Name: Rewiring Neuronal Circuits: Un Nuevo Método Para La Extensión Neurítica Rápida Y La Conexión Neuronal Funcional (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Aprende a extender y conectar neuritas rápidamente usando cámaras microfluídicas con guía de micropipetas. Este método permite estudiar la formación de redes neuronales y la función sináptica con control preciso a nivel celular.

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Nos gustaría dar las gracias a Yoichi Miyahara por muchas discusiones y puntos de vista útiles. MA y PG reconocen fondos del CRSNG.

Todos los procedimientos detallados a continuación fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad McGill y conformados con las directrices del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales. 1. Estandarización de cultivos neuronales utilizando dispositivos microfluídicos: Montaje de dispositivos <ol><li> Seleccione un dispositivo microfluídico adecuado para el experimento deseado. Para conectar las neuronas dentro de la misma población, utilice los Neuro Devices ( Figura 1 ) y para conectar neuronas en diferentes poblaciones, use los Dispositivos de Co-Cultura ( Figura 6 ). </li><li> Limpie y prepare el número deseado de cubreobjetos estériles o platos de fondo de vidrio. Para obtener los mejores resultados en superficies de plástico utilice platos de 35 mm, en el vidrio utilice cubreobjetos de 25 mm o platos de vidrio de 35 mm de fondo. Seleccione el grosor del vidrio según el sistema de imagen, por ejemplo 0,15 mm. </li><li> Cubra los platos o cubreobjetos con 0,5-1 mL de PDL 100 μg / mL durante 2 h o durante la noche a temperatura ambienteAtura Nota: El protocolo se puede pausar aquí y reanudarse el día siguiente si se desea. Además, los platos pueden recubrirse con PDL diluida en tampón de borato, poli-L-lisina (PLL), laminina o cualquier otra molécula de adhesión celular. </li><li> Lavar los platos dos veces con agua (no usar solución salina tamponada con fosfato (PBS) ya que los cristales de sal pueden bloquear los canales), quitar todo el líquido y dejarlo secar en un ambiente estéril como un gabinete de bioseguridad durante 5-10 min o hasta La superficie está completamente seca. Nota: Tenga cuidado de asegurarse de que los cubreobjetos estén absolutamente secos, ya que cualquier líquido restante interferirá con la adherencia de los sistemas microfluídicos. </li><li> Coloque los dispositivos microfluídicos con los patrones hacia arriba bajo luz UV en un ambiente estéril (gabinete de bioseguridad) durante 10 min. Asegúrese de seguir los procedimientos estériles cuando trabaje en el gabinete de bioseguridad 10 . </li><li> Usando pinzas colocar un dispositivo microfluídico con el patrón hacia abajo en contacto con la cubierta limpiaIp / plato. Utilice las pinzas para presionar suavemente el dispositivo para que se adhiera al cristal. Nota: La transparencia de la zona adherida será visible al mirar contra la luz. Asegúrese de que todas las esquinas estén en contacto con el cristal. Haga esto a todos los dispositivos microfluídicos. Véase la Figura 1a . </li><li> Para llenar el dispositivo de población única con medio, dirija la pipeta hacia los canales y añada 50 μl de medio celular completo suplementado con B-27 libre de suero (relación de volumen 1:50) y 500 μg / mL de penicilina / estreptomicina / glutamina Llamado NBM) en el pocillo superior derecho, y luego añadir otros 50 μL al pozo que se encuentra diagonalmente a él. Haga esto para todos los dispositivos, asegurándose de que el medio fluya entre los pozos. A continuación, añadir 50 μL de medio a los 2 pocillos restantes. Véase la figura 2a . <ol><li> Para llenar el dispositivo de población múltiple con medio, apunte la pipeta hacia los canales y añada 30 μLDe NBM completo a los pozos derechos, consulte la Figura 6a . Haga esto para todos los dispositivos, asegurándose de que el medio fluya entre los pozos. A continuación, añadir 50 μL de medio a los 4 pocillos restantes. </li></ol></li><li> Coloque los aparatos en una placa más grande con un plato abierto con agua en autoclave (cámara húmeda) y colóquelo en la incubadora (37 ° C, 5% de CO 2 y 95% de humedad) durante 1-2 horas mientras se prepara el cultivo celular. Véase la figura 2b . </li></ol> 2. Colocación de neuronas en sistemas microfluídicos <ol><li> Siguiendo el protocolo descrito en la Ref. 8 , se obtienen neuronas hipocampales o corticales disociadas de embriones de rata Sprague Dawley (ambos géneros). </li><li> Resuspender las neuronas embrionarias en NBM a una concentración de 1-2 millones de neuronas / mL. Verificar las concentraciones celulares en el microscopio utilizando un hemocitómetro y la siguiente referencia 8 . Ajustar la concentración celular segúnG a la densidad celular deseada. Para aumentar las posibilidades de obtener solo axones del hipocampo por canal, la placa de 10.000 neuronas por dispositivo. Para tener axones múltiples en el mismo canal, plancha 60.000 neuronas por dispositivo. Nota: Estos números varían según el tipo neuronal utilizado. </li><li> Retire el medio de los dispositivos microfluídicos sin vaciar los pocillos. Deje aproximadamente 5 μl en