biosensores de fibra óptica prerrevestidos para uso inmediato de "inmersión y lectura14, lo que elimina la necesidad de preparación de la superficie del ligando y pasos de iniciación/acondicionamiento, que a menudo se requieren para los chips sensores en plataformas basadas en SPR. El diseño libre de fluidos de este instrumento también simplifica la mecánica y evita problemas de obstrucción y contaminación cuando se trata de muestras crudas. Con el novedoso diseño fluídico entrecruzado de 6 x 6 en el ProteOn XPR36, se puede implementar un enfoque cinético de "un solo disparo" cambiando los canales de flujo entre direcciones horizontales y verticales para crear 36 puntos de interacción15. En lugar de evaluar la cinética de unión de un ligando o concentración de analito a la vez, como se hace en la plataforma Biacore T100 de flujo en serie tradicional, este enfoque ofrece la capacidad de monitorear hasta 36 interacciones diferentes simultáneamente en un solo ciclo de unión. 
A pesar de sus diferencias, estas cuatro plataformas de biosensores son ampliamente utilizadas por muchos laboratorios en todo el mundo. Para los nuevos usuarios con poca experiencia práctica en biosensores, decidir qué instrumento usar puede ser una tarea desafiante dadas las diferencias en el diseño del instrumento. Para determinar el instrumento más apropiado para sus propósitos de investigación, factores como la calidad de los datos, la consistencia del rendimiento, el rendimiento, la facilidad de operación y el consumo de materiales deben considerarse colectivamente. Si bien varios estudios de referencia han explorado la variabilidad de las constantes de velocidad cinética obtenidas de múltiples laboratorios y biosensores5,16, un estudio comparativo cara a cara publicado recientemente aborda aún más los factores sistemáticos que influyen en la fiabilidad de los datos desde el punto de vista del rendimiento instrumental17,18. Los protocolos suministrados en este video se centran en la configuración experimental y los procedimientos en detalle, y se acompañan del artículo de investigación titulado, "Comparación de plataformas de biosensores en la evaluación de cinéticas de unión de antígeno anticuerpo de alta afinidad"17. Estos protocolos están destinados no solo a ayudar a los nuevos usuarios de biosensores a implementar estos instrumentos para sus fines de investigación, sino también a proporcionar información adicional para los usuarios actuales de biosensores con respecto a los desafíos técnicos y las consideraciones en los diseños experimentales para evaluar las interacciones anticuerpo-antígeno de alta afinidad.

<table><tbody><tr><td>Sistema Biacore T100</td><td>GE Healthcare</td><td>28975001</td><td>El sistema T100 se ha actualizado a T200</td></tr><tr><td>CM5 Sensor Chip&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100012</td><td></td></tr><tr><td>BIAevaluación&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>versión 4.1</td></tr><tr><td>Software de control Biacore T100</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>El software de control T100 se ha actualizado a T200</td></tr><tr><td>Kit de acoplamiento de amina</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100050&nbsp;</td><td>Contiene: 750 mg de clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), 115 mg de N-hidroxisuccinimida (NHS), 10,5 mL 1,0 M etanolamina-HCl pH 8,5&nbsp;</td></tr><tr><td>Búfer HBS-EP+ 10 veces;</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100669</td><td>Solución madre concentrada&nbsp;</td></tr><tr><td>Viales de plástico, diámetro exterior 7 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100212&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tapones de goma, tipo 3</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100502</td><td></td></tr><tr><td>Viales y tapones de plástico, diámetro exterior 11 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100214&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de matriz de interacción de proteínas ProteOn XPR36</td><td>Bio-Rad</td><td>1760100</td><td></td></tr><tr><td>Software ProteOn Manager&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1760200</td><td>Versión 3.1.0.6</td></tr><tr><td>GLM Chip de sensor</td><td>Bio-Rad</td><td>1765012</td><td></td></tr><tr><td>Kit de acoplamiento de aminas</td><td>Bio-Rad 1762410</td><td></td><td>Incluye EDAC (EDC), sulfo-NHS, etanolamina