Determinación de alta afinidad anticuerpo-antígeno Cinética de unión usando cuatro plataformas Biosensor

El objetivo de este estudio de biosensores es comparar la capacidad de las cuatro plataformas de biosensores utilizadas habitualmente para proporcionar datos cinéticos de calidad y proporcionar información sobre los desafíos técnicos y las consideraciones en los diseños experimentales para evaluar las interacciones anticuerpo-antígeno de alta afinidad. Este estudio responde a preguntas clave en el campo del descubrimiento de fármacos para la selección de plataformas de biosensores y formatos de ensayo que permitan obtener los resultados más fiables a la hora de evaluar candidatos a anticuerpos terapéuticos. La principal ventaja de este estudio es que proporciona una comparación directa y completa de las distintas plataformas de biosensores, en lo que respecta a la consistencia de los datos, la calidad y la eficiencia operativa.

La demostración en vídeo de los cuatro protocolos es fundamental, ya que ayuda a los nuevos usuarios con poca experiencia práctica a aprender a configurar experimentos con estos instrumentos. Para las mediciones cinéticas en el Biacore T100, haga clic en Archivo, Abrir nuevo método y abra el archivo de método. Revise los parámetros del método.

En Tipos de ciclo, establezca el tiempo de contacto en 220 segundos para la captura 1 sobre la ruta de flujo 2, 110 segundos para la captura 2 sobre la ruta de flujo 3 y 55 segundos para la captura 3 sobre la ruta de flujo 4. El caudal es de 10 microlitros por minuto para todos los ciclos de captura. Seleccione Muestra 1 y compruebe la solución de muestra como una variable.

Luego, establezca el tiempo de contacto en 600 segundos y el tiempo de disociación en 2, 700 segundos sobre la ruta de flujo 1, 2, 3, 4. El caudal se establece en 30 microlitros por minuto. A continuación, seleccione Regeneración 1, ingrese glicina HCl pH 1.5 en el campo de solución y establezca el tiempo de contacto en 20 segundos sobre la ruta de flujo 1, 2, 3, 4.

En Configuración variable, introduzca concentraciones de valoración dobles de 100 nanomolares a 6,25 nanomolares para el ciclo 1-3, de 50 nanomolares a 3,12 nanomolares para los ciclos 4-8 y de 5 nanomolares a 0,323 nanomolares para el ciclo 9-10. En Ejecución de configuración, elija la ruta de flujo de detección 2-1, 3-1, 4-1 y, a continuación, haga clic en siguiente. Marque cebar antes de ejecutar y, a continuación, vuelva a hacer clic en siguiente.

Seleccione Sample and Reactive Rack 1 (Gradilla de muestras y reactivos 1) y defina la ubicación de los reactivos. Pipetee los reactivos en los viales de muestra individuales en consecuencia e inserte la gradilla en el instrumento. Haga clic en Expulsar bastidor para abrir la puerta del compartimento de la bandeja de muestras y, a continuación, inserte el estante de muestras en el instrumento.

A continuación, haga clic en Iniciar e introduzca el nombre del experimento que se guardará para iniciar la ejecución. Para las mediciones cinéticas en el ProteOn XPR36, comience la inmovilización seleccionando Protocolos y, a continuación, Muestras. Defina EDC/Sulfo-NHS como activador en los pocillos H1-H6, la proteína A/G como ligando en G1-G6, la etanolamina como desactivador en F1-F6, la glicina como regenerador en E1-E6, PBS-T-EDTA como blanco en D1-D6, la muestra de anticuerpo monoclonal X como ligando en C1-C6 y la PCSK9 humana como analito en los pocillos B1-B6.

Seleccione Pasos y, a continuación, haga doble clic en Inmovilización en el editor de protocolos. Los pasos incluyen tres inyecciones horizontales posteriores de EDC/Sulfo-NHS, proteína A/G y un molar de etanolamina. Cada inyección debe tener un caudal de 30 microlitros por minuto y un tiempo de contacto de 300 segundos.

A continuación, haga clic en Regenerar. Inyecte tres pulsos de glicina de 18 segundos a 100 microlitros por minuto tanto en dirección horizontal como vertical. A continuación, realice dos pulsos de 60 segundos de PBS-T-EDTA a 25 microlitros por minuto, también en ambas direcciones.