cada uno. </li><li> Para colocar las células en el dispositivo de población única, añada 50 μl de NBM al pocillo inferior derecho. En este punto el medio fluye por sí mismo para llenar el otro pozo inferior. Añadir 20 μl de la solución de células concentradas en el pozo superior derecho del dispositivo microfluídico, como se indica en la Figura 1b . <ol><li> Para placas de células en el dispositivo de población múltiple añadir 20 μ l de la solución de células de concentrado en cada uno de los pozos de la derecha en la Figura 6a . </li></ol></li><li> Verifique en el microscopio si las célulasEstán dentro de las cámaras y colocan los dispositivos en la incubadora durante 15-30 minutos para promover la unión de células al sustrato. </li><li> Verifique en el microscopio si hay suficientes células en las cámaras. Si se necesitan más, repita los pasos 2.4 y 2.5. </li><li> Añadir 50 μL de NBM a los 2 pozos superiores del dispositivo de población única y 20 μL de NBM en el mismo pozo, ya que las células se inyectaron en el dispositivo de población múltiple. Los medios sobresalen ligeramente para formar un menisco positivo que da a los pocillos un aspecto superior del mollete. Una vez más, vea la Figura 2a . </li><li> Mantener las células a 37 ° C, 5% de CO 2 y 95% de humedad. </li></ol> 3. Mantenimiento de las culturas neuronales <ol><li> Retire NBM (aproximadamente 30 μL con una pipeta) de las células y aplique nuevo NBM precalentado al día siguiente de su introducción a los dispositivos (es decir, 1 d después del paso 2). </li><li> Compruebe cada 2 días si hay suficiente medio en cada canal. Si el muffin tOp es baja sólo agregue más medio a los pozos superiores. </li><li> Células de cultivo durante al menos 7 d antes de la eliminación de los dispositivos microfluídicos. Las células pueden sobrevivir en estos dispositivos durante varias semanas. Retire los dispositivos 1-2 días antes de que los experimentos se realicen en muestras. </li></ol> 4. Eliminación de dispositivos microfluídicos <ol><li> 1 - 2 d antes de la eliminación de los dispositivos microfluídicos, añadir 2 mL de NBM precalentado a 37 ° C a cada plato de muestra, inundando las cámaras, y mantener los dispositivos en la incubadora. </li><li> Utilice pinzas estériles y una punta para quitar los dispositivos microfluídicos de los cubreobjetos dejando una configuración modelada de las neuronas. Utilice la punta para sujetar el cubreobjetos en su lugar y las pinzas para sujetar el borde del dispositivo en la esquina inferior izquierda del pozo. Aplicar delicadamente la torsión, levantando el dispositivo con las pinzas para que se despegue de la cubreobjetos. Vea la Figura 2c - 2d . </li><li> Cada 2-3 días, reemplazar haSi se utiliza el NBM hasta que la muestra se utilice para experimentos. </li><li> Antes de realizar experimentos de cableado en la muestra, verifique que las neuritas en los canales de dispositivo de población única y las poblaciones neuronales en el dispositivo de población múltiple se aíslan examinando los vacíos entre ellos en el microscopio para asegurar que no hay filamentos que enlazan poblaciones neuronales. </li></ol> 5. Preparación de perlas recubiertas de PDL <ol><li> Añadir 2 x 50 μL gotas de 4, 10 o 20 μm de bolitas de poliestireno diluidas en agua (1: 500) a 1 mL de PDL (100 μg / mL). Dejar por lo menos 2 h a temperatura ambiente. Nota: El protocolo puede pausarse aquí y reanudarse al día siguiente. </li><li> Centrifugar la solución a 8,820 xg durante 1 min. Retire con cuidado el sobrenadante sin alterar las perlas acumuladas en el fondo del recipiente. </li><li> Lavar las perlas dos veces con 1 ml de solución HEPES 10 mM estéril pH 8,4. </li><li> Resuspender las perlas recubiertas de PDL en 200 ml de HEPES 10 mM pH 8,4solución. </li></ol> 6. Preparación de Micropipetas <ol><li> Prepare pipetas de tubos capilares de vidrio (diámetro interno de 1 mm, diámetro exterior de 1,5 mm) utilizando un extractor de electrodos horizontal. Ajustar los ajustes para que la punta exterior de la micropipeta extraída sea ~ 2-5 μm. Antes de tirar, asegúrese de que los tubos de vidrio estén limpios. </li><li> Fije las pipetas a los portaobjetos de vidrio para el almacenamiento y asegúrese de que la punta no entre en contacto con la superficie del portaobjetos, ya que la punta es frágil. Guarde a temperatura ambiente en un recipiente cubierto para protegerlo del polvo. Utilice las pipetas el mismo día en que son tiradas. </li></ol> 7. Adherencia de PDL-gránulo a neuronas <ol><li> Añadir 40-60 μL de perlas recubiertas con PDL preparadas en el paso 5 a un cultivo celular preparado en el paso 4. Centrar la punta de la pipeta sobre las neuronas, que son débilmente visibles en la cubreobjetos, y añadir las perlas. </li><li> Devolver la muestra a la incubadora durante 1 h para promover la formación de syContactos nápticos 8 , 9 . </li><li> Después de la incubación, retire las perlas no adheridas lavando suavemente el cultivo con NBM previamente calentado. </li></ol> 8. Preparación de una solución fisiológica salina (para experimentos con temperatura ambiente) <ol><li> Preparar solución fisiológica salina mediante la combinación de los