HCl&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de Regeneración y Acondicionamiento y Tampones</td><td>Bio-Rad</td><td>1762210</td><td>Incluye 1 tampón de glicina (pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0), y NaOH, SDS, HCl, ácido fosfórico, NaCl; 50 mL cada solución&nbsp;</td></tr><tr><td>Tampón PBS/Tween/EDTA de 2 L</td><td>Bio-Rad</td><td>1762730</td><td>Incluye solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4, 0,005% Tween 20, 3 mM EDTA&nbsp;</td></tr><tr><td>Octeto RED384 Sistema</td><td>Fort&eacute; </td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de análisis de datos</td> biológicos <td>Fort&eacute; </td><td></td> Bio <td>versión 9.0.0.4</td></tr><tr><td>Inmersión y lectura Anti-hIgG Fc Capture (AHC) Biosensores</td><td>Fort&eacute; Bio</td><td>18-5060</td><td>Una bandeja de 96 biosensores&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa inferior inclinada de 384 pocillos&nbsp;</td><td>Fort&eacute; Bio</td><td>18-5080</td><td></td></tr><tr><td>Dispensador Biosensor Fort</td><td>&eacute; Bio</td><td>18-5016</td><td></td></tr><tr><td>Tampón Kinetics 10x</td><td>Fort&eacute; Bio</td><td>18-1092</td><td>10x concentración. Contiene ProClin 300.</td></tr><tr><td>Sistema IBIS MX96 SPRi</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfluídica Microfluídica Impresora de Microspotter de Flujo Continuo (CFM)</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td>Versión 2.0</td></tr><tr><td>Chip SensEye COOH-G</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td>1-09-04-004</td></tr><tr><td>Software de análisis de datos</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td>versión 6.19.3.17</td></tr><tr><td>Software</td> <td>de análisis de datos SPRintWasatch Microfluidics</td><td></td><td>versión 6.15.2.1</td></tr><tr><td>Depurador 2</td><td>Software</td><td></td> BioLogic <td>versión 2</td></tr><tr><td>Proteína recombinante Pierce A/G</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21186</td><td></td></tr></tbody></table>

determinación de alta afinidad anticuerpo-antígeno cinética de unión usando cuatro plataformas biosensor

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

biosensores ópticos etiqueta libre son poderosas herramientas en el descubrimiento de fármacos para la caracterización de interacciones biomoleculares. En este estudio, se describe el uso de cuatro plataformas de biosensores utilizados rutinariamente en nuestro laboratorio para evaluar la afinidad de unión y la cinética de diez anticuerpos de alta afinidad monoclonales (mAbs) contra proproteína convertasa subtilisina humana Kexin tipo 9 (PCSK9). Mientras tanto Biacore T100 y ProteOn XPR36 se derivan de la Resonancia bien establecida Plasmon Superficie tecnología (SPR), el primero tiene cuatro células de flujo conectados por la configuración de flujo en serie, mientras que el último presenta 36 puntos de reacción en paralelo a través de una improvisada 6 x 6 entrecruzado configuración de los canales de microfluidos. El IBIS MX96 también opera basado en la tecnología de sensor SPR, con una función de proyección de imagen adicional que proporciona la detección en la orientación espacial. Esta técnica de detección acoplada con el flujo Microspotter continuo (CFM) se expande el rendimiento significativamente por correonabling impresión array multiplex y la detección de 96 deportes de reacción simultáneamente. En contraste, el Octeto RED384 se basa en el principio óptico biocapa Interferometría (BLI), con sondas de fibra óptica que actúa como el biosensor para detectar patrón de interferencia cambia en las interacciones de unión en la superficie de la punta. A diferencia de las plataformas basadas en SPR, el sistema de BLI no se basa en fluidos de flujo continuo; en cambio, las puntas de los sensores recogen lecturas mientras están sumergidos en soluciones de analito de una microplaca de 384 pocillos durante la agitación orbital. Cada una de estas plataformas de biosensores tiene sus propias ventajas y desventajas. Para proporcionar una comparación directa de la capacidad de estos instrumentos para proporcionar datos cinéticos de calidad, los protocolos descritos ilustran experimentos que utilizan el mismo formato de ensayo y los mismos reactivos de alta calidad para caracterizar la cinética de anticuerpo-antígeno que se ajustan a la sencilla 1: modelo de interacción molecular 1 .

