Análisis fenotípico de las etapas de la sangre asexual y sexual del parásito de la malaria de los roedores y las etapas de los mosquitos

Debido a las sorprendentes similitudes del ciclo de vida y la biología de los parásitos de la malaria de roedores, los parásitos de la malaria humana, los modelos de paludismo de roedores se han convertido en indispensables para la investigación del paludismo. Estos métodos estándar pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación del paludismo sobre cómo realizar un análisis fenotípico de especies de paludismo de roedores transgénicos y de tipo salvaje. Demostrando los procedimientos serán los estudiantes graduados Gozde Deveci e Ilknur Yilmaz de mi laboratorio.

Comience por descongelar rápidamente las existencias de parásitos congelados preservados crioconservados e inmediatamente utilizando una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 26 para inyectar al menos dos ratones donantes por genotipo intraperitonealmente con aproximadamente 200 microlitros de stock. Veinticuatro horas después de la inyección, utilice una aguja de calibre 24 o 26 para pinchar la cola del primer ratón y recoger la gota de sangre en una diapositiva del microscopio. Utilice el borde corto de otra diapositiva para manchar rápidamente la sangre a través de la primera diapositiva.

Cuando la sangre se haya secado por completo, fije los portaobjetos en 100% metanol durante al menos un minuto. Manche las muestras fijas en Giemsa durante 10 a 15 minutos seguido de un lavado de agua destilado simple o doble. Cuando las diapositivas se hayan secado, vea las muestras bajo un objetivo 100X y la inmersión de aceite en un microscopio de luz para contar el número total de eritrocitos infectados por cuadrícula.

Dos a tres días después de la infección, asegurar un ratón anestesiado en el que la parasitemia ha alcanzado entre 0.1 a 1%en la posición supina y utilizar fórceps para levantar la piel cerca de la base del esternón para facilitar la creación de una incisión de la piel. Tire de la piel en el sitio de la incisión para exponer el diafragma y la parte superior de la cavidad abdominal y utilice los fórceps para sostener la base de la caja torácica mientras se corta a través del diafragma para entrar en la cavidad torácica. Ancle hacia atrás la caja torácica para exponer el corazón y utilizar una jeringa de un mililitro que contenga al menos 20 microlitros de heparina y equipado con una aguja de calibre 26 para perforar suavemente el tejido cardíaco.

Retraiga lentamente el émbolo para recoger aproximadamente un mililitro de sangre y dispensar la sangre en un tubo de microcentrífuga. Una vez que se haya cosechado toda la sangre, caliente los ratones receptores bajo una lámpara de calor roja y cargue una jeringa de insulina equipada con una aguja de calibre 27 por receptor con la dosis adecuada de parásito. A continuación, coloque el primer receptor en un retén e inyecte una dosis completa de eritrocitos infectados en una vena de cola dilatada.

Para la alimentación de mosquitos, permita que los mosquitos Anopheles stephensi o A.gambiae de adultos de cuatro a siete días de edad mueran de hambre durante ocho a 12 horas para alimentarse al menos de 15 minutos en ratones infectados anestesiados con la tasa de exflaglación más alta. Para determinar el número de esporozoitos de ovocitos por mosquito, eutanasia de 20 a 30 mosquitos en el congelador durante no menos de 10 minutos y utilice un alcance de disección binocular y dos agujas de calibre 26 o 27 para diseccionar la mitad de los mosquitos en un portaobjetos de vidrio que contenga la solución de disección adecuada. Para diseccionar la parte media, primero sostenga la parte inferior del abdomen en su lugar con una aguja y empuje cuidadosamente el tórax muy ligeramente en la unión entre el abdomen y el tórax en dirección ascendente hasta que separe el tórax y un midgut de color blanco se expone colgando del tórax.

Ahora corta el midgut desde el extremo del esófago usando la misma aguja que se usó para empujar el tórax hacia arriba separando y extendiendo el punto medio. Elevar el midgut diseccionado del medio de disección con una aguja y transferirlo a un tubo lleno de 200 microlitros de RPMI. Cuando todos los midguts hayan sido diseccionados y cosechados, coloque el tubo que contiene las placas medias en la centrífuga durante un minuto a 700 veces g.

A continuación, moler los tejidos cosechados con un pestillo dos veces. Transfiera 12 microlitros de la solución de tejido diluido a un hemacytómetro e incubar el hemacytómetro a temperatura ambiente durante cinco minutos para permitir que el contenido se asiente. A continuación, determine el número medio de esporozoitos de ovocitos en un microscopio de luz bajo contraste de fase y un aumento de 40X.

Para determinar el número de esporozoitos de las glándulas salivales por mosquito, en el momento apropiado después de la alimentación, congelar eutanasiados de 50 a 100 mosquitos hembra como se demostró y utilizar un microscopio de disección y el lado de una aguja de calibre 26 o 27 para aislar las glándulas salivales. Para diseccionar las glándulas salivales, primero sostenga la parte superior del abdomen o el tórax en su lugar con el lado biselado de una aguja y empuje cuidadosamente la cabeza muy ligeramente y muy cortos empujes en la unión entre la cabeza y el tórax en una dirección hacia arriba. Empuje hasta que la cabeza esté cuidadosamente separada del tórax sin romper la glándula salival vidriosa.

Utilice una pipeta Pasteur de vidrio corto para elevar la glándula salival diseccionada del medio de disección y colóquela en un tubo de 1,5 mililitros. Cuando todas las glándulas salivales se hayan diseccionado y cosechado, coloque el tubo que contiene las glándulas en la centrífuga durante un minuto a 700 veces g. Moler los tejidos cosechados con un pestillo dos veces.

Luego determine el número promedio de esporozoítos de las glándulas salivales como se hizo anteriormente. Los parásitos transgénicos de la malaria reportero diseñados para expresar EGFP bajo el control de un promotor fuerte y constitutivo exhiben la señal de fluorescencia en etapas sanguíneas, ookinetos, ovocitos jóvenes en Anopheles stephensi midguts, y en esporozoítas aisladas de las glándulas salivales de las hembras de Anopheles stephensi. Los valores porcentuales de la citometría de flujo corresponden directamente a los porcentajes estimados de parasitemia obtenidos mediante el seguimiento de los frotis de sangre delgada manchados de Giemsa, como se demuestra confirmando la validez de este último método de cuantificación.

Además, la estimación de los porcentajes de cada una de las diferentes etapas asexuales y sexuales depende de la evaluación morfológica de los eritrocitos que no puede evaluarse mediante citometría de flujo. La comparación de las vías intraperitoneales frente a las vías intravenosas de la infección revela una disminución estadísticamente significativa en el porcentaje de parasitemia del grupo infectado por la P.I. en comparación con el porcentaje de parasitemia del grupo infectado por vía intravenosa durante los primeros cuatro días de infección, lo que demuestra que la vía iv de la infección es una vía más precisa cuantitativamente para los ensayos con las etapas del parásito del paludismo. Cabe destacar que el tratamiento con fenilhidraazi aumenta significativamente el número de gametocitos, lo que aumenta la tasa de formación masculina de gametos que a su vez aumenta la tasa de fertilización y el número de todas las etapas posteriores de los mosquitos.

Existe una escasez de métodos estandarizados para el análisis fenotípico de los parásitos de la etapa sanguínea de la malaria de roedores y su transmisión al mosquito vector. Estos métodos ayudarán a proporcionar protocolos estandarizados y simplificados para estudiar estos patógenos y sus etapas del ciclo de vida.