ingredientes enumerados en las referencias 7 , 8 . Esto es para regular el ambiente celular fuera de la incubadora. </li><li> Verificar la osmolaridad y los niveles de pH como se indica en las referencias 7 , 8 . </li><li> Infundir continuamente la solución con O 2 para minimizar las fluctuaciones del pH mientras se realizan experimentos. </li><li> Calentar a temperatura ambiente. </li><li> Instalar el sistema de perfusión mediante la inserción de un extremo de un tubo de plástico (dimensiones opcionales) en solución fisiológica infundida con O 2 y fijar el otroNd a una aguja insertada en el soporte de muestras. Coloque el tubo y la solución por encima de la muestra (vea la Figura 4 ). <ol><li> Desconecte el tubo de la aguja y conéctelo a una jeringa. Utilice la jeringa para ejercer presión y extraer líquido, llenando el tubo. Selle con una abrazadera de rodillo y vuelva a conectar la aguja. </li></ol></li></ol> 9. Micromanipulación del grano <ol><li> Instale la muestra en una instalación experimental de tal manera que las células se puedan acceder desde arriba por dos micropipetas montadas en micromanipuladores y se accede ópticamente por debajo, por ejemplo con el objetivo de fase 40X (apertura numérica de 0,6) de un microscopio óptico invertido. En esta configuración, montar una cámara CCD para la captura de imágenes en el puerto lateral del microscopio. Conecte cada pipeta a jeringas de 1 ml a través de tubos de plástico. En este paso, reemplace NBM con solución salina fisiológica (1-2 mL) (Ver Figura 4 ). </li><li> Durante experi, Perfundir continuamente las células con la solución salina fisiológica preparada en la etapa 8 a una velocidad de 0,5-1 ml / min. </li><li> Seleccione un talón PDL NO conectado a una neurona en el campo de visión. Alinee el cordón con una punta de micropipeta enfocándola sobre el talón y luego hacia arriba hasta la micropipeta. Lleve la punta hacia abajo lo más cerca posible de la cuenta mediante la supervisión a través del microscopio. </li><li> Aplique presión negativa con la jeringa de 1 ml conectada a la pipeta para recoger el cordón. Mantener la presión negativa durante todo el experimento. </li></ol> 10. Tirando Neuritos <ol><li> Seleccione un talón PDL unido a una neurona en el campo de visión y adjúntelo a la segunda micropipeta utilizando succión como se describe en los pasos 9.3-9.4. </li><li> Tire del complejo PDL-perla-neurona lentamente (~ 0,5 μm / min) moviendo el micromanipulador o la etapa de muestra por 1 μm y haga una pausa de 5 min para permitir la iniciación de la neurita. </li><li> Repita el paso 10.2 dos veces. Nota: Los primeros 3 &amp;# 181; m tiene que ser jalado muy lentamente para garantizar el éxito experimental, que ocurre sobre el 95% del tiempo. </li><li> Tire del complejo PDL-perla-neurona lentamente (~ 0,5 μm / min) moviendo el micromanipulador o la etapa de la muestra en 2 μm y haga una pausa de 5 min para permitir el alargamiento de las neuritas. </li><li> Después de la iniciación exitosa y la extensión de las neuritas para los primeros 5 μm, tire de la neurita a 20 μm / min sobre distancias de escala milimétrica. Nota: La tracción puede realizarse de forma continua o por etapas ya diferentes velocidades. Véase la Figura 5b- 5c . </li></ol> 11. Conexión de neuronas <ol><li> Seleccione una región rica en neuritas y baje el complejo PDL-bead-neurite para que físicamente se ponga en contacto con él. Utilice otras perlas para medir la altura de la punta sobre la superficie del cubreobjetos. Vea la Figura 5d . </li><li> Dejar el complejo PDL-perla-neurita en contacto con la neurita diana mientras se manipula la segunda micropiPette Baje la segunda pipeta con la segunda perla de PDL encima de la neurita recién formada de aproximadamente 20 μm de la primera perla. Utilice el segundo talón de PDL para empujar el nuevo filamento de neurita hacia la célula objetivo. </li><li> Mantenga ambas perlas en su lugar durante al menos 1 h. Comprobar la ausencia de hinchamiento focal, un engrosamiento de las neuritas en contacto con el cordón, con el microscopio [ 16] . </li><li> Durante este tiempo, utilice la perfusión para cambiar lentamente el medio de la muestra de solución salina fisiológica a NBM equilibrado precalentado con CO 2 . </li><li> Libere el cordón de la segunda pipeta liberando la succión. Si la nueva neurita permanece unida, libere el primer cordón también. Véase la figura 5e . </li><li> Remueva suavemente la solución salina y reemplácelas con NBM (~ 2 mL). </li><li> Cuidadosamente colocar la muestra de nuevo en la incubadora para fortalecer la conexión neuronal para futuros experimentos. Esta conexión es estable durante&gt; 24 h 7 </sup&gt;. </li></ol> 12. Verificación de la funcionalidad de la nueva conexión a través de grabaciones de parche de parche <ol><li> Siga las referencias 7 , 18 , 19 . Para montar una instalación de electrofisiología. </li><li> Siga las referencias 7 . Para preparar los electrodos pre y postsinápticos. </li><li> Reúna los datos de pinza de parche, siguiendo de nuevo las referencias 18 , 19 . </li><li> Compare los resultados con las señales naturales 7 para determinar el tipo de conexión. </li></ol>