La Figura 1 muestra la imagen matriz de anticuerpos de la los niveles de mAb manchado CFM y por los dos métodos de inmovilización, y la Figura 2 muestra los sensogramas de unión correspondientes generados en el MX96 desde el ciclo de múltiples cinética y mediciones cinéticas la de ciclo único en estas matrices de mAb . La unión y las curvas cinéticamente empotrados desde múltiples superficies recubiertas de anticuerpos generados en las cuatro plataformas de biosensores en tiempo real se muestra en las Figuras 3 - 6. La Figura 7 muestra la comparación de las tasas de cinética final y constantes de unión de equilibrio obtenidos del análisis global de estas curvas de unión. La asociación individual (k a), la disociación (k d), y el equilibrio (K D) las constantes de unión se presentan en la Tabla 1. Para demostrar la variabilidad de los conjuntos de datos generados dentro del mismo instrumento, <strong&gt; Figura 8 muestra gráficos de k a, k d, y K D a diferentes densidades de superficie mAb, y la Figura 9 compara además las actividades de unión calculados de las superficies de mAb a través de las plataformas de biosensor. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig1.jpg" /> Figura 1. Multiplex Ligando Arrays de amina acoplada-(A) y Fc-capturado (B) Anticuerpo Superficies de CFM de impresión en el IBIS MX96. Las imágenes de las matrices impresas se muestran en los paneles de la izquierda, donde las zonas grises cerrados por cuadrados rojos indican la presencia de anticuerpos. Los interspots más oscuros situados entre los puntos de anticuerpos activos se utilizan para la resta de referencia. Cada columna contiene un anticuerpo impreso a las concentraciones de titulación se identifican a continuación y a la izquierda de la imagen. Las cantidades de los anticuerpos impresos cuantificados mediante el cálculo de la diferenc en turnos a granel entre los lugares activos y de referencia se muestran en los paneles de la derecha. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig2.jpg" /> Figura 2. Comparación de tiempo real Encuadernación sensogramas de Multi-ciclo (A) y un solo ciclo (B) Los experimentos cinéticos en el IBIS MX96. Las inyecciones secuenciales de PCSK9 humano a concentraciones crecientes a través de las matrices de 10 x 8 de anticuerpos se observan por encima de cada segmento sensograma correspondiente. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig3.jpg" /> <st1 cinéticos de ajuste del modelo de superposiciones en el Biacore T100: rong&gt; Figura 3. sensogramas de los anticuerpos capturados Interactuar con PCSK9 humano y 1 Encuadernación. Las interacciones se evalúan sobre alto (paneles superiores), mediano (paneles medios), y (paneles inferiores) de bajos superficies densidad. Las líneas negras lisas superpuestas representan el ajuste cinética de las señales de respuesta de unión a diferentes concentraciones PCSK9 humanos (líneas de color) a un 1: modelo de interacción 1. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig4.jpg" /> 1 cinéticos de ajuste del modelo de superposiciones en la ProteOn XPR36: Figura 4. sensogramas de los anticuerpos capturados Interactuar con PCSK9 humano y 1 Encuadernación. Las interacciones se evalúan sobre alto (paneles superiores), medium- (paneles medios), y (paneles inferiores) de bajos superficies densidad. Las líneas negras lisas superpuestas representan el ajuste cinética de las señales de respuesta de unión a diferentes concentraciones PCSK9 humanos (líneas de color) a un 1: modelo de interacción 1. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig5.jpg" /> 1 cinéticos de ajuste del modelo de superposiciones en el Octeto RED384: Figura 5. sensogramas de los anticuerpos capturados Interactuar con PCSK9 humano y 1 Encuadernación. Las interacciones se evalúan sobre alto (paneles superiores), mediano (paneles medios), y (paneles inferiores) de bajos superficies densidad. Las líneas rojas superpuestas representan el ajuste cinética de las señales de respuesta de unión a diferentes concentraciones PCSK9 humano (líneas de color) a un 1:<html> 1 modelo de interacción. