Name: Un método para probar el efecto de las señales ambientales sobre el comportamiento de apareamiento en Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Aprende a cuantificar el efecto de señales químicas ambientales sobre el comportamiento reproductivo en Drosophila melanogaster. Este ensayo permite estudiar cómo los compuestos volátiles y no volátiles influyen en la frecuencia de apareamiento mediante videoanálisis.

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Damos las gracias al Bloomington Drosophila Stock Center para las acciones de la mosca; C. Gahr, JT Alkema y S. van Hasselt por su temprano intento de desarrollar el ensayo de aire presurizado; Jasper Bosman por el consejo sobre cultivar levadura; Y Rezza Azanchi y Joel Levine por haber desarrollado originalmente el monitoreo de lapso de tiempo del comportamiento de apareamiento de Drosophila . JA Gorter recibió el apoyo de una Beca del Programa de Posgrado BCN / NWO de la Escuela de Investigación Neurocientífica. Este trabajo fue apoyado en parte por la organización holandesa para la investigación científica (NWO) (referencia: 821.02.020) a JC Billeter.

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Los autores no tienen intereses en competencia para divulgar.

Este protocolo describe un ensayo para probar el comportamiento de apareamiento durante 24 horas mientras se controlan continuamente las señales ambientales que se supone que una pareja conjugada usa para determinar la frecuencia de apareamiento. Es posible aumentar la frecuencia de apareamiento en respuesta al aire de levadura suministrado a través de un sistema de aire presurizado cuando el medio contiene levadura también ( Figura 2B ). Además, se puede observar una respuesta similar en la frecuencia ...

Los comportamientos reproductivos suelen tener altos costos de energía, especialmente para las hembras, que producen gametos más grandes que los machos y deben escoger cuidadosamente las condiciones para criar a sus descendientes en desarrollo. Debido al costo energético, no es de extrañar que la reproducción esté relacionada con las condiciones nutricionales. Esto es cierto en la mayoría de los animales, incluso en los mamíferos, cuya pubertad puede ser retardada por la desnutrición y cuyo impulso sexual puede verse afectado negativamente por la restricción de los alimentos 1 . La reproducción del organismo genético modelo Drosophila melanogaster también se ve afectada por las condiciones nutricionales. Los varones corte en el nivel más alto en la presencia de los volátiles del alimento 2 , y las hembras son sexualmente más receptivas en presencia de la levadura, un nutriente importante para la producción del huevo y la supervivencia de la descendencia 3 , 4 , 5 . EstaLa respuesta reproductiva evolutiva conservada a los alimentos ofrece la oportunidad de estudiar mecanismos que conectan la disponibilidad de alimentos ambientales a la reproducción sexual en un organismo geneticamente manejable y eficiente en el tiempo. De hecho, el trabajo en D. melanogaster ha implicado la vía de la insulina como un importante regulador de la conexión entre la comida y el comportamiento de acoplamiento [ 6] . También ha demostrado que el acto de apareamiento a sí mismo cambia la preferencia alimentaria de las hembras, así como las neuronas quimiosensoriales asociadas 7 , 8 , 9 . Está claro que las señales alimentarias afectan los comportamientos reproductivos en D. melanogaster . Estos efectos parecen afectar principalmente a las hembras, específicamente a las que ya se han apareado 5 . Sin embargo, para probar estos efectos agudos de las condiciones ambientales, el ensayo clásicamente utilizado para el comportamiento de apareamiento femenino podríaNo ser muy adecuado debido a las largas interrupciones entre los episodios de apareamiento. En el clásico ensayo de remate, una hembra virgen se aparea primero con un macho, y se aísla inmediatamente y se presenta con un nuevo macho 24 a 48 h después. Este ensayo clásico se ha utilizado con gran éxito para identificar componentes del eyaculado masculino que modifican el comportamiento femenino y la respuesta femenina 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . El ensayo de apareamiento continuo demostrado aquí es, por lo tanto, una adición a los ensayos de apareamiento clásicos que pueden usarse para estudiar el efecto agudo de las condiciones ambientales en los comportamientos reproductivos. Utilizando el ensayo continuo para el comportamiento de apareamiento que se explica aquí, hemos demostrado previamente que un par de moscas expuestas a la levadura remate sCada vez durante un período de observación de 24 h 5 , 19 , 20 , 21 , mientras que las moscas no expuestas a los alimentos sólo remate una vez 5 . Este hallazgo puede ser desconcertante a la luz de una gran parte de la literatura de D. melanogaster que indica que las hembras no remate durante varios días después de un apareamiento inicial (revisado en las referencias 10 , 11 ). Sin embargo, esta discrepancia puede ser fácilmente explicada por condiciones de ensayo, donde una hembra se aísla de uno a varios días antes de que se proporcione una nueva oportunidad de apareamiento. Si la pareja no se aparea en este período de observación de una hora, la hembra se caracteriza por no ser receptiva. Por otra parte, la alta frecuencia de apareamiento no debe ser sorprendente, dado que los datos de las moscas capturadas en el medio silvestre muestran que las hembras contienen espermatozoides de 4 a 6 machos en sus órganos de almacenamiento; Por lo tanto enIndicando que las hembras naturalmente remate varias veces 22 , 23 . Aquí, demostrar el uso de este ensayo de apareamiento continuo para desentrañar cómo las moscas recopilar y combinar la información sobre las condiciones ambientales para modular la frecuencia de apareamiento. Este ensayo permite probar un número relativamente grande de parejas de apareamiento para estudios genéticos y probar la influencia de señales ambientales volátiles y no volátiles. El ensayo típicamente dura 24 h, pero se puede extender hasta 48 h, permitiendo la prueba de ciclos ambientales como el ciclo luz-oscuridad (LD). Demostramos este ensayo mediante la prueba de la influencia de las señales volátiles de un cultivo de levadura dentro de un sistema de aire presurizado en combinación con la disponibilidad de nutrientes no volátiles de levadura en el sustrato de alimentos. El sistema de aire presurizado bombea continuamente señales volátiles en una arena de acoplamiento que contienenUn sustrato alimenticio y una pareja de prueba (cuyo comportamiento de apareamiento es controlado). Para determinar adicionalmente las especificidades a través de las cuales la levadura influye en el apareamiento, probamos un compuesto volátil principal de levadura, a saber ácido acético 24 , en combinación con un contenido de aminoácidos que corresponde al de la levadura en el sustrato alimenticio, en forma de peptona Ácidos derivados de la digestión enzimática de proteínas animales). Juntos estos experimentos demuestran cómo el efecto de señales ambientales en el comportamiento de apareamiento de D. melanogaster puede ser probado con este ensayo.

