Análisis del promotor de ligandos c-KIT usando inmunoprecipitación de cromatina
27 de junio de 2017
Las interacciones ADN-proteína son esenciales para múltiples procesos biológicos. Durante la evaluación de las funciones celulares, el análisis de las interacciones ADN-proteína es indispensable para la comprensión de la regulación de genes. La inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) es una poderosa herramienta para analizar tales interacciones in vivo.
El objetivo general de este procedimiento de inmunoprecipitación de cromatina es evaluar la unión inducida por TGF beta 1 del factor de transcripción SMAD2 a los elementos de unión de SMAD en el promotor del kit C. Este método puede responder a preguntas clave en el campo de la biología celular, como la transcripción de genes inducida por citocinas. La principal ventaja de esta técnica es que tiene el potencial de demostrar la unión directa de factores de transcripción y otras proteínas reguladoras de la transcripción a sus sitios de unión al ADN in vivo.
Cultive las células hasta una confluencia de entre el 70 y el 80% en placas de cultivo de tejidos de diez centímetros. Estimular las células según los objetivos experimentales. Retire el medio de cultivo de tejidos y agregue cinco mililitros de solución de fijación.
Luego, incube las células durante 10 minutos a temperatura ambiente en una plataforma de agitación. Retire la solución de fijación y lave las celdas dos veces con 10 mililitros de un X PBS helado. Retire el X PBS y agregue cinco mililitros de solución de glicina stop fix.
Después de incubar las células durante cinco minutos a temperatura ambiente en una plataforma de agitación, retire la solución de glicina stop fix y lave las células dos veces con 10 mililitros de hielo frío uno X PBS. Después de quitar el PBS, agregue dos mililitros de solución de raspado celular y recoja las celdas con un raspador de celdas. Luego, transfiera las células recolectadas a un tubo cónico con hielo.
Centrifugar las muestras durante 10 minutos a 600 veces G y cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en un mililitro de un tampón de lisis celular X e incube en hielo durante 30 minutos. Una vez que el pellet se vuelva a suspender en el tampón de lisis celular, transfiera la suspensión celular a un homogeneizador Dounce helado y Dounce durante 10 golpes usando un mortero tipo B para la disrupción celular.
Luego, transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga y centrifugue la muestra durante 10 minutos a 2, 400 veces G y cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 350 microlitros de tampón de digestión de núcleos. Después de incubar las muestras durante cinco minutos a 37 grados centígrados, agregue nucleasa microcócica y mezcle por vórtice.
Incubar las muestras a 37 grados centígrados durante cinco a 20 minutos, mezclando las muestras cada dos minutos por inversión. El tiempo en cierta concentración, si está entre líneas celulares, podría requerir optimización en caso de cizallamiento enzimático subóptimo. Un procedimiento de cizallamiento alternativo que utiliza sonicare disponible comercialmente se puede encontrar en el protocolo de texto.
Después de la incubación con la nucleasa microcócica, agregue siete microlitros de EDTA 0,5 molar frío como hielo para detener la reacción. Centrifugar las muestras con el ADN cortado durante 10 minutos a 16, 200 veces G y cuatro grados centígrados. Transfiera el ADN cortado que contiene sobrenadante a un tubo de microcentrífuga nuevo.
Alícuota 50 microlitros en un tubo de microcentrífuga separado, para confirmar el cizallamiento exitoso del ADN como se describe en el protocolo de texto. Utilice el volumen restante inmediatamente para la inmunoprecipitación o guárdelo a menos 80 grados centígrados. Combine de 10 a 25 microgramos de cromatina reticulada cortada con 25 microlitros de perlas magnéticas de proteína G de grado de inmunoprecipitación de cromatina.
A continuación, añadir 10 microlitros de tampón de dilución de inmunoprecipitación y un microlitro de cóctel de inhibidores de la proteasa. Después de cuatro horas de incubación, agregue de uno a 10 microgramos de anticuerpo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Y añadir agua destilada hasta un volumen final de 100 microlitros.
Incubar las muestras en un rotador de extremo a extremo durante cuatro a 12 horas a cuatro grados centígrados. Después de la incubación, coloque los tubos en un soporte magnético. Una vez que las perlas magnéticas se agreguen al costado del tubo, retire y deseche con cuidado el sobrenadante.
Lave las perlas tres veces con 800 microlitros de tampón de lavado uno. Para cada lavado, mezcle las perlas invirtiendo el tubo varias veces. Luego, coloque el tubo en el soporte magnético y retire con cuidado el tampón de lavado una vez que las perlas magnéticas se agreguen en el costado del tubo.