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig6.jpg" /> 1 cinéticos de ajuste del modelo de superposiciones en el IBIS MX96: Figura 6. sensogramas de los anticuerpos de amina acoplados a (A) y capturados-Fc (B) que interactúa con PCSK9 humano y 1 Encuadernación. Los perfiles de unión están organizados como 10 x 8 paneles que siguen el mapa de placa de matriz en la Figura 1. Las líneas negras representan las señales de respuesta de unión registrados a diferentes concentraciones PCSK9 humanos, y las líneas rojas superpuestas representan las curvas ajustadas. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> gura 7&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55659 / 55659fig7.jpg&quot; /&gt; Figura 7. Comparación de la Asociación k a (A), la disociación k d (B), y Equilibrio K D (C) constantes de unión generados por las plataformas Four biosensor. Los parámetros cinéticos se derivan de análisis global de las curvas de unión de las Figuras 3 - 6. Los instrumentos están representados como sigue: Biacore T100 (azul), ProteOn XPR36 (verde), el octeto RED384 (rojo), IBIS MX96, amina acoplada (púrpura), y IBIS MX96, Fc-capturados (naranja). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig8.jpg" /> Figura 8. Comparación de la consistencia de las constantes cinéticas a través de múltiples densidades de superficie anticuerpo en la Biak<html> mineral de T100 (A), ProteOn XPR36 (B), el octeto RED384 (C), IBIS MX96, amina acoplados a (D), y IBIS MX96, Fc-capturado (E). Los parámetros cinéticos k A (arriba sub-paneles), k d (sub-paneles medios), y K D (inferiores sub-paneles) se derivan de análisis de grupo a una densidad de superficie de anticuerpo individual. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig9.jpg" /> Figura 9. actividades de unión de las superficies de anticuerpos y sus desviaciones estándar (barras de error) en las cuatro plataformas de biosensor. Los valores se calculan utilizando las ecuaciones descritas en los artículos de investigación 17.large.jpg&quot; target = &#39;_ blank&#39;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td> k a </td><td> k d </td><td> KD </td></tr><tr><td> (M -1 s -1) </td><td> (s -1) </td><td> (Nuevo Méjico) </td></tr><tr><td> 1 mAb </td><td> 11,7 (7,8) x 10 5 </td><td> 4,89 (4,18) x 10 -5 </td><td> 0,052 (0,05) </td></tr><tr><td> 2 mAb </td><td> 1,53 (0,28) x 10 5 </td><td> 1,30 (1,54) x 10 -5 </td><td> 0,092 (0,12) </td></tr><tr><td> mAb 3 </td><td> 11,4 (8,3) x 10 5 </td><td> 27,6 (11,0) x 10 -5 </td><td> 0,333 (0,20) </td></tr><tr><td> 4 mAb </td><td> 3,61 (1,6) x 10 5 </td><td> 20,1 (12,3) x 10 -5 </td><td> 0,659 (0,54) </td></tr><tr><td> mAb 5 </td><td> 0,59 (0,21) x 10 5 </td><td> 3,46 (2,50) x 10 -5 </td><td> 0,663 (0,46) </td></tr><tr><td> 6 mAb </td><td> 1,19 (0,78) x 10 5 </td><td> 7,21 (3,83) x 10 -5 </td><td> 0,894 (0,64) </td></tr><tr><td> mAb 7 </td><td> 1,29 (0,53) x 10 5 </td><td> 16,4 (5,63) x 10 -5 </td><td> 1,57 (1,02) </td></tr><tr><td> mAb 8 </td><td> 4,02 (2,23) x 10 5 </td><td> 22,8 (10,7) x 10 -5 </td><td> 0,768 (0,68) </td></tr><tr><td> mAb 9 </td><td> 4,20 (2,13) x 10 5 </td><td> 6,67 (4,3) x 10 -5 </td><td> 0,197 (0,16) </td></tr><tr><td> mAb 10 </td><td> 1,20 (0,49) x 10 5 </td><td> 12,5 (7,64) x 10 -5 </td><td> 1,27 (0,80) </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Modelo de Interacción 1: Precios cinéticos y constantes de equilibrio de 10 mAb obtuvieron ajustando global de las curvas de unión de cuatro instrumentos biosensores para el 1 de unión.

Se describe aquí protocolos para la medición de antígeno-anticuerpo de afinidad y la cinética utilizando cuatro plataformas de biosensores de uso común vinculante.

