Evaluación de la complejidad dendrítica del hipocampo en ratones envejecidos utilizando el método de Golgi-Cox
22 de junio de 2017
Aquí presentamos un protocolo de Golgi-Cox en detalle extenso. Este método fiable de tinción de tejidos permite una evaluación de alta calidad de la citoarquitectura en el hipocampo, ya lo largo de todo el cerebro, con un mínimo de resolución de problemas.
El objetivo general de esta metodología es teñir adecuadamente el tejido cerebral con Golgi con el fin de examinar y cuantificar la morfología y complejidad dendrítica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en neurociencia. Dado que la tinción de Golgi solo tiñe un pequeño subconjunto de células, esta técnica podría usarse para rastrear la estructura de las neuronas.
La principal ventaja de esta técnica es que las secciones del cerebro se pueden manchar fácilmente sin riesgo de que se sequen o se caigan durante cualquiera de los pasos de lavado. Los que demostrarán el procedimiento serán Fred Kiffer, Tyler Alexander y Julie Anderson, estudiantes graduados en el laboratorio del Dr. Allen. Comience sumergiendo medios cerebros de roedores recién cosechados y sin fijar en cinco mililitros o en una solución a base de cloruro de mercurio.
Como la solución de cloruro de mercurio es sensible a la luz, cubra el tubo con papel de aluminio. Guarde las muestras en la oscuridad a temperatura ambiente. Al día siguiente, decanta lentamente la solución en un contenedor temporal antes de desecharla adecuadamente en un contenedor de residuos de riesgo biológico.
Agregue cinco mililitros de solución fresca de cloruro de mercurio y asegúrese de que los cerebros estén sumergidos. Vuelva a oscurecer las muestras a temperatura ambiente durante 13 días más. Después de 14 días, prepare el tampón de post-impregnación agregando 30 gramos de tampón de post-impregnación potenciado a 90 mililitros de agua destilada o desionizada, DH2O.
Llene cada pocillo de la placa de seis pocillos con 6,5 mililitros del tampón posterior a la impregnación, un pocillo por cerebro. Luego, retire la solución de cloruro de mercurio del tejido cerebral como antes. Enjuague el tejido con DH2O, luego transfiera el tejido a las placas de seis pocillos con tampón de postimpregnación.
Cubra los platos con papel de aluminio y guárdelos a temperatura ambiente en la oscuridad. Al día siguiente, aspire y reemplace el tampón de postimpregnación. Vuelva a tapar el plato y guárdelo en una nevera a cuatro grados centígrados.
Prepare dos o tres platos de 12 pocillos por cerebro etiquetando primero los platos en sus tapas con números en orden ascendente de izquierda a derecha y de arriba a abajo. Agregue el número de identificación del cerebro seccionado. Pipetea dos mililitros de 1X PBS en cada pocillo de cada placa, luego configura el escenario y enciende el vibrátomo.
A continuación, coloque cinta adhesiva en el bloque de papel del portamuestras y añada un poco de pegamento de cianoacrilato en la parte superior. Retire un cerebro de la placa de seis pocillos y colóquelo en un plato de plástico o vidrio. Use una cuchilla de acero inoxidable de doble filo para cortar el cerebelo caudalmente, asegurándose de que la porción del cerebelo que queda en el cerebro sea plana.
Luego, coloque la superficie plana del cerebelo restante sobre el pegamento. Después de que el pegamento esté seco, coloque el soporte de muestras con el pañuelo en el baño de muestras. Coloque el baño de muestras en el vibratomo y cubra la muestra de tejido con PBS.
A continuación, fije la cuchilla al soporte de la cuchilla del vibratomo y baje lentamente la cuchilla en el baño de muestras hasta que esté completamente sumergida y ligeramente por debajo de la parte superior del tejido. A continuación, ajuste la velocidad del vibrátomo a siete, la amplitud a seis y el ángulo de corte a 12 grados. Inicie la vibración y corte secciones de 200 micras.
Use un pincel grande para mover las secciones de tejido del baño de muestras a cada pocillo designado de las placas de 12 pocillos. Continúe cortando el tejido hasta alcanzar el número deseado de secciones de tejido. Después de seccionar, use una pipeta de transferencia para aspirar el PBS de los pocillos de la placa de 12 pocillos, luego agregue dos mililitros de PBS-T y lave durante 30 minutos con agitación.
Cerca del final del período de lavado, diluya tres partes de solución de hidróxido de amonio con cinco partes de DH2O. Luego, después de eliminar el PBS-T, agregue la solución de hidróxido de amonio diluido. Proteja de la luz con papel de aluminio y tiña las secciones durante 19 a 21 minutos.
