Grabaciones de parche de sujeción de células enteras de células epiteliales primarias aisladas del epidídimo

El objetivo general de este procedimiento es aislar las células epiteliales del epidídimo de rata y medir las propiedades eléctricas de estas células principalmente disociadas utilizando el método de patch-clamp de células completas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología reproductiva, como la función del epidídimo, que es importante para la maduración de los espermatozoides y la herencia de los rasgos paternos. Esta técnica permite al usuario cauterizar las propiedades eléctricas de las células epiteliales del epidídimo aisladas para poder ilustrar la función fisiológica desconocida de estas células.

La demostración del procedimiento estará a cargo de Bao Li Zhang, un estudiante graduado de mi laboratorio. Para comenzar el procedimiento, desinfecte las herramientas de disección por inmersión en etanol al 70%. Luego, déjalos secar al aire.

A continuación, prepare el IMDM completo. A continuación, crear alícuotas de 50 ml en condiciones asépticas, sellar con Parafilm y almacenar a cuatro grados centígrados. Después de eso, prepare una solución de digestión de enzimas colágenas disolviendo la colagenasa tipo I y la colagenasa tipo II en RPMI, lo que da como resultado un miligramo por mililitro de cada colagenasa en la solución.

Filtre la solución a través de una membrana de 0,22 micrómetros. Luego, márquelo como solución de colagenasa y mantenga la solución a temperatura ambiente hasta su uso. A continuación, ajuste el volumen de la solución enzimática en función del peso de la enzima.

El volumen mínimo requerido para ambos epidídimos de cauda de una sola rata es de dos mililitros. Para diseccionar los epidídidos de la cauda de rata, se sacrifica al animal mediante el uso de pentobarbital sódico mediante inyección IP o mediante una cámara de isoflurano hasta que el animal no responda a la estimulación del pellizco de la cola, seguido de una dislocación cervical. Después, desinfecte la parte inferior del abdomen limpiándola con etanol al 70%.

Empuje suavemente los dos testículos hacia la parte inferior del abdomen y luego abra la parte inferior del abdomen cerca del escroto. Posteriormente, extraer la grasa del epidídimo y diseccionar todos los órganos reproductores. Luego, transfiéralos al plato con RPMI.

En una estación de trabajo limpia y controlada por flujo de aire, diseccione los epidídimos de la cola de los tejidos conectivos y grasos y la cápsula del epidídimo. Coloque un epidídimo con 0,2 mililitros de solución de colagenasa en un tubo de 1,5 mililitros. Para disociar las células individuales de los epidídidos de la cauda, corte los epidídimos en la solución de colagenasa con unas tijeras finas hasta que el tejido se convierta en un líquido pastoso.

Luego, enjuague las tijeras suavemente con el resto de la solución enzimática en el tubo. A continuación, coloque el tubo en una batidora térmica metálica durante 30 minutos a 37 grados centígrados con una velocidad de agitación de 1.000 rpm. A continuación, centrifuga la mezcla de tejido enzimático a temperatura ambiente durante tres minutos.

Después de eso, decanta el sobrenadante pegajoso que contiene principalmente los espermatozoides. A continuación, vuelva a suspender el pellet en un mililitro de IMDM completo para apagar toda la actividad enzimática. Posteriormente, transfiera la suspensión de la celda a un tubo de 50 mililitros que contenga 49 mililitros de RPMI.

Centrifugar la mezcla celular y decantar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet en un mililitro de IMDM completo con una trituración suave durante al menos cinco minutos para disociar las células individuales de la mezcla de tejido epididimario tratado con enzima. Separe las células epiteliales de otras células en condiciones asépticas y cultive la suspensión celular en una placa de Petri de 10 centímetros que contenga IMDM completo durante al menos ocho horas o durante la noche en una incubadora a 32 grados centígrados.

A la mañana siguiente, prepare los cubreobjetos estériles por inmersión en alcohol al 100%. Secar al aire y luego sumergirlos en una pequeña cantidad de medio de cultivo. Luego, coloque los cubreobjetos en platos de cultivo de seis centímetros o en pocillos individuales de un plato de 24 pocillos.

Ahora, recoja las células epiteliales disociadas recogiendo suavemente la suspensión celular de la placa de Petri, que consiste principalmente en células epiteliales. Centrifugar la suspensión celular a 30 veces G a temperatura ambiente durante cinco minutos y luego decantar el sobrenadante. A continuación, vuelva a suspender el pellet de celda en dos mililitros de IMDM completo.

Siembre 0,2 mililitros de la suspensión celular cosechada en el centro de cada cubreobjetos estériles. Deje que la suspensión de células se asiente en la gota de líquido durante al menos 10 minutos para permitir que las células se adhieran sin apretar a los deslizamientos de la cubierta de vidrio. Luego, agregue con cuidado un mililitro de IMDM completo en el borde de un plato de seis centímetros o 0,3 mililitros de IMDM completo a cada pocillo de una placa de 24 pocillos, sin alterar las células.