Determinación de alta afinidad anticuerpo-antígeno Cinética de unión usando cuatro plataformas Biosensor

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

El objetivo de este estudio con biosensores es comparar la capacidad de las cuatro plataformas de biosensores utilizadas habitualmente para obtener datos cinéticos de calidad y proporcionar información sobre los desafíos técnicos y consideraciones en el diseño experimental para evaluar interacciones de alta afinidad entre anticuerpos y antígenos. Este estudio responde preguntas clave en el campo del descubrimiento de fármacos sobre la selección de plataformas de biosensores y formatos de ensayo que permitan obtener resultados más confiables al evaluar candidatos terapéuticos a base de anticuerpos. La ventaja principal de este estudio es que ofrece una comparación directa y exhaustiva de las distintas plataformas de biosensores en cuanto a consistencia, calidad de los datos y eficiencia operativa.La demostración en video de los cuatro protocolos es fundamental, ya que ayuda a los nuevos usuarios con poca experiencia práctica a aprender cómo configurar experimentos en estos instrumentos. Para mediciones cinéticas en el Biacore T100, haga clic en Archivo, Abrir nuevo método y abra el archivo de método. Revise los parámetros en el método.En Tipos de Ciclo, establezca el tiempo de contacto en 220 segundos para la captura 1 a través de la ruta de flujo 2, 110 segundos para la captura 2 a través de la ruta de flujo 3, y 55 segundos para la captura 3 a través de la ruta de flujo 4. El caudal es de 10 microlitros por minuto para todos los ciclos de captura. Seleccione la Muestra 1 y marque la solución de muestra como una variable.A continuación, establezca el tiempo de contacto en 600 segundos y el tiempo de disociación en 2 700 segundos a través de las trayectorias de flujo 1, 2, 3, 4. El caudal se ajusta a 30 microlitros por minuto. Luego, seleccione Regeneración 1, introduzca glicina HCl pH 1,5 en el campo de solución y establezca el tiempo de contacto en 20 segundos a través de las trayectorias de flujo 1, 2, 3, 4.En Configuración de Variables, ingrese concentraciones tituladas por dilución seriada de 100 nanomolar a 6,25 nanomolar para el ciclo 1-3, de 50 nanomolar a 3,12 nanomolar para el ciclo 4-8, y de 5 nanomolar a 0,323 nanomolar para el ciclo 9-10. En Configuración de Ejecución, seleccione la ruta de flujo de detección 2-1, 3-1, 4-1 y luego haga clic en siguiente. Verifique el cebado antes de la ejecución y luego haga clic nuevamente en siguiente.Seleccione la Muestra y el Bastidor de Reactivos 1 y defina la ubicación de los reactivos. Pipete los reactivos en los viales individuales de muestra según corresponda e inserte el bastidor en el instrumento. Haga clic en Expulsar Bastidor para abrir la puerta del compartimento de la bandeja de muestras y luego inserte el bastidor de muestras en el instrumento.Luego, haga clic en Iniciar e introduzca un nombre de experimento para guardarlo y comenzar la corrida. Para las mediciones cinéticas en el ProteOn XPR36, inicie la inmovilización seleccionando Protocolos y luego Muestras. Defina EDC/Sulfo-NHS como activador en los pozos H1-H6, proteína A/G como ligando en G1-G6, etanolamina como desactivador en F1-F6, glicina como regenerador en E1-E6, PBS-T-EDTA como blanco en D1-D6, muestra del anticuerpo monoclonal X como ligando en C1-C6, y PCSK9 humano como analito en los pozos B1-B6.Seleccione Pasos y luego haga doble clic en Inmovilización en el editor de protocolos. Los pasos incluyen tres inyecciones horizontales sucesivas de EDC/Sulfo-NHS, proteína A/G y etanolamina un molar. Cada inyección debe tener un caudal de 30 microlitros por minuto y un tiempo de contacto de 300 segundos.A continuación, haga clic en Regenerar. Inyecte tres pulsos de 18 segundos de glicina a 100 microlitros por minuto en ambas direcciones, horizontal y vertical. A continuación, aplique dos pulsos de 60 segundos de PBS-T-EDTA a 25 microlitros por minuto, también en ambas direcciones.A continuación, haga clic en Ligando e inyecte el anticuerpo monoclonal 1, el anticuerpo monoclonal 2 en dirección vertical, utilizando un flujo de 25 microlitros por minuto y un tiempo de contacto de 160 segundos. Después de hacer clic en Analito, inyecte cinco