Luego, después de eliminar de manera segura la solución de hidróxido de amonio, agregue tampón posterior a la tinción. Proteja con papel de aluminio y manche durante otros 19 a 21 minutos. Finalmente, enjuague las secciones en PBS-T tres veces durante cinco a 10 minutos cada vez.
Monta las secciones en portaobjetos recubiertos de gelatina al 1% con el pincel grande. Déjelos secar durante 20 a 30 minutos a temperatura ambiente, luego colóquelos en un frasco Coplin y déjelos toda la noche. Retire los portaobjetos del frasco Coplin y colóquelos en una rejilla de plástico en la campana extractora.
Coloque en un plato para tinturrear que contenga etanol al 100% durante cinco minutos. Deshidrate las secciones a través de dos lavados adicionales de etanol de cinco minutos. A continuación, coloque los portaobjetos en una rejilla de vidrio y use un mango de metal para bajar la rejilla a un plato de vidrio para tinturas que contenga un 99% de xileno.
Lave los portaobjetos en dos cambios de xileno durante cinco minutos cada uno. Una vez transcurrido el tiempo para el segundo lavado, retire los portaobjetos del xileno uno a la vez y cubra rápidamente el tejido con aproximadamente 0,25 mililitros de medio de montaje. A continuación, tome una cubierta de diapositiva y colóquela sobre el medio.
Empuje las burbujas de aire atrapadas debajo de las cubiertas de los portaobjetos hasta el borde con un objeto contundente, como el extremo de un pincel. Coloque los portaobjetos en un área fuera de la luz solar directa y déjelos secar durante dos o tres días. Después del secado, proceda a la adquisición de imágenes con un microscopio y análisis con el software adecuado.
Esta imagen de campo claro muestra una neurona teñida de Golgi que cumple con los criterios para la obtención de imágenes y el análisis posterior. Los tres tipos de columna vertebral se pueden ver fácilmente. La tinción es consistente en toda la longitud de la dendrita, y la dendrita se aísla de otras neuronas.
Esta figura muestra que las neuronas teñidas con Golgi dentro del giro dentado mostraron una disminución de la longitud en el cuarto y sexto orden después del tratamiento con 5-fluorouracilo en comparación con el grupo tratado con solución salina. La tinción de Golgi se puede utilizar para detectar diferencias significativas en la densidad de la espina. En las dendritas piramidales apicales CA1, la administración de 5-fluorouracilo a ratones vivos disminuyó significativamente la densidad de la espina.
En las dendritas basales no hubo cambios significativos en la densidad general de las espinas. El análisis Sholl de las dendritas piramidales apicales CA1 reveló que el tratamiento con 5-fluorouracilo disminuyó significativamente la arborización dendrítica a distancias entre 40 y 160 micras del soma. En las dendritas basales, el tratamiento con 5-fluorouracilo disminuyó la arborización dendrítica a una distancia de 30 a 110 micras del soma.
Una vez dominada, esta técnica, que tiene en cuenta tanto el proceso de tinción de Golgi como el montaje, la limpieza y el recubrimiento, se puede realizar en tres horas por cerebro si se realiza correctamente. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurobiología exploraran las conexiones neuroanatómicas en un modelo murino. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener las secciones en una solución de hidróxido de amonio durante solo 19 a 21 minutos para no manchar demasiado las neuronas.
Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo teñir, seccionar y enjuagar correctamente el tejido cerebral. No olvide que trabajar con la solución a base de cloruro de mercurio, la solución de hidróxido de amonio y el xileno puede ser extremadamente peligroso, así que tome precauciones y use guantes de laboratorio y trabaje con una campana extractora cuando realice este procedimiento.
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo detallado de Golgi-Cox para la tinción de tejido cerebral, que permite una evaluación de alta calidad de la citarquitectura en el hipocampo y en todo el cerebro. El método minimiza los problemas técnicos y facilita el examen de la morfología y complejidad dendríticas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Neuroanatomía
- Histología
Antecedentes
- La tinción de Golgi marca selectivamente un subconjunto pequeño de neuronas.
- Esta técnica es fundamental para trazar las estructuras neuronales.
- Permite evaluar la complejidad dendrítica.
- Las secciones cerebrales permanecen intactas durante el proceso de tinción.
Objetivo del estudio
- Demostrar un método confiable para la tinción de Golgi de tejido cerebral.
- Facilitar el examen de la morfología neuronal.
- Proporcionar un protocolo que minimice el riesgo de daño tisular.