A continuación, haga clic en Ligando e inyecte el anticuerpo monoclonal 1, el anticuerpo monoclonal 2 en dirección vertical, utilizando un caudal de 25 microlitros por minuto y un tiempo de contacto de 160 segundos. Después de hacer clic en Analyte, inyecte cinco concentraciones de PCSK9 humano en un tampón en blanco en seis canales horizontales simultáneamente. Utilice 40 microlitros por minuto durante 600 segundos de tiempo de asociación, seguidos de 2.700 segundos de tiempo de disociación.

A continuación, haga clic en Regenerar e inyecte dos pulsos de 18 segundos de glicina a 100 microlitros por minuto tanto en dirección horizontal como vertical. A continuación, prepare las muestras y los reactivos en una placa de 96 pocillos de acuerdo con las posiciones de reactivos definidas. Transfiera la placa al instrumento y, a continuación, haga clic en la pestaña Ejecutar, seleccione el protocolo y haga clic en Iniciar.

Se demuestra la inyección paralela de seis agujas en el registro de datos experimentales en vivo. Para las mediciones cinéticas en el Octet RED384, configure el método experimental haciendo clic primero en Experimento, seguido de Nuevo Asistente de Experimento, Nuevo Experimento de Cinética y luego en Cinética Básica en el software de adquisición de datos. A continuación, haga clic en Modificar placas y cambie 96 pocillos por 384 pocillos tanto en la Placa 1 como en la Placa 2.

Defina los tipos de muestra y las posiciones en la placa como se describe en el protocolo de texto. Vaya a la definición de ensayo para definir la configuración experimental. La configuración experimental se define como un tiempo de referencia de 30 segundos, un tiempo de regeneración de 30 segundos, un tiempo de equilibrio de 18 segundos, una carga con un tiempo de 200 segundos, un tiempo de asociación de 500 segundos y un tiempo de disociación de 1.800 segundos.

La velocidad de agitación se establece en 1.000 RPM. Para agregar los pasos a la lista de pasos del ensayo, primero, haga clic en un paso y, a continuación, haga clic en los pocillos ubicados en la muestra o en la placa de reactivos. Primero, ingrese las instrucciones de regeneración de equilibrio para preacondicionar los sensores de captura Fc antihumanos mediante tres ciclos de inmersiones de 15 segundos en glicina alternadas con inmersiones de 15 segundos en 1XKB.

A continuación, introduzca las instrucciones de carga para capturar las muestras de anticuerpos monoclonales en los sensores de captura Fc antihumanos durante 200 segundos. A continuación, introduzca las instrucciones de referencia para establecer la señal de interferometría de biocapa durante 60 segundos antes del paso de asociación. Introduzca el paso de asociación para sumergir los sensores en pocillos que contengan concentraciones variables de PCSK9 humano durante un período de asociación de 500 segundos.

Introduzca el paso de disociación para sumergir los sensores unidos a PCSK9 en nuevos pocillos de 1XKB durante un período de disociación de 1.800 segundos. Por último, para la etapa de regeneración, sumerja los sensores unidos al anticuerpo monoclonal PCSK9 en pocillos de glicina con dos pulsos de 18 segundos entre cada ciclo de unión. Ve a Revisar experimentos, desplázate por los pasos y, a continuación, haz clic en el botón verde de abrir para abrir el compartimento de muestras.

Transfiera las placas de muestra al instrumento. Vaya a Ejecutar experimentos, introduzca un tiempo de retardo de 60 segundos y agite la placa de muestra mientras espera. Establezca la temperatura de la placa en 25 grados centígrados, ingrese el nombre de la ejecución del experimento y luego presione Go.Live la recopilación de datos se muestra aquí.

Para mediciones cinéticas multiciclo en el IBIS-MX96, instale el chip sensor en el microobservador de flujo continuo. Abra el software CFM2.0 y, a continuación, haga clic en Configuración de carga y 96 Amine Couple. Coloque las dos placas de muestra y reactivo en la impresora CFM.

Para crear la matriz de anticuerpos, presione Ejecutar para iniciar la impresora y entregar el EDC/Sulfo-NHS en la mitad superior de la placa de reactivos al sensor usando 48 microcanales y cícliclos sobre la superficie del sensor durante cinco minutos. Entregue las muestras de anticuerpos monoclonales en la mitad superior de la placa fuente al sensor y cícliclas a través de las superficies activadas durante 10 minutos. A continuación, administre el tampón de inmovilización desde un tubo cónico de 50 mililitros sobre la superficie del anticuerpo durante cinco minutos.