concentraciones de PCSK9 humano en un tampón en blanco sobre seis canales horizontales simultáneamente. Utilice 40 microlitros por minuto durante 600 segundos de tiempo de asociación, seguido de 2.700 segundos de tiempo de disociación.A continuación, haga clic en Regenerar e inyecte dos pulsos de 18 segundos de glicina a 100 microlitros por minuto en ambas direcciones, horizontal y vertical. Luego, prepare las muestras y los reactivos en una placa de 96 pocillos según las posiciones definidas para los reactivos. Transfiera la placa al instrumento y luego haga clic en la pestaña Ejecutar, seleccione el protocolo y haga clic en Iniciar.Se demuestra la inyección paralela de seis agujas en la grabación de datos experimentales en vivo. Para las mediciones cinéticas en el Octet RED384, configure el método experimental haciendo primero clic en Experimento, seguido por Asistente para nuevo experimento, Nuevo experimento cinético y luego Cinética básica en el software de adquisición de datos. A continuación, haga clic en Modificar placas y cambie de 96 pocillos a 384 pocillos tanto en la Placa 1 como en la Placa 2.Defina los tipos de muestras y sus posiciones en la placa según se describe en el protocolo escrito. Diríjase a la definición del ensayo para establecer la configuración experimental. La configuración experimental se define con un tiempo de línea base de 30 segundos, un tiempo de regeneración de 30 segundos, un tiempo de equilibrio de 18 segundos, una carga con un tiempo de 200 segundos, un tiempo de asociación de 500 segundos y un tiempo de disociación de 1.800 segundos.La velocidad de agitación se establece en 1.000 RPM. Para agregar los pasos a la lista de pasos del ensayo, primero haga clic en un paso y luego haga clic en los pocillos ubicados en la placa de muestra o en la placa de reactivo. Primero, introduzca las instrucciones de equilibrio y regeneración para acondicionar los sensores de captura anti-Fc humano mediante tres ciclos de inmersiones de 15 segundos en glicina alternadas con inmersiones de 15 segundos en KB 1X.Luego, introduzca las instrucciones de carga para capturar las muestras de anticuerpos monoclonales en los sensores de captura anti-Fc humano durante 200 segundos. A continuación, introduzca las instrucciones de línea base para establecer la señal de interferometría de capa bioactiva durante 60 segundos antes del paso de asociación. Ingrese el paso de asociación para sumergir los sensores en pozos que contienen concentraciones variables de PCSK9 humano durante un período de asociación de 500 segundos.Ingrese al paso de disociación sumergiendo los sensores unidos a PCSK9 en nuevos pocillos de KB 1X durante un período de disociación de 1.800 segundos. Finalmente, para el paso de regeneración, sumerja los sensores con anticuerpo monoclonal unido a PCSK9 en pocillos de glicina con dos pulsos de 18 segundos entre cada ciclo de unión. Vaya a Revisar Experimentos, desplácese por los pasos y luego haga clic en el botón verde abrir para abrir el compartimento de la muestra.Transfiera las placas de muestra al instrumento. Diríjase a Ejecutar Experimentos, ingrese un tiempo de retraso de 60 segundos y agite la placa de muestra mientras espera. Establezca la temperatura de la placa en 25 grados Celsius, ingrese el nombre del experimento y luego presione Ejecutar. Se muestra aquí la recopilación de datos en tiempo real.Para mediciones cinéticas de múltiples ciclos en el IBIS-MX96, instale el chip sensor en el microdispensador de flujo continuo. Abra el software CFM2.0, luego haga clic en Cargar Configuración y 96 Acoplamiento de Aminas. Coloque las dos placas de muestra y reactivo en la impresora CFM.Para crear la matriz de anticuerpos, pulse Ejecutar para iniciar la impresora y entregar el EDC/Sulfo-NHS en la mitad superior de la placa de reactivos al sensor utilizando 48 microcanales y ciclarlos sobre la superficie del sensor durante cinco minutos. Entregue las muestras de anticuerpos monoclonales en la mitad superior de la placa fuente al sensor, y cicléelas sobre las superficies activadas durante 10 minutos. Luego, entregue el tampón de inmovilización desde un tubo cónico de 50 mililitros sobre la superficie de anticuerpos durante cinco minutos.Coloque el chip sensor impreso en el instrumento. En el