<table><tbody><tr><td>CabinetArmario de cocina de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>acero inoxidable</td><td>Horecaworld</td><td>7412.0105</td><td></td></tr><tr><td>LEDs blancos</td><td>Lucky Light</td><td>ll-583wc2c-001</td><td>LEDs blancos fríos, 20 mAmp y 2 V</td></tr><tr><td>rojos</td><td>Lucky Ligt</td><td>ll-583vc2c-v1-4da</td><td>Longitud de onda entre 625 nm, 20 mAmp y 6 V</td></tr><tr><td>Resistencia</td><td>Royal Ohm</td><td>CFR0W4J0561A50</td><td>560 ohmios, 0,25 W, 250 V y 5 % de tolerancia</td></tr><tr><td>Aplicación de medidor de luz para teléfonos inteligentes</td><td>Patrick Giudicelli</td><td></td><td>Medidor de luz/lux GRATIS, versión 1.1.1</td></tr><tr><td>Temporizador de potencia</td><td>Alecto</td><td>TS-121</td><td></td></tr><tr><td>Soportes metálicos</td><td></td><td></td><td>Ángulo agudo 5 por 5 mm, 2 x 5450 y 1 x 1100 mm de largo</td></tr><tr><td>Placa</td><td></td><td></td> de vidrio esmerilado <td>1190 x 545 x 5 mm</td></tr><tr><td>Papel de filtro hojas</td><td>Filtros LEE</td><td>220</td><td>Escarcha blanca</td></tr><tr><td>Ventilador pequeño</td><td>Nanoxia Silencio profundo</td><td>4260285292828</td><td>80 mm Ventilador de PC ultrasilencioso, 1200 RPM</td></tr><tr><td>Ventilador grande</td><td>Nanoxia Silencio profundo</td><td>4260285292910</td><td>120 mm Ventilador de PC ultrasilencioso, 650-1500 RPM</td></tr><tr><td>Cámara webcam</td><td>Logitech</td><td>950270</td><td>B910 HD WEBCAM OEM, Ángulo: 78 grados, resolución: 5 millones de píxeles; &nbsp;</td></tr><tr><td>Software de cámara</td><td>DeskShare</td><td></td><td>Monitor de seguridad pro</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</strong</td></tr><tr><td>>Fly rearing</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fly criando botellas Flystuff</td><td></td><td>32-130</td><td>6oz Caldo de Drosophila botella</td></tr><tr><td>Flypad</td><td>Flystuff</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>Moscas salvajes</td><td></td><td></td><td>Canton-S</td></tr><tr><td>Viales de cría de moscas</td><td>Dominique Dutscher</td><td>789008</td><td>Drosophila tubos estrechos 25x95 mm</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Sanyo</td><td>MIR-154</td><td></td></tr><tr><td>Placa calefactora magnética</td><td>Heidolph</td><td>505-20000-00</td><td>MR Hei-Standard</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Caldic Ingredientes B.V.</td><td>010001.26.0</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Gezond& wel</td><td>1019155</td><td>Dextrosa/Druivensuiker</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Van Gilse</td><td></td><td>Azúcar granulada</td></tr><tr><td>Harina de maíz</td><td>Flystuff</td><td>62-100</td><td></td></tr><tr><td>Germen de trigo</td><td>Gezond& Weel</td><td>1017683</td><td></td></tr><tr><td>Harina de soja</td><td>Flystuff</td><td>62-115</td><td></td></tr><tr><td>Melaza</td><td>Flystuff</td><td>62-117</td><td></td></tr><tr><td>Levadura seca activa</td><td>Red Star</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Flystuff</td><td>20-258</td><td>100%</td></tr><tr><td>Peptona (bacto)</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Acético</td><td>Merck</td><td>1000631000</td><td>Glacial, 100% </td></tr><tr>Pequeña placa de <td>Petri</td><td>Greiner bio-one</td><td>627102</td><td>35 x 10 mm con rejillas de ventilación Película de</td></tr><tr><td>parafina</td><td>Bemis NA</td><td></td><td>Parafilm</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Levadura y configuración de aire a presión</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petriplato grande</td><td>Gosselin</td><td>BP140-01</td><td>140 x 20,6 mm</td></tr><tr><td>Agua ultrapura</td><td>Millipore corporation</td><td></td><td>MiliQ</td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Agar (puro)</td><td>BD</td><td>214530</td><td>bacto</td></tr><tr><td>Glucosa (0(+)-glucosa monohidratada)&nbsp;</td><td>Merck</td><td>18270000004</td><td></td></tr><tr><td>Open gorras</td><td>Schott</td><td>29 240 28&nbsp;</td><td>GL45</td></tr><tr><td>Tabique de silicona</td><td>VWR</td><td>548-0662</td><td></td></tr><tr><td>Accesorios de mampara de púas</td><td>Nalgene</td><td>6149-0002</td><td></td></tr><tr><td>Diámetro de tubo</td><td></td><td></td> de PVC grande<td>: exterior 1,2 cm e interior 0,9 cm</td></tr><tr>Diámetros pequeños<td>de tubo de</td><td></td><td></td> PVC<td>: exterior 0,8 cm e interior 0,5 cm</td></tr><tr><td>Tubo de 15 ml</td><td>Bomba de acuario Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sera</td><td>precision</td><td></td><td>Sera air 110 plus, CA 220-240 V, 50/60 Hz, 3 W y presión >100 mbar</td></tr><tr><td>Carbón activado</td><td>Superfish</td><td>A8040400</td><td>Carbón activado Norit</td></tr><tr><td>Unidad de filtrado desechable</td><td>Whatman</td><td>10462100</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas</td><td>VWR</td><td>612-1600</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>Pegamento caliente</td><td>Pattex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro de jeringa</td><td>Whatman</td><td></td><td>FP 30/tamaño de poro 0,45 mm CA-S</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Statistics software</td><td>Paquete R</td><td></td><td>lme4</td></tr></tbody></table>

