Rewiring Neuronal Circuits: Un Nuevo Método Para La Extensión Neurítica Rápida Y La Conexión Neuronal Funcional

El objetivo general de este procedimiento es iniciar nuevas neuritas, extenderlas rápidamente y conectarlas con precisión a las células objetivo. Este procedimiento solo es posible mediante el uso de células cultivadas en un entorno controlado y reproducible. Este método nos permite responder a preguntas clave en neurociencia.

¿Qué limita la tasa de crecimiento de las neuronas? ¿A qué velocidad pueden crecer? ¿Las pistas mecánicas juegan un papel importante?

También podemos estudiar cómo se forman las sinapsis, ¿cómo encuentran las neuronas una célula diana? ¿Cómo envejecen y maduran las sinapsis? Y en tercer lugar, podemos empezar a construir redes neuronales de forma sistemática, estudiar cómo se computan las neuronas.

Las principales ventajas de esta técnica son que permite una fácil manipulación, reproducibilidad experimental y, en última instancia, un alto grado de control a nivel de una sola célula. Para comenzar este procedimiento, limpie y prepare el número deseado de cubreobjetos estériles. A continuación, cubra cada cubreobjetos con 0,5 a 1 mililitros de 100 microgramos por mililitro de PDL durante al menos dos horas a temperatura ambiente.

Después de eso, lave los cubreobjetos dos veces con agua y elimine todo el líquido. Déjelos secar en un ambiente estéril durante 5 a 10 minutos o hasta que la superficie esté completamente seca. Luego, coloque los dispositivos microfluídicos con los patrones hacia arriba bajo la luz ultravioleta en un gabinete de bioseguridad durante 10 minutos.

Después de 10 minutos, coloque un dispositivo microfluídico con el patrón hacia abajo en contacto con el cubreobjetos limpio. Use las pinzas para presionar suavemente el dispositivo para que se adhiera al vidrio. Para llenar el dispositivo de población única con medio, agregue 50 microlitros de medio celular completo al pocillo superior derecho.

Y luego agregue otros 50 microlitros de medio celular completo al pocillo en diagonal a él. Para llenar el dispositivo de poblaciones múltiples con medio, agregue 30 microlitros de NBM completo a una fila de pocillos. Asegúrese de que el medio fluya entre los pozos.

Luego, agregue 50 microlitros de medio a cada uno de los pocillos restantes. Coloque los dispositivos en un plato más grande con un plato abierto de agua esterilizada en autoclave y coloque el plato en la incubadora durante una o dos horas mientras prepara el cultivo celular. Ahora, retire el medio de los pocillos superiores de los dispositivos microfluídicos sin vaciar los pocillos.

A continuación, añada 20 microlitros de la solución celular concentrada en el pocillo superior derecho del dispositivo microfluídico y compruebe en el microscopio cómo fluyen las células dentro del dispositivo microfluídico de población única. Para colocar células en placas en el dispositivo de poblaciones múltiples, agregue 20 microlitros de la solución celular concentrada en cada uno de los pocillos superiores. Bajo el microscopio, verifique si las células están dentro de las cámaras.

Posteriormente, coloque los dispositivos en la incubadora durante 15 a 30 minutos para promover la unión de las células al sustrato. Después de que las células se adhieran al sustrato, agregue 40 microlitros de NBM a los dos pocillos superiores del dispositivo de población única. Esto ayudará a eliminar las burbujas de aire de los microcanales.

Agregue 20 microlitros de MBM a los pocillos superiores del dispositivo de poblaciones múltiples, los mismos pocillos donde se inyectaron las células. Los medios deben sobresalir ligeramente para formar un menisco positivo y dar a los pocillos un aspecto de muffin. Uno o dos días antes de la extracción del dispositivo microfluídico, agregue dos mililitros de NBM precalentado a cada placa de muestra e inunde las cámaras.

Luego, mantenga los dispositivos en la incubadora. Posteriormente, utilice pinzas estériles y una punta de pipeta para retirar los dispositivos microfluídicos de los cubreobjetos dejando una configuración de neuronas con patrón. En este procedimiento, y de 40 a 60 microlitros de las perlas recubiertas de PDL preparadas al cultivo celular.