software de control, haga clic en Archivo, Abrir medición, Medición existente, y seleccione el archivo de método. Transfiera el chip sensor impreso al instrumento.En el menú general, seleccione G-System Prime bajo secuencia de sistema completo. Luego, seleccione G-Quench para desactivar las superficies de anticuerpos monoclonales inyectando 150 microlitros de etanolamina uno molar. En Ciclo de Análisis, seleccione A-AP Standard Run bajo Secuencias IBIS.Establezca 1.0 minuto para la línea base, 10.0 minutos para la asociación y 90 pasos para la disociación a una velocidad de ocho microlitros por segundo. Dentro de los ciclos, inyecte PCSK9 humano una concentración a la vez, tras cinco inyecciones de tampón. Regenere las superficies de anticuerpo monoclonal con glicina entre cada ciclo de unión.Se muestran los sensoriogramas de unión registrados con superposiciones ajustadas al modelo cinético uno a uno para los anticuerpos que interactúan con la PCSK9 humana en cuatro instrumentos. Los perfiles de unión de los anticuerpos a múltiples densidades son similares entre los instrumentos. Aunque las constantes de velocidad asociadas con cada uno de los anticuerpos variaron entre los instrumentos, sus órdenes de clasificación se mantuvieron en su mayoría iguales.Se investigó la reproducibilidad y consistencia de las afinidades en las tasas cinéticas sobre múltiples superficies de anticuerpos. Como se muestra aquí, se observó una fuerte linealidad para todas las constantes de velocidad generadas mediante el Biacore T100 y el ProteOn XPR36. Sin embargo, las constantes de velocidad generadas por el Octet RED384 fueron menos lineales debido a fluctuaciones en algunas de las tasas de disociación.Esto se debió posiblemente a la evaporación de las muestras con el tiempo en la microplaca. Las constantes de velocidad generadas por el IBIS-MX96 también fueron menos lineales debido a fluctuaciones en las heterogeneidades de la superficie. Las actividades de unión de anticuerpos asociadas con la mayoría de los sistemas fueron consistentes, mientras que se observó una actividad aproximadamente diez veces menor para el método de acoplamiento por amina en el IBIS-MX96.Esto posiblemente se debió a la inactivación del anticuerpo, o a la generación de orientaciones de anticuerpos que no favorecían la unión al antígeno. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo configurar experimentos en cada una de las cuatro plataformas de biosensores, y de cómo seleccionar la tecnología de biosensor adecuada para su propio propósito de investigación. Nuestro estudio comparativo directo muestra que cada plataforma de biosensor tiene sus propias ventajas y desventajas.A pesar de ciertas limitaciones sistemáticas inherentes en los instrumentos, el orden directo de las constantes de velocidad de asociación y disociación estuvo altamente correlacionado entre estos instrumentos. Con el fin de clasificar candidatos, suponiendo que el número de muestras y la cantidad de materiales no sean factores limitantes, cualquiera de estos instrumentos puede utilizarse, ya que pueden diferenciar los anticuerpos de manera comparable, independientemente del instrumento empleado. Existe un equilibrio entre la fiabilidad de los datos y el rendimiento de las muestras.Biacore T100, seguido de ProteOn XPR36R, mostró la mejor calidad y consistencia de los datos. Por otro lado, Octet RED384 e IBIS-MX96 demuestran alta flexibilidad y rendimiento, con ciertas limitaciones en la precisión y consistencia de los datos. Para estudios que requieran detección sensible y fiable, cualquiera de los dos sistemas, Biacore T100 o ProteOn XPR36, es el más adecuado.Para estudios en los que la velocidad es un factor crítico y se involucra un gran número de muestras, se prefiere cualquiera de los equipos Octet Red384 o IBIS-MX96. Los instrumentos con flujo continuo de fluido X proporcionan datos de alta calidad para resolver interacciones con tasas de disociación lentas. La limitación principal del instrumento BRI fluid ex-a-fray es la evaporación de la muestra con el tiempo en la microplaca, lo que puede provocar una deriva ascendente que compromete la precisión de los datos.

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Investigación

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