Acople el chip sensor impreso en el instrumento. En el software de control, haga clic en Archivo, Abrir medición, Medición existente y seleccione el archivo de método. Transfiera el chip sensor impreso al instrumento.

En el menú general, seleccione G-System Prime en Script de sistema completo. A continuación, seleccione G-Quench para desactivar las superficies de los anticuerpos monoclonales inyectando 150 microlitros de etanolamina molar. En Ciclo de análisis, seleccione Ejecución estándar A-AP en Scripts IBIS.

Establezca 1,0 minutos para la línea de base, 10,0 minutos para la asociación y 90 pasos para la disociación a una velocidad de ocho microlitros por segundo. Dentro de los ciclos, inyecte PCSK9 humano una concentración a la vez, después de cinco inyecciones de tampón. Regenere las superficies de los anticuerpos monoclonales con glicina entre cada ciclo de unión.

Se muestran los sensorgramas de unión registrados en superposiciones de ajuste del modelo cinético uno a uno para los anticuerpos que interactúan con PCSK9 humano en cuatro instrumentos. Los perfiles de unión de los anticuerpos a múltiples densidades son similares en todos los instrumentos. A pesar de que las constantes de velocidad asociadas con cada uno de los anticuerpos variaron entre los instrumentos, sus órdenes de clasificación permanecieron prácticamente iguales.

Se investigó la reproducibilidad y consistencia de las afinidades en las tasas cinéticas sobre múltiples superficies de anticuerpos. Como se muestra aquí, se observó una fuerte linealidad para todas las constantes de velocidad generadas con el Biacore T100 y el ProteOn XPR36. Sin embargo, las constantes de velocidad generadas por Octet RED384 fueron menos lineales debido a las fluctuaciones en algunas de las tasas de apagado.

Esto fue potencialmente causado por la evaporación de las muestras a lo largo del tiempo en la microplaca. Las constantes de velocidad generadas por el IBIS-MX96 también fueron menos lineales debido a las fluctuaciones en las heterogeneidades de la superficie. Las actividades de unión a anticuerpos asociadas con la mayoría de los sistemas fueron consistentes, mientras que se observó una actividad aproximadamente diez veces menor para el método acoplado a aminas del IBIS-MX96.

Esto se debió posiblemente a la inactivación de anticuerpos, o a la generación de orientaciones de anticuerpos que no eran conductoras de la unión al antígeno. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo configurar experimentos en cada una de las cuatro plataformas de biosensores y cómo seleccionar la tecnología de biosensores adecuada para su propio propósito de investigación. Nuestro estudio comparativo comparativo muestra que cada plataforma de biosensores tiene sus propias ventajas y desventajas.

A pesar de ciertas limitaciones sistemáticas inherentes a la instrumentación, el orden directo de las constantes de tasa de asociación y disociación estaba altamente correlacionado entre estos instrumentos. A efectos de la clasificación de los candidatos, suponiendo que el número de muestras y la cantidad de materiales no sean factores limitantes, se podrá utilizar cualquiera de estos instrumentos, ya que pueden diferenciar los anticuerpos de forma comparable, independientemente del instrumento de importación. Hay un equilibrio entre la fiabilidad de los datos y el rendimiento de las muestras.

Biacore T100, seguido de ProteOn XPR36R, exhibió la mejor calidad de datos y consistencia. Mientras que Octet RED384 e IBIS-MX96 demuestran una alta flexibilidad y rendimiento con compromisos en la precisión y consistencia de los datos. Para estudios que requieren una detección sensible y fiable, Biacore T100 o ProteOn XPR36 son los más adecuados.

Para estudios en los que la velocidad es un factor crítico y se involucra un gran número de muestras, se prefiere Octet Red384 o IBIS-MX96. Los instrumentos con fluido de flujo continuo X proporcionan datos de alta calidad para resolver interacciones con tasas de disociación lentas. La principal limitación del instrumento BRI fluid ex-a-fray es la evaporación de la muestra a lo largo del tiempo en la microplaca, lo que puede dar lugar a una deriva ascendente, lo que compromete la precisión de los datos.