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La autora Margaret H Magdesian es la directora general de Ananda Devices que produce instrumentos utilizados en este artículo.

Utilizando una micromanipulación estándar y dispositivos microfluídicos innovadores, se desarrolló una nueva técnica para iniciar rápidamente, alargar y conectar con precisión nuevos circuitos neuronales funcionales a grandes distancias. La micromanipulación con pipeta es una herramienta común en la mayoría de los laboratorios de neurociencia 4 , 13 . El verdadero desafío para lograr resultados reproducibles y confiables fue la estandarización de cultivos neuron...

Las lesiones del sistema nervioso central (SNC) adulto pueden conducir a una discapacidad permanente debido a múltiples mecanismos que limitan el rebrote axonal 1 . Tras la lesión, muchos axones del SNC no forman un nuevo cono de crecimiento y no logran montar una respuesta regenerativa eficaz 2 . Además, el daño y el tejido cicatricial que rodea las lesiones del SNC inhiben significativamente el crecimiento axonal 1 , 2 , 3 . Las terapias actuales para promover la regeneración del SNC después de la lesión se han centrado en mejorar el potencial de crecimiento intrínseco de la neurona lesionada y en enmascarar los inhibidores de la extensión axonal asociados con restos de mielina y la cicatriz glial 1 , 3 . A pesar de esto, la capacidad de regenerar axones largos a objetivos distantes y formar sinapsis funcionales apropiadas permanece severamente limitada 4 , </suP&gt; 5 , 6 , 7 . En el presente trabajo, las microperlas, la micromanipulación con pipeta y los dispositivos microfluídicos se utilizan para iniciar, alargar y conectar con rapidez nuevos circuitos neuronales funcionales a largas distancias. Trabajos previos han demostrado que las perlas recubiertas con poli-D-lisina (PDL-perlas) inducen adhesión a la membrana seguido de la agrupación de complejos de vesículas sinápticas y la formación de boutons presinápticos funcionales [ 8] . También se demostró que cuando el PDL-perla es mecánicamente retirado después de la diferenciación presináptica, el grupo de proteínas sinápticas sigue el cordón, el inicio de una nueva neurita [ 9] . El siguiente procedimiento explora este hecho junto con la capacidad de cultivar las neuronas del hipocampo embrionarias de ratas en regiones organizadas en un cubreobjetos usando dispositivos microfluídicos de polidimetilsiloxano (PDMS) para volver a cablear precisamente una neuronacircuito. Estos dispositivos microfluídicos PDMS son no tóxicos, ópticamente transparentes y consisten en dos cámaras conectadas por un sistema de microcanales. Una vez montados en un cubreobjetos, cada dispositivo sirve como molde para guiar el crecimiento neuronal y mantener cultivos neuronales sanos en patrones precisos durante más de 4 semanas in vitro . Aquí, se presenta un marco en el que se investigan los límites de extensión y funcionalidad de la nueva neurita. Se crean neuritas nuevas y funcionales que se posicionan para controlar (re) alambre las redes neuronales. Las velocidades de extensión alcanzadas son más rápidas que 20 μm / min sobre distancias de escala milimétrica y se establecen conexiones funcionales. Estos resultados muestran, inesperadamente, que la capacidad intrínseca de estas neuritas para la elongación es mucho más rápida de lo que se pensaba anteriormente. Este enfoque mecánico propuesto ignora las estrategias químicas lentas y permite la conexión controlada a un objetivo específico. ThEs técnica abre nuevas vías para el estudio in vitro de nuevas terapias para restaurar la conectividad neuronal después de la lesión. También permite la manipulación y recableado de redes neuronales para investigar aspectos fundamentales del procesamiento de señales neuronales y la función neuronal in vitro .