un método para probar el efecto de las señales ambientales sobre el comportamiento de apareamiento en<em&gt; drosophila melanogaster</em

A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster

El impulso sexual de un individuo está influenciado por el genotipo, la experiencia y las condiciones ambientales. Cómo estos factores interactúan para modular comportamientos sexuales sigue siendo mal entendido. En Drosophila melanogaster , las señales ambientales, como la disponibilidad de alimentos, afectan la actividad de apareamiento, ofreciendo un sistema manejable para investigar los mecanismos que modulan el comportamiento sexual. En D. melanogaster , las señales ambientales a menudo se perciben a través de los sistemas gustativo y olfativo quimiosensoriales. Aquí, presentamos un método para probar el efecto de las señales químicas ambientales en el comportamiento de apareamiento. El ensayo consiste en una pequeña arena de apareamiento que contiene medio de alimento y una pareja de apareamiento. La frecuencia de apareamiento para cada pareja se controla continuamente durante 24 h. Aquí presentamos la aplicabilidad de este ensayo para probar compuestos ambientales de una fuente externa a través de un sistema de aire presurizado, así como la manipulación de los componentes ambientales directamente en el campo de apareamiento. El uDe un sistema de aire a presión es especialmente útil para probar el efecto de compuestos muy volátiles, mientras que la manipulación de componentes directamente en el campo de acoplamiento puede ser de valor para determinar la presencia de un compuesto. Este ensayo puede adaptarse para responder a preguntas sobre la influencia de las señales genéticas y ambientales en el comportamiento de apareamiento y la fecundidad, así como otros comportamientos reproductivos masculinos y femeninos.

Usando este ensayo continuo, el comportamiento de apareamiento, y la frecuencia de apareamiento en específico, se puede determinar bajo condiciones ambientales experimentales. Para controlar las condiciones ambientales, transformamos un gabinete de cocina de acero inoxidable en un área de prueba, con su propia fuente de luz y difusión, lo que garantiza una gran cantidad de luz y una mínima cantidad de reflejos desde la parte superior de las arenas de apareamiento ( Figura 1A</str...

Se demuestra un ensayo para analizar las señales ambientales y genéticas que influyen en el comportamiento de apareamiento en la mosca de la fruta Drosophila melanogaster .

Un método para probar el efecto de las señales ambientales sobre el comportamiento de apareamiento en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

An individual's sexual drive is influenced by genotype, experience and environmental conditions. How these factors interact to modulate sexual behaviors ...