Métodos Utilizados
- Inmersión de hemisferios cerebrales de roedores no fijados en una solución a base de cloruro mercúrico.
- Aplicación del protocolo de tinción de Golgi-Cox.
- Evaluación de la morfología y complejidad dendríticas.
- Demostación por estudiantes de posgrado en un entorno de laboratorio.
Resultados principales
- Tinción exitosa de secciones cerebrales sin desecación ni daño.
- Visualización de alta calidad de estructuras neuronales.
- Trazado eficaz de la morfología dendrítica.
- Mínima solución de problemas requerida para el protocolo.
Conclusiones
- El protocolo de Golgi-Cox es un método confiable para estudiar el tejido cerebral.
- Esta técnica mejora la comprensión de la arquitectura neuronal.
- Es adecuado para diversas aplicaciones en investigación en neurociencia.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La evaluación de la complejidad dendrítica del hipocampo proporciona información mecanicista sobre los cambios neurocognitivos asociados con el envejecimiento y la exposición a tratamientos quimioterapéuticos, apoyando la validación de dianas en el descubrimiento de fármacos para el sistema nervioso central. El método de Golgi-Cox permite la evaluación cuantitativa de la arborización dendrítica y la densidad de espinas, ofreciendo un sistema relevante para la enfermedad que ayuda a reducir riesgos en fases preclínicas de compuestos neurotóxicos. Este enfoque fortalece la confianza predictiva en la identificación de compuestos líderes al vincular cambios estructurales neuronales con resultados funcionales en modelos murinos envejecidos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar hipótesis terapéuticas respecto a los cambios neuroestructurales en el hipocampo envejecido.
- Valor operativo: Proporciona una reducción del riesgo biológico mediante la validación funcional del objetivo en cuanto a la integridad dendrítica.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras al cuantificar las alteraciones inducidas por compuestos en la densidad de espinas y la arborización.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Listo para ensayo: Prepara tejido hipocampal validado para la selección de compuestos posteriores con calidad de tinción constante.
- Resultado cuantitativo: Proporciona mediciones reproducibles de la longitud dendrítica, ramificación y densidad de espinas en las subregiones hipocampales.
- Utilidad de la plataforma: Permite la evaluación confiable de compuestos mediante fenotipificación neuroanatómica estandarizada.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Modela la vulnerabilidad hipocampal relacionada con la edad frente a agentes quimioterapéuticos como el 5-fluorouracilo.
- Continuidad traslacional: Conecta hallazgos de descubrimiento con la validación preclínica mediante análisis dendríticos específicos de región.
- Decisiones ajustadas al riesgo: Orienta las decisiones de avance al identificar tempranamente la toxicidad neuronal en la fase inicial del proceso.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método Golgi-Cox se integra en el continuo de descubrimiento, desde la prueba de hipótesis sobre dianas hasta la identificación de compuestos líder y la evaluación preclínica de seguridad, particularmente para compuestos que penetran en el SNC.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre vías neuroestructurales y la reducción del riesgo biológico asociado a ambigüedades mecanicistas.
- Tamizaje: Proporciona tejido listo para ensayos con resultados morfométricos cuantitativos para la comparación del efecto de compuestos.
- Análisis: Permite el análisis de Sholl y la cuantificación de la densidad de espinas para comparar condiciones y evaluar el impacto de compuestos.
- Investigación Translacional: Conecta los cambios estructurales del hipocampo con la continuidad preclínica mediante la vulnerabilidad específica de regiones como CA1, CA3 y DG.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de histología reutilizable para el tamizaje neuroanatómico en distintas áreas terapéuticas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de objetivos mediante la reducción de la ambigüedad mecanicista en los cambios estructurales neuronales.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad de la evaluación de la morfología dendrítica en distintas regiones cerebrales.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción del desarrollo, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases avanzadas en el desarrollo de neuroterapias.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo basada en la complejidad dendrítica y la densidad de espinas como biomarcadores traslacionales.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en neurohistología y manejo de tejidos para la correcta realización de la tinción de Golgi.
- Depende de instrumentación especializada, incluyendo vibrátomo para el corte y microscopía de campo claro para la obtención de imágenes.
- Necesita una estandarización entre equipos para garantizar resultados reproducibles en las áreas de histología, adquisición de imágenes y análisis.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicar el método a diferentes regiones cerebrales o modelos de enfermedad.
- Incluye limitaciones prácticas, como el manejo de reactivos peligrosos (cloruro mercúrico, hidróxido de amonio, xileno), que requieren el uso de campana extractora y EPP.