<table><tbody><tr><td>Dispositivos de cocultivo</td> Dispositivos <td></td><td>Ananda</td><td>Disponible comercialmente en http://www.anandadevices.com</td></tr><tr><td>Neuro devices</td><td>Dispositivos Ananda Disponible</td><td></td><td>comercialmente en http://www.anandadevices.com</td></tr><tr><td>Nº 1 Cubreobjetos de vidrio Redondo de 25 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0705</td><td></td></tr><tr><td>Platos con fondo de vidrio de 35 mm #0, sin recubrimiento, irradiados con rayos gamma</td><td>Incorporación de MatTex</td><td>P35G-0-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular de 35 mm, no pirogénica, estéril</td><td>Corning Inc</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri de 95 mm x 15 mm, tapa deslizante, poliestireno estéril</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875714G</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubos de centrífuga con graduaciones impresas y tapas planas</td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico de polipropileno de 15 ml, estilo de 17 x 120 mm, no pirogénico,</td><td>halcón estéril</td><td></td><td></td>352097</tr><tr><td>Neurobasal Medium Life</td><td>Technologies</td><td>21103-049</td><td>Solución extracelular</td></tr><tr><td>B-27 Suplemento (50X), sin suero</td><td>Suplemento B-27 (50X), sin suero</td><td>17504044</td><td>Solución extracelular</td></tr><tr><td>Penicilina, estreptomicina, glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>11995-065</td><td>Solución extracelular</td></tr><tr><td>200 &mu; L pipetas</td><td>VWR</td><td>89079-458</td><td></td></tr><tr><td>2 - 20 &mu; L Pipettors</td><td>Puntas Resistentes a Aerosoles</td><td>2149P</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 3mL Pipetas de Transferencia [No Estériles]</td><td>BD Falcon</td><td>357524</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Gibco</td><td>15023-021</td><td>Solución Extracelular</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>Solución Extracelular/Perlas</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td>Solución</td></tr> <tr><td>ExtracelularKCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td>Solución extracelular</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10043-52-4</td><td>Solución extracelular</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td>Solución extracelular</td></tr><tr><td>#5 Pinzas Dumont Dumostar 11 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>500233</td><td></td></tr><tr><td>Herramientas de disección</td><td>Braun, Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hidrobromuro de poli-D-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Micropartículas a base de poliestireno, 10 &mu; m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72986</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de borosilicato King</td><td>Precision Glass, Inc.</td><td>14696-2</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de pipetas horizontales</td><td>Micromanipuladores Sutter Instruments</td><td>Brown-Flaming P-97</td><td></td></tr><tr><td>, serie PCS-5000</td><td>SD Instruments</td><td>MC7600R</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 1 mL Microscopio</td><td>invertido BD Luer-Lok</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus&nbsp;</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Objetivo</td><td>Olympus</td><td>UIS2, LUCPLFLN 40X</td><td></td></tr><tr><td>Cámara CCD</td><td>Fotometría Cascada</td><td>II: 512</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's (1x) L-15 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11415-064</td><td>Rat Disection</td></tr><tr><td>Typsin-EDTA (0.05%), Phenol red</td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td><td>Disección</td></tr> <tr><td>de ratasDMEM (1x) Medio Eagle Modificado de Dulbecco [+4,5 g/L de D-glucosa, + L-glutamina, + 110 mg/L de piruvato de sodio]</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td>Disección de Ratas</td></tr><tr><td>HBSS (1x) Solución salina equilibrada de Hank [- Cloruro de calcio, - Cloruro de magnesio, - Sulfato de magnesio]</td><td>Life Technologies</td><td>14170-112</td><td>Disección de ratas</td></tr></tbody></table>

rewiring neuronal circuits: un nuevo método para la extensión neurítica rápida y la conexión neuronal funcional

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Las lesiones cerebrales y de la médula espinal pueden conducir a una incapacidad permanente ya la muerte porque todavía no es posible regenerar las neuronas a largas distancias y reconectarlas con precisión con un objetivo apropiado. Aquí se describe un procedimiento para iniciar rápidamente, alargar y conectar con precisión nuevos circuitos neuronales funcionales a largas distancias. Las velocidades de extensión alcanzadas alcanzan más de 1,2 mm / h, 30-60 veces más rápido que las tasas in vivo de los axones de crecimiento más rápido del sistema nervioso periférico (0,02 a 0,04 mm / h) 28 y 10 veces más rápido de lo que se informó anteriormente para el mismo Neuronal tipo en una etapa anterior de desarrollo [ 4] . En primer lugar, las poblaciones aisladas de las neuronas del hipocampo de rata se cultivan durante 2-3 semanas en dispositivos microfluídicos para posicionar con precisión las células, lo que facilita la micromanipulación y reproducibilidad experimental. A continuación, se colocan perlas recubiertas con poli-D-lisina (PDL) sobre neuritas para formar adhesivoActúa y la micromanipulación con pipeta se utiliza para mover el complejo perla-neurita resultante. A medida que se mueve el cordón, extrae una nueva neurita que puede extenderse a lo largo de cientos de micrómetros y conectarse funcionalmente a una célula diana en menos de 1 h. Este proceso permite la reproducibilidad experimental y la facilidad de manipulación mientras se evitan las estrategias químicas más lentas para inducir el crecimiento de las neuritas. Las medidas preliminares presentadas aquí demuestran una tasa de crecimiento neuronal muy superior a las fisiológicas. La combinación de estas innovaciones permite el establecimiento preciso de redes neuronales en la cultura con un grado de control sin precedentes. Es un método novedoso que abre la puerta a una plétora de información y conocimientos sobre la transmisión de señales y la comunicación dentro de la red neuronal, además de ser un campo de juego en el que explorar los límites del crecimiento neuronal. Las aplicaciones potenciales y los experimentos son generalizados con implicaciones directas para las terapias que apuntan a reconectar neuronaL después del trauma o en enfermedades neurodegenerativas.