El objetivo general de este ensayo conductual es cuantificar el efecto de las señales ambientales sobre comportamientos reproductivos, como el cortejo y el apareamiento. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología conductual y la eurogenética, tales como la inferencia de factores genéticos y ambientales sobre comportamientos reproductivos y los mecanismos que modulan dichos comportamientos.Esta técnica ofrece rapidez y flexibilidad para probar una amplia gama de estímulos ambientales que afectan la reproducción. Y eso con un número muy elevado de réplicas. El procedimiento lo demostrará Jenke Gorter, un estudiante de posgrado de mi laboratorio.Comience el experimento preparando un litro de medio rico para moscas. Vierta un litro de agua del grifo en un vaso de precipitados de vidrio de dos litros con un agitador magnético. Coloque el vaso de precipitados en una placa calefactora magnética.Mantenga la agitación desactivada y aumente el calor hasta 300 grados Celsius, hasta alcanzar la temperatura de ebullición. Encienda la agitación a 500 rpm y agregue los ingredientes al agua hirviendo. Espere a que la levadura espume vigorosamente.Luego reduzca la temperatura de la placa calefactora a 120 grados Celsius. Después de 10 minutos, baje la temperatura de la placa calefactora a 30 grados Celsius. Y deje mezclar hasta que se enfríe a 48 grados Celsius.Monitoree la temperatura insertando un termómetro directamente en el alimento. Disuelva dos gramos de Tegosept en 10 mililitros de etanol al 96 %. Combine la mezcla y cinco mililitros de ácido propiónico uno molar en el vaso de precipitados.Agite durante tres minutos. Caliente una aguja hasta que enrojezca en un mechero Bunsen. Y perfore un orificio de 0,3 centímetros de diámetro en la parte superior de una placa de Petri plástica de 3,5 centímetros por 1,0 centímetro.Al preparar el medio alimenticio con compuestos odoríferos, primero pipetee 30 microlitros del compuesto deseado en el recipiente para 1/2 de los platos experimentales. Deje la otra mitad de los platos vacíos para su comparación. Utilizando una pipeta serológica de cinco mililitros, vierta tres mililitros de medio alimenticio, cubriendo así el fondo del recipiente.Cúbralo con un paño de gasa para prevenir contaminaciones y deje que el medio se solidifique durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, coloque una tapa sobre los recipientes y selle las tapas con cinta adhesiva por dos lados. Prepare pequeños tapones de película de parafina para cubrir los orificios de los recipientes enrollando trozos de película de parafina hasta formar rollos de cero punto dos centímetros de grosor.Luego, córtenlos en segmentos de cero punto cinco centímetros. Corte dos orificios pequeños en el septo para ajustar firmemente conectores barbados tipo pasamuros. Coloque tapas de botella de cuatro punto cinco centímetros con un septo de silicona de cero punto tres dos centímetros de espesor.Conecte el tubo pequeño de PVC a ambas salidas que salen de la botella y a solo una de las entradas que entran en la botella. A continuación, conecte un tubo de vidrio a la salida de cada botella de cultivo YPD, utilizando un tubo pequeño. Llene el tubo con fibra de vidrio.Y autoclávelo antes de usarlo. Envuelva las tapas ajustadas y los tubos en papel de aluminio. Y autoclávelos durante 25 minutos a 120 grados Celsius y una presión de un bar. Sumerja una punta de pipeta estéril de 100 microlitros en una de las colonias de levadura de la placa de agar YPD y déjela caer en el frasco de medio