A continuación, lave las perlas una vez con 800 microlitros de tampón de lavado dos utilizando el mismo procedimiento. Después de los lavados, vuelva a suspender las perlas en 50 microlitros de tampón de elución e incube las muestras en un rotador de extremo a extremo durante 15 minutos a temperatura ambiente. Luego, transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo con la ayuda del soporte magnético.
Agregue seis microlitros de cloruro de sodio de cinco molares para revertir la reticulación seguido de dos microlitros de proteinasa K. Después de mezclar las muestras, incubarlas durante dos horas a 65 grados centígrados. En este punto, las muestras se pueden analizar directamente para determinar los sitios de unión a proteínas, como se describe en el protocolo de texto, o se pueden almacenar a menos 20 grados centígrados. Para confirmar la unión inducida por TGF beta 1 de SMAD2 al promotor de SCF, se realizó el ensayo de inmunoprecipitación de cromatina.
El tratamiento con TGF beta 1 dio lugar a la unión de SMAD2 al promotor de SCF en líneas de cáncer de hígado humano, HepG2 y Hep3B. En ausencia de estimulación con TGF beta 1, no se observó unión a SMAD. Como control positivo, para la activación de SMAD inducida por TGF beta 1, se realizó inmunoprecipitación de cromatina para PAI-1.
El promotor de PAI-1 es un objetivo conocido de TGF beta y SMAD. La especificidad de la inmunoprecipitación de SMAD2 se confirmó mediante el uso de anticuerpos IgG inespecíficos. No se observó unión de SMAD2 al SBE después de la inmunoprecipitación con IgG.
Para confirmar la unión inducida por TGF Beta 1 de STAT3 al gen del ligando TGF beta, se realizaron ensayos de inmunoprecipitación de cromatina utilizando células HepG2 y Hep3B tratadas con TGF beta 1. El tratamiento con TGF beta 1 dio lugar a la unión de STAT3 al segundo sitio putativo de unión a STAT3 del gen TGF beta, pero no al primero. En este ejemplo, el enlace positivo de STAT3 a STB-2 sirve como control positivo interno.
Al igual que en el otro experimento de inmunoprecipitación de cromatina, no se observó la unión de STAT3 a ST-2 después de la inmunoprecipitación con IgG. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en uno o dos días dependiendo del anticuerpo si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante seguir las pautas de seguridad del laboratorio y ser muy preciso en cada paso del protocolo.
Se deben tomar precauciones como revisar la MSDS y usar equipo de protección como guantes, bata blanca y gafas de seguridad mientras se realiza este procedimiento. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo analizar la unión de proteínas a las secuencias específicas de unión al ADN. Siguiendo este protocolo, se pueden realizar otros métodos, como los ensayos de promotores, para confirmar la relevancia funcional de la unión al ADN de proteínas demostrada por inmunoprecipitación de cromatina.
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Descripción general
Este artículo demuestra la técnica de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) para evaluar la unión inducida por TGF-β1 de factores de transcripción, específicamente SMAD2 y STAT3, a sus elementos de unión al ADN respectivos dentro de los promotores génicos en líneas celulares de cáncer hepático humano. ChIP permite la identificación de interacciones proteína-ADN in vivo, proporcionando información sobre los mecanismos de regulación génica en un contexto de cromatina.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología Molecular
- Biología Celular
- Regulación Génica
Antecedentes
- Las interacciones proteína-ADN son fundamentales para procesos como la replicación, reparación, recombinación del ADN y la expresión génica.
- Estas interacciones regulan la diferenciación celular, la proliferación, el ciclo celular, la estabilidad cromosómica y la regulación epigenética de los genes.
- Ensayos tradicionales como el EMSA y el mapeo con DNasa I analizan las interacciones proteína-ADN in vitro, careciendo del contexto de la cromatina.
- La inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) permite el estudio de las interacciones proteína-ADN dentro de la cromatina en células vivas.
Objetivo del estudio
- Demostrar el protocolo de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) para detectar la unión inducida por TGF-β1 de SMAD2 a elementos de unión de SMAD en el promotor de c-KIT.
- Evaluar la especificidad y relevancia funcional de la unión del factor de transcripción en líneas celulares de cáncer hepático humano (HepG2 y Hep3B).
- Proporcionar un flujo de trabajo detallado y reproducible para investigadores que estudian interacciones proteína-ADN in vivo.
Métodos Utilizados
- Cultivar células hasta una confluencia del 70–80 % y estimular con TGF-β1.
- Fijación de complejos proteína-ADN con formaldehído, seguida de la inhibición con glicina.
- Lisis celular, extracción nuclear y fragmentación de la cromatina mediante nucleasa microcócica (con sonicación opcional).
- Inmunoprecipitación de cromatina entrecruzada utilizando anticuerpos específicos y perlas magnéticas de proteína G.