Las neuronas del hipocampo de ratas embrionarias se cultivan en dispositivos microfluídicos para permitir el posicionamiento preciso de células, perlas de PDL y micromanipuladores. El primer paso es montar adecuadamente el dispositivo microfluídico en un cubreobjetos o plato de vidrio. Es esencial que el dispositivo microfluídico esté bien unido al sustrato para evitar que las células salgan de las cámaras y se muevan bajo las partes del dispositivo que deben sellarse ( <strong class="xf...

Este procedimiento describe cómo iniciar, extender y conectar rápidamente neuritas organizadas en cámaras microfluídicas usando perlas revestidas con poli-D-lisina fijadas a micropipetas que guían la elongación de las neuritas.

Rewiring Neuronal Circuits: Un Nuevo Método Para La Extensión Neurítica Rápida Y La Conexión Neuronal Funcional

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

El objetivo general de este procedimiento es iniciar nuevas neuronas, extenderlas rápidamente y conectarlas con precisión a células diana. Este procedimiento solo es posible mediante el uso de células cultivadas en un entorno controlado y reproducible. Este método nos permite responder preguntas clave en neurociencia.¿Qué limita la tasa de crecimiento de las neuronas? ¿Qué tan rápido pueden crecer? ¿Desempeñan los indicios mecánicos un papel importante? También podemos estudiar cómo se forman las sinapsis, cómo encuentran las neuronas una célula diana, cómo envejecen y maduran las sinapsis. En tercer lugar, podemos comenzar a construir sistemáticamente redes neuronales y estudiar cómo calculan las neuronas.Las principales ventajas de esta técnica son que permite una manipulación sencilla, reproducibilidad experimental y, en última instancia, un alto grado de control a nivel de célula individual. Para comenzar este procedimiento, limpie y prepare el número deseado de laminillas estériles. A continuación, recubra cada laminilla con 0,5 a 1 mililitro de PDL a 100 microgramos por mililitro durante al menos dos horas a temperatura ambiente.Después de eso, lave las laminillas dos veces con agua y elimine todo el líquido. Deje que se sequen en un ambiente estéril durante 5 a 10 minutos o hasta que la superficie esté completamente seca. Luego, coloque los dispositivos microfluídicos con los patrones hacia arriba bajo la luz UV en una cabina de seguridad biológica durante 10 minutos.Después de 10 minutos, coloque un dispositivo microfluídico con el patrón hacia abajo en contacto con el portaobjetos limpio. Utilice las pinzas para presionar suavemente el dispositivo y que se adhiera al vidrio. Para llenar el dispositivo de población única con medio, agregue 50 microlitros de medio completo para células en el pozo superior derecho.Luego, agregue otros 50 microlitros de medio celular completo al pocillo diagonal a este. Para llenar el dispositivo de múltiples poblaciones con medio, agregue 30 microlitros de NBM completo a una fila de pocillos. Asegúrese de que el medio fluya entre los pocillos.Luego, agregue 50 microlitros de medio a cada uno de los pozos restantes. Coloque los dispositivos en una placa más grande con un recipiente abierto de agua autoclavada, y coloque el recipiente en la incubadora durante una a dos horas mientras prepara el cultivo celular. Ahora, retire el medio de los pozos superiores de los dispositivos microfluídicos sin vaciar los pozos.Luego, agregue 20 microlitros de la solución concentrada de células en el pozo superior derecho del dispositivo microfluídico y verifique bajo el microscopio cómo fluyen las células dentro del dispositivo microfluídico de población única. Para sembrar células en el dispositivo de múltiples poblaciones, agregue 20 microlitros de la solución concentrada de células en cada uno de los pozos superiores. Bajo el microscopio, verifique si las células están dentro de las cámaras.Posteriormente, coloque los dispositivos en el incubador durante 15 a 30 minutos para favorecer la adhesión celular al sustrato. Una vez que las células se adhieran al sustrato, agregue 40 microlitros de NBM a los dos pozos superiores del dispositivo de población única. Esto ayudará a eliminar las burbujas de aire de los microcanales.Añada 20 microlitros de MBM a los pozos superiores del dispositivo de múltiples poblaciones, es decir, los mismos pozos donde se inyectaron las células. El medio debe sobresalir ligeramente para formar un menisco positivo y dar a los pozos un aspecto similar al de una magdalena. Uno o dos días antes de retirar el dispositivo microfluídico, añada dos mililitros de NBM precalentado a cada placa de muestra e inunde las cámaras.Luego, mantenga los dispositivos en el incubador. Posteriormente, utilice pinzas estériles y una punta de pipeta para retirar los dispositivos microfluídicos de las laminillas, dejando una configuración patrón de neuronas. En este procedimiento, añada de 40 a 60 microlitros de las perlas recubiertas con PDL preparadas al cultivo celular.Luego, devuelva