líquido YPD autoclaveado. Tape el frasco de medio líquido YPD inoculado con levadura, así como un frasco control de medio YPD sin levadura, con tapas autoclaveadas, montadas dentro de una salida. Para evitar la contaminación del medio YPD con microorganismos, conecte el tubo pequeño a un filtro estéril de jeringa de cero punto cuatro cinco micrómetros, con un conector plástico tipo empalme para tubería, dirigido hacia el filtro.Y un conector roscado de pasamuros de plástico que sale del filtro. Luego, conecte el tubo al inlet de la botella de cultivo de YPD. Coloque las botellas sobre placas magnéticas separadas.Y agite la solución a 100 rpm, a temperatura ambiente, durante 24 horas antes del inicio del experimento. Conecte las entradas de ambos frascos a un tubo conectado al aire presurizado. Asegúrese de conectar la salida del frasco de levadura experimental a un tubo que ventile el olor de la levadura fuera del cuarto experimental, para evitar interferencias con el experimento.Conecte un tubo de PVC al lado de salida del tubo de vidrio y diríjalo hacia los orificios inferiores de la caja del experimento. Utilizando un divisor en T, con un diámetro exterior mayor o igual a cero punto cinco centímetros, y trozos cortos de tubo pequeño de PVC, conecte dos pipetas serológicas a cada una de las dos salidas situadas en ambos lados. Fije con cinta las pipetas sobre la hoja de papel blanco debajo de las cámaras, dentro de la caja de acero.Utilice una pipeta bucal para colocar una hembra experimental en un pequeño plato de Petri a las ZT seis. Permita que la mosca se aclimate a la arena de apareamiento durante una hora. Después de una hora, a las ZT siete, transfiera un macho de tipo silvestre al plato de Petri.Y haga clic en Iniciar monitoreo durante 24 horas. Para el experimento con la bomba de aire, coloque el recipiente de manera que la salida de la pipeta esté conectada al orificio de entrada del área de apareamiento. Para analizar el comportamiento de apareamiento de la pareja, seleccione abrir todas las imágenes en un software de visualización de imágenes.Y páselas en orden cronológico. Anote la fecha, el número de experimento, el número de placa y la hora de inicio en una hoja de cálculo dentro de la misma fila. Tome la hora de inicio de cada arena a partir del momento en que se coloca debajo de la cámara web.Registre la marca de tiempo a partir de las imágenes. Anote la hora de inicio de cada cópula en la misma fila de la hoja de cálculo. Considere un apareamiento como un incidente cuando el macho haya montado a la hembra y la pareja permanezca moderadamente quieta y en la misma postura durante al menos cinco cuadros consecutivos.El análisis del aire con levadura, separado para el medio de cultivo, muestra que una pareja en apareamiento no responde a los olores de levadura cuando no hay levadura presente en el medio de cultivo. Sin embargo, aumentan su frecuencia de apareamiento en aire con levadura cuando también se añade levadura al medio de cultivo. La receptividad femenina aumenta ante la presencia de ácido acético.Pero solo cuando la peptona está presente en el medio, lo que demuestra que las moscas necesitan detectar simultáneamente aminoácidos y ácido acético para aumentar su frecuencia de apareamiento. Una vez dominada, esta técnica puede prepararse en seis horas. Y el análisis del comportamiento puede realizarse en cinco horas, si se hace correctamente.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Behavior

Comportamiento

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