Luego, regrese la muestra a la incubadora durante una hora para promover la formación de contactos sinápticos. A continuación, instale la muestra en una configuración experimental de modo que las células puedan evaluarse desde arriba mediante dos micropipetas, y también se pueda acceder a ellas ópticamente. En esta configuración, una cámara CCD se encuentra en el puerto lateral del microscopio para la captura de imágenes.

Conecte cada pipeta llena de solución salina a una jeringa de un mililitro y, a continuación, perfunda la muestra con solución salina fisiológica. A continuación, bajo el microscopio, compruebe el espacio entre las dos poblaciones neuronales aisladas para asegurarse de que las dos poblaciones no están conectadas de forma natural. Seleccione una cuenta PDL que no esté unida a la neurona en el campo de visión.

Alinee el cordón con la punta de una micropipeta enfocándose en el cordón y, a continuación, en la micropipeta. Posteriormente, acerque la punta lo más posible a la cuenta monitoreándola a través del microscopio. A continuación, aplique presión negativa a la pipeta para recoger el cordón y mantenga la presión negativa durante todo el experimento.

Ahora, seleccione una perla de PDL conectada a una neurona en el campo de visión y conéctela a la segunda micropipeta mediante succión. Tire del complejo de neuronas de perlas PDL moviendo lentamente el micromanipulador o la etapa de muestra a 0,5 micrómetros por minuto durante 1 micrómetro, y haga una pausa de cinco minutos para permitir la iniciación de la neurita. Tire del complejo de neuronas de perlas PDL moviéndolo lentamente lateralmente a 0,5 micrómetros por minuto durante dos micrómetros, luego haga una pausa de cinco minutos para permitir el alargamiento de la neurita.

Después de iniciar con éxito y extender la neurita durante los primeros cinco micrómetros, tire continuamente de la neurita a 20 micrómetros por minuto. Para conectar las neuronas, seleccione una región rica en neuritas. Utilice otras perlas para medir la altura de la punta de la pipeta por encima del cubreobjetos y baje el complejo de neuritas de perlas PDL para que entre en contacto físico con las neuritas.

Deje el complejo de neurita de perlas PDL en contacto con la neurita objetivo mientras manipula la segunda micropipeta. A continuación, baje la segunda pipeta con el segundo cordón de PDL sobre la neurita recién formada a unos 20 micrómetros del primer cordón, y utilice el segundo cordón de PDL para empujar el nuevo filamento de neurita hacia la célula objetivo. A continuación, sostenga ambas cuentas en su lugar durante al menos una hora.

Verifique con el microscopio la ausencia de hinchazón focal, un engrosamiento de las neuritas que entran en contacto con la perla. Durante este tiempo, cambie lentamente el medio de la muestra de solución salina fisiológica a NBM equilibrado con dióxido de carbono precalentado. Suelte el cordón de la segunda pipeta soltando la succión.

Si la nueva neurita permanece adherida, suelte también la primera cuenta. Después, vuelva a colocar la muestra con cuidado en la incubadora para reforzar la conexión neuronal para futuros experimentos. Puede utilizar grabaciones de abrazaderas de parche de celda completa para investigar la funcionalidad eléctrica de la conexión micromanipulada.

Aquí se muestran las poblaciones neuronales aisladas separadas por un espacio de 100 micrómetros en microdispositivos PDMS. Se realizaron registros de par a parche en configuración de célula completa, y se analizaron las conexiones inducidas mecánicamente y se compararon con las de poblaciones neuronales conectadas naturalmente y poblaciones no conectadas. Las respuestas eléctricas después del potencial de acción presináptico registrado por las neuronas conectadas naturalmente y por micromanipulación son significativamente mayores y se correlacionan temporalmente con la actividad presináptica.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en ocho horas si se hace correctamente, y al intentar este procedimiento, es importante recordar tener cultivos celulares sanos y bien modelados a largo plazo para garantizar resultados rápidos y reproducibles. Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar diferentes métodos para verificar la funcionalidad eléctrica de la conexión micromanipulada. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cultivar poblaciones celulares en cámaras microfluídicas y usar manipulaciones de pipetas para iniciar, extender y conectar neuritas.