la muestra al incubador durante una hora para favorecer la formación de contactos sinápticos. Posteriormente, coloque la muestra en un montaje experimental de modo que las células puedan ser evaluadas desde arriba por dos micropipetas y también accedidas ópticamente. En esta configuración, una cámara CCD se encuentra en el puerto lateral del microscopio para la captura de imágenes.Conecte cada pipeta llena de solución salina a una jeringa de un mililitro y luego perfunda la muestra con solución salina fisiológica. A continuación, bajo el microscopio, verifique el espacio entre las dos poblaciones neuronales aisladas para asegurarse de que ambas poblaciones no estén conectadas naturalmente. Seleccione una perla de PDL que no esté unida al neutrón en el campo de visión.Alinee la perla con la punta de una micropipeta enfocando primero la perla y luego la micropipeta. Posteriormente, acerque la punta lo más posible a la perla mientras la monitorea a través del microscopio. A continuación, aplique presión negativa a la pipeta para recoger la perla y mantenga la presión negativa durante todo el experimento.Ahora, seleccione una perla de PDL unida a una neurona en el campo de visión y adjúntela a la segunda micropipeta mediante succión. Jale el complejo de perla de PDL y neurona moviendo lentamente ya sea el micromanipulador o la platina de la muestra a 0,5 micrómetros por minuto durante 1 micrómetro, y deténgase durante cinco minutos para permitir la iniciación del neurita. Jale el complejo de perla de PDL y neurona moviéndolo lentamente lateralmente a 0,5 micrómetros por minuto durante dos micrómetros, luego deténgase durante cinco minutos para permitir la elongación del neurita.Después de la iniciación exitosa y la extensión del neurita durante los primeros cinco micrómetros, tire continuamente del neurita a una velocidad de 20 micrómetros por minuto. Para conectar las neuronas, seleccione una región rica en neuritas. Utilice otras perlas para calibrar la altura de la punta de la pipeta sobre el cubreobjetos y baje el complejo de neurita con perla de PDL de modo que haga contacto físico con los neuritas.Deje el complejo de neurita con perlas de PDL en contacto con la neurita objetivo mientras manipula la segunda micropipeta. Luego, baje la segunda pipeta con la segunda perla de PDL encima de la neurita recién formada, aproximadamente a 20 micrómetros de la primera perla, y utilice la segunda perla de PDL para empujar el nuevo filamento de neurita hacia la célula objetivo. A continuación, mantenga ambas perlas en su lugar durante al menos una hora.Verifique la ausencia de hinchazón focal, un engrosamiento de las neuritas que contactan con el microesfera, utilizando el microscopio. Durante este tiempo, cambie lentamente el medio de la muestra desde solución salina fisiológica hasta NBM equilibrado con dióxido de carbono y precalentado. Suelte la microesfera de la segunda pipeta liberando la succión.Si la nueva neurita permanece unida, libere también la primera perla. Posteriormente, coloque cuidadosamente la muestra de vuelta en el incubador para fortalecer la conexión neuronal para experimentos futuros. Puede utilizar grabaciones de parche en célula completa para investigar la funcionalidad eléctrica de la conexión manipulada mediante micromanipulación.Se muestran aquí las poblaciones neuronales aisladas separadas por un espacio de 100 micrómetros en microdispositivos de PDMS. Se realizaron pares de registros mediante parche en configuración de célula íntegra, y se analizaron las conexiones inducidas mecánicamente, comparándolas con aquellas en poblaciones neuronales naturalmente conectadas y poblaciones no conectadas. Las respuestas eléctricas posteriores al potencial de acción pre-sináptico, registradas en neuronas conectadas naturalmente y mediante micromanipulación, son significativamente más altas y correlacionan temporalmente con la actividad pre-sináptica.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en ocho horas si se realiza correctamente, y al intentar este procedimiento, es importante recordar contar con cultivos celulares a largo plazo sanos y bien organizados para garantizar resultados rápidos y reproducibles. Tras seguir este procedimiento, se pueden utilizar diferentes métodos para verificar la funcionalidad eléctrica de la conexión micromanipulada. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cultivar poblaciones celulares en cámaras microfluídicas y emplear manipulaciones con pipeta para iniciar, extender y conectar neuritas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Perspectivas sobre la neurociencia

Este video muestra una técnica para la iniciación y extensión rápida de una neurona y la creación de nuevas conexiones con una neurona objetivo utilizando un dispositivo microfluídico y micromanipulación. Esto podría usarse para terapias que tienen como objetivo reconectar circuitos neuronales después de un trauma o en enfermedades neurodegenerativas.