- Lavados secuenciales, elución, reversión de los entrecruzamientos y digestión con proteinasa K.
- Análisis del ADN inmunoprecipitado para confirmar la unión del factor de transcripción a los promotores diana.
Resultados principales
- El tratamiento con TGF-β1 indujo la unión de SMAD2 al promotor de SCF en células HepG2 y Hep3B.
- No se observó unión de SMAD2 en ausencia de estimulación con TGF-β1 ni al utilizar anticuerpos IgG no específicos.
- La inmunoprecipitación de cromatina para el promotor de PAI-1 sirvió como control positivo para la activación de SMAD inducida por TGF-β1.
- Se observó la unión de STAT3 al segundo sitio de unión de STAT3 del gen TGF-β tras el tratamiento con TGF-β1, pero no al primer sitio; la especificidad se confirmó con controles de IgG.
Conclusiones
- ChIP es un método robusto para detectar interacciones proteína-ADN in vivo dentro de la cromatina.
- El protocolo permite el estudio de la transcripción génica inducida por citocinas y la especificidad de unión de los factores de transcripción.
- El dominio de esta técnica permite realizar ensayos funcionales adicionales, como estudios de actividad del promotor, para validar la relevancia biológica.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) permite la localización directa e in vivo de la unión de factores de transcripción a los promotores génicos, proporcionando información mecanicista fundamental para la validación de dianas en las fases iniciales del descubrimiento. Al capturar interacciones proteína-ADN inducidas por citocinas dentro de la cromatina, ChIP respalda la confianza predictiva en el análisis de vías y en la genómica funcional. Esta capacidad es esencial para reducir los riesgos asociados a las dianas y para orientar las decisiones de selección de carteras en la investigación y desarrollo de la industria biofarmacéutica.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la evaluación directa de la unión del factor de transcripción a promotores relevantes para la enfermedad en células vivas.
- Apoya la desestimación mecanicista al confirmar la regulación génica inducida por citocinas a nivel de cromatina.
- Proporciona evidencia funcional de la interacción con el objetivo y la modulación de la vía.
- Facilita la priorización de objetivos basada en interacciones reguladoras in vivo.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Establece sistemas biológicos validados para ensayos funcionales posteriores y flujos de trabajo de cribado.
- Proporciona lecturas cuantitativas y reproducibles de eventos de unión proteína-ADN.
- Permite la estandarización de ensayos y la reproducibilidad entre laboratorios en estudios de factores de transcripción.
- Prepara plataformas para la evaluación confiable de los efectos de compuestos sobre la regulación génica.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relaciona hallazgos mecanicistas con la regulación génica relevante para la enfermedad en modelos preclínicos.
- Apoya la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al vincular la activación de rutas con resultados genómicos funcionales.
- Informa decisiones de avance ajustadas al riesgo basadas en evidencia directa de la modulación del blanco.
- Mejora el valor predictivo para el desarrollo de biomarcadores traslacionales cuando se respalda con ensayos posteriores.
Integración de la Línea de Procesamiento y Flujo de Trabajo
ChIP se integra en el continuo de descubrimiento a preclínico al proporcionar validación mecanicista de la unión de factores de transcripción y la regulación génica en respuesta a la activación de vías.
- Biología del Descubrimiento: Confirma interacciones hipotéticas entre proteínas y ADN y aclara las vías reguladoras.
- Selección: Proporciona datos cuantitativos de unión para evaluar el efecto de compuestos o citoquinas en el reclutamiento de factores de transcripción.
- Análisis: Genera resultados específicos y estadísticamente analizables para comparar condiciones experimentales y controles.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos mecanicistas con modelos preclínicos mediante la validación de la regulación génica en sistemas relevantes para enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Ofrece un flujo de trabajo estandarizado y adaptable para diversos blancos, tipos celulares y vías reguladoras.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Proporciona ensayos estandarizados, reproducibles y escalables de interacciones proteína-ADN.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción y la asignación de capital al proporcionar evidencia directa del compromiso del objetivo.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización y el avance ajustados al riesgo de programas de descubrimiento basados en datos genómicos funcionales.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en biología molecular y técnicas de manipulación de cromatina.
- Exige acceso a anticuerpos validados, sistemas de perlas magnéticas e infraestructura analítica cuantitativa.
- Necesita una estandarización rigurosa entre equipos para garantizar la reproducibilidad y la comparabilidad de los datos.
- Puede requerir la adaptación de las condiciones de fragmentación de cromatina y de inmunoprecipitación según el tipo celular o el blanco específico.
- Depende de la especificidad y calidad del anticuerpo para una interpretación confiable de los resultados.