Mantenga las células individuales aisladas en cubreobjetos en la incubadora a 32 grados centígrados hasta que se realicen los experimentos de fijación de parche. El día del experimento de pinza de parche, descongele una alícuota de solución intracelular en hielo y manténgala fría durante el experimento de pinza de parche para evitar la degradación. A continuación, transfiera las células epiteliales de cultivo en el cubreobjetos de vidrio a la cámara de registro llena de PSS estándar a temperatura ambiente.

Cambie cuidadosamente el PSS de baño al menos dos veces con una pipeta antes de cualquier experimento de pinza de parche. Para establecer la configuración de la célula completa, sumerja la pipeta en la solución de baño a la velocidad más alta del micromanipulador. Busque la punta de pipeta en la pantalla conectada a la cámara digital.

Luego, reduzca la velocidad del micromanipulador al modo medio-alto. Compruebe rápidamente la resistencia de la micropipeta utilizando el comando de la interfaz de adquisición de datos aplicando un paso de voltaje generado desde el amplificador controlado por ordenador. Cambie a una nueva micropipeta si la resistencia está significativamente fuera de este rango.

Y establezca el potencial de unión líquida entre la pipeta y la solución de baño a cero usando el comando de compensación de pipeta en la interfaz de control del software. Controle la resistencia con la prueba de membrana. Si la resistencia es mayor que 500 megaohmios, pero menor que un gigaohmio, aplique un potencial negativo para ayudar a formar el gigaseal.

Mientras tanto, compense la corriente capacitiva transitoria de la micropipeta. En este momento, aplique un paso de hiperpolarización de 10 milivoltios desde un potencial de retención de cero milivoltios para la determinación de la resistencia del sello. Inmediatamente después de lograr una configuración exitosa de celda completa, aplique un paso de hiperpolarización de 10 milivoltios desde un potencial de retención de menos 60 milivoltios.

Cambie el modo de voltaje al modo de corriente cero y realice una grabación sin interrupciones de 10 segundos para medir el potencial de membrana en reposo de la celda. Después, vuelva rápidamente al modo de voltaje y permanezca en él. Aplique los protocolos de voltaje de acuerdo con los experimentos planificados y mida las respuestas de corriente.

Aquí están los ejemplos de las células epiteliales aisladas de los epidídidos de la cauda de rata antes y después de la recosecha del cultivo nocturno en el plato antes de los experimentos de fijación de parches. Esta figura muestra las corrientes típicas de células enteras registradas a partir de células epiteliales epididimarias individuales utilizando un protocolo de provocación de pulsos. La línea punteada indicaba los niveles de corriente cero.

Aquí está la relación de voltaje de corriente de las respuestas de corriente medidas en los puntos de tiempo indicados. Son los trazados representativos del potencial de membrana en reposo de las células principales dializadas con una solución de pipeta, ya sea con ATP o sin ATP. Y este gráfico de barras no muestra ninguna diferencia significativa entre el potencial inicial de la membrana en reposo de más ATP y menos ATP.

Los números entre paréntesis dentro de las barras indican el número de células analizadas de al menos tres animales. Y aquí están los análisis de correlación de la resistencia del sello y la resistencia de entrada de todas las celdas, o solo de las celdas principales, frente a los potenciales de reposo medidos en la pinza de corriente cero poco después del establecimiento de la celda completa y las magnitudes de corriente medidas en el paso de hiperpolarización a menos 100 milivoltios del potencial de retención. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en nueve horas si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar detener la digestión enzimática inmediatamente durante los pasos de aislamiento celular. De lo contrario, puede producirse una digestión excesiva, lo que puede dificultar la formación de un sello de gigaohmios y el fracaso de los experimentos de fijación de parches. Para mantener la salud del cultivo, es importante centrifugar la mezcla de células disociadas enzimáticamente a baja velocidad de 30 G durante dos o tres minutos, y luego decantar el sobrenadante pegajoso que contiene principalmente espermatozoides.

Siguiendo estos procedimientos, se pueden realizar otros métodos, como la obtención de imágenes de células vivas y las técnicas de cultivo de una sola célula, para responder a preguntas adicionales, como el potencial de membrana en reposo en células epiteliales vírgenes que podrían regular el comportamiento extracelular en condiciones controladas. Esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la biología reproductiva exploren las propiedades electrofisiológicas de las células epiteliales del epidídimo para la regulación de la maduración de los espermatozoides y la herencia de los rasgos adquiridos por el padre. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aislar las células epiteliales del epidídimo de rata y cómo medir las propiedades eléctricas de estas células utilizando el método de fijación de parche de celda completa.