Inicio de la extensión y formación rápidas de neuritas Conexiones neuronales funcionales

Se describe un protocolo para generar un sistema de cocultivo compuesto por neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), neuronas corticales primarias y astrocitos. Este sistema de cocultivo permite detectar la formación de contactos sinápticos y circuitos entre nuevas neuronas derivadas de iPSC y neuronas corticales preexistentes que expresan canalrodopsina-2.

Un enfoque optogenética para Evaluar formación de conexiones neuronales en un sistema de co-cultura

Este manuscrito describe un protocolo para crecer en redes modulares vitro consistentes espacialmente confinados, los circuitos neuronales interconectadas funcionalmente. Una máscara polimérico se utiliza para patrón de una capa de proteína para promover la adhesión celular sobre el sustrato de cultivo. Neuronas chapados crecen en zonas recubiertas establecimiento de conexiones espontáneas y que muestran actividad electrofisiológica.

Diseño, tratamiento de superficies, Celular Forrado, y cultivo de Modular Redes Neuronales Compuesto de circuitos conectados-Inter Funcionalmente

Modificamos e implementar un protocolo previamente publicado que describe la diferenciación rápida, reproducible y eficiente de los inducidos por el hombre células madre pluripotentes (hiPSCs) en neuronas corticales excitatorios 12. Específicamente, nuestra modificación permite el control de la densidad celular neuronal y su uso en matrices de micro-electrodos para medir las propiedades electrofisiológicas en el nivel de red.

Neuronal rápida diferenciación de células madre pluripotentes inducidas para la medición de actividad de red en matrices de micro-electrodos

Este manuscrito detalla la fabricación de redes neuronales de ingeniería micro-tejidos: construcciones tridimensionales de tamaño micrométrico compuestas por extensos tramos axonales alineados que abarcan la (s) población (es) neuronal (es) agregada (s) encerrada (s) en un hidrogel tubular. Estos andamios vivos pueden servir como relés funcionales para reconstruir o modular circuitos neuronales o como bancos de pruebas biofidelic imitando la neuroanatomía de la sustancia gris-blanca.

Anatomía Inspirada Tridimensional Micro-tejido Ingeniería de Redes Neuronales para la Reconstrucción del Sistema Nervioso, Modulación y Modelado

Nos muestra el desarrollo de los paquetes uno mismo-montado, tridimensionales de somata astrocytic longitudinalmente alineado y procesos dentro de un protector nuevo biomaterial. Estos diseñados "andamios de vida", que diámetro de la escala del micrón pero extiende centímetros de longitud, puede servir como bancos de pruebas para estudiar los mecanismos del desarrollo neurológico o facilitar la Neurorregeneración por dirige la migración neuronal y axonal pathfinding.

Ingeniería tisular tridimensional alineado astrositos redes para recapitular los mecanismos del desarrollo y facilitar la regeneración del sistema nervioso

Aquí presentamos un método para un modelo humano en vitro de estiramiento lesiones en un formato de 96 pozos en una escala de tiempo pertinente al trauma de impacto. Esto incluye métodos para la fabricación de placas estirables, cuantificar el insulto mecánico, cultivo y lesionar las células, la proyección de imagen y alto contenido análisis para cuantificar daños.

Método para la lesión de estiramiento de alta velocidad de humanos inducida por las neuronas derivadas de células madre pluripotentes en formato de 96 pocillos

Basado en la ingeniería lentiviral in vitro de precursores neuronales, su co-trasplante en cerebros de tipo salvaje y evaluación morfométrica emparejada de derivados de "prueba" y "control", este método permite el modelado preciso del control genético in vivo del neocortical morfología de las neuronas de una manera simple y asequible.

Trasplante Intraventricular de Precursores Neuronales Deingidos para Estudios de Neuroarquitectura In Vivo

En este informe, describimos un protocolo simple para estudiar el crecimiento de neurita en neuronas corticales de rata embrionaria mediante la co-transfección con EGFP y la proteína de interés.

Un ensayo mejorado basado en proteínas de fluorescencia verde para el estudio del crecimiento de neurita en las neuronas primarias

Los ensayos de excrecencia de neuritas proporcionan un valor cuantitativo sobre los procesos neuronales regenerativos. La ventaja de este software semiautomático es que segmenta los cuerpos celulares y las neuritas por separado mediante la creación de una máscara y mide varios parámetros, como la longitud de las neuritas, el número de puntos de ramificación, el área del grupo de cuerpos celulares y el número de grupos celulares.

Estandarización de un novedoso software semiautomático para la medición del crecimiento de neuritas 

Aprende a extender y conectar neuritas rápidamente usando cámaras microfluídicas con guía de micropipetas. Este método permite estudiar la formación de redes neuronales y la función sináptica con control preciso a nivel celular.

Rewiring Neuronal Circuits: Un Nuevo Método Para La Extensión Neurítica Rápida Y La Conexión Neuronal Funcional

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