Ex Vivo Proyección de imagen de los linfocitos de T CD8 residente en Tumor de pulmón humano rebanadas utilizando Microscopía Confocal

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes de las células T CD8 infiltrantes de tumores residentes marcadas con anticuerpos acoplados con fluorescencia dentro de cortadores de tumores de pulmón humano mediante microscopía confocal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en inmunología tumoral, como la naturaleza de los elementos que regulan positiva y negativamente la migración de células T dentro de los tumores humanos. La principal ventaja de esta técnica es que nos permite monitorizar el comportamiento diario de los linfocitos T CD8 residentes en un entorno tumoral humano preservado.

La primera vez que tuvimos una idea para este método fue cuando establecimos el método en los ganglios linfáticos de Myrin para rastrear las células T y plantarlas en rodajas, un protocolo publicado originalmente en JoVE en 2011. Para comenzar, agregue un gramo de agarosa de bajo punto de fusión en un recipiente y luego agregue 20 mililitros de PBS estéril sin calcio y magnesio. Calienta la solución en el microondas para disolver completamente la agarosa.

Enfríe esta solución de agarosa al 5% en una incubadora a 37 grados centígrados durante cinco minutos. En la campana de cultivo de tejidos, agregue 1,1 mililitros de medio RPMI-1640 completo en cada pocillo de una placa de subcultivo de seis pocillos. Luego, con un par de pinzas estériles, coloque un inserto de cultivo celular estéril de 30 milímetros en cada pocillo.

Incubar la placa a 37 grados centígrados durante 30 minutos hasta su uso posterior. A continuación, coloque la biopsia del tumor en un plato de plástico de 10 centímetros y, con una cuchilla afilada y estéril, corte el tumor en un pequeño fragmento en forma de cubo de aproximadamente cinco por cinco milímetros. Ahora, saque la solución de agarosa preparada de la incubadora.

Con un par de pinzas estériles, transfiera cuidadosamente los fragmentos del tumor a una toallita de tejido para drenar el exceso de medio, luego vierta la agarosa en un plato de plástico de 35 milímetros e inserte los fragmentos del tumor para colocarlos en el fondo del plato de plástico. Deje el gel de agarosa en hielo durante cinco minutos para que se solidifique. Una vez que la agarosa se solidifique, invierta el plato de plástico.

Con una espátula, libere todo el gel. Con una cuchilla afilada, recorte el exceso de agarosa que rodea los fragmentos tumorales, dejando de tres a cinco milímetros de gel alrededor del tejido. Con una gota de pegamento tisular no tóxico, monte el bloque de agarosa en el disco de muestra del vibrátomo.

Llene la bandeja tampón del vibratomo con PBS estéril e hiélico e instale el disco de muestra que contiene el bloque de agarosa en la bandeja. Ajuste la velocidad y la frecuencia del vibrátome a los valores deseados. Una vez que la configuración del vibratomo esté lista, saque la placa de seis pocillos de la incubadora.

Ahora comience a cortar el bloque montado en rodajas de 350 micras usando el vibratomo. Con la ayuda de pinzas finas, recoja cuidadosamente los cortes de tumor a medida que se cortan y colóquelos planos sobre los insertos de cultivo celular en la placa de seis pocillos. Transfiera una rebanada sobre cada inserto.

A continuación, con unas pinzas finas, coloque arandelas de acero inoxidable preesterilizadas y prehumedecidas en cada rebanada. Asegúrese de que las arandelas estén bien colocadas en la agarosa que rodea el tejido tumoral. Deje la placa a 37 grados centígrados durante 10 minutos en una incubadora humidificada de dióxido de carbono al 5% antes de la inmunotinción.

Diluir los anticuerpos marcados con fluorescencia requeridos y el colorante nuclear fluorescente, DAPI, a las concentraciones de vinilo requeridas en medio RPMI libre de rojo de fenol. A continuación, retire la placa de cultivo de la incubadora y, con una punta fina, aspire el líquido del interior de las arandelas de acero inoxidable. Ahora, sin tocar el corte, agregue 40 microlitros de los anticuerpos diluidos en cada corte de tumor.

Para permitir la tinción, incube la placa a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Una vez completado el paso de tinción, con pinzas finas, retire las arandelas. Luego, saque suavemente las rodajas y sumérjalas en Phenol Red free RMPI-1640 medium durante 10 segundos.

Vuelva a colocar las rodajas en los insertos de cultivo celular y agregue una gota de medio RMPI-1640 sin rojo de fenol sobre cada rebanada. Incube la placa a 37 grados centígrados durante 10 minutos y luego proceda a la toma de imágenes. Varias horas antes de comenzar este experimento, ajuste la temperatura de la cámara de calor del microscopio a 37 grados Celsius, luego prepare la configuración del microscopio para profusar constantemente cortes de tumor con medio RMPI oxigenado sin rojo de fenol y aspirar el soluto a un matraz de recolección de desechos usando una bomba peristáltica.

Con la ayuda de pinzas finas, levante la rebanada manchada de la placa de seis pocillos y transfiérala a un plato de plástico de 35 milímetros lleno de medio RMPI libre de rojo fenol, luego coloque un anclaje de rebanada sobre la rebanada para sostenerla. A continuación, coloque esta placa de Petri en la platina de imágenes del microscopio. Después de conectar las puntas de entrada y salida del sistema de perfusión, encienda la bomba peristáltica para permitir que el medio oxigenado pase a través de los tubos de perfusión.

Baje el objetivo de inmersión en agua a la rebanada y concéntrese en la parte superior de la rebanada con luz de campo brillante o con la longitud de onda adecuada. A continuación, utilizando los filtros adecuados, visualice y seleccione una región de interés que contenga todas las células de interés marcadas fluorescentemente, a saber, las células T CD8, los ojales tumorales y las células estromales CD90 positivas. Configure una sesión de imágenes utilizando la intensidad del láser y los tiempos de exposición adecuados para adaptarse al brillo de las señales fluorescentes observadas.

A continuación, configure el grosor de la pila Z para obtener una imagen dentro del corte del tumor. A continuación, seleccione el intervalo de tiempo de la imagen de la pila Z y el tiempo total de grabación para capturar imágenes en intervalos de tiempo específicos. Después de capturar y exportar las imágenes fluorescentes, analice la migración de células T CD8 como se describe en el protocolo de texto.

Aquí se muestra una imagen representativa de un corte de tumor de pulmón humano teñido. Obsérvese la distribución de los linfocitos T CD8 positivos de color verde, las células tumorales teñidas con moléculas de adhesión de células epiteliales azules y las células estromales CD90 o Thyrum positivas de color rojo. En particular, tenga en cuenta que las células T CD8 son más abundantes en el estroma en comparación con los ojales tumorales.

Aquí se representan las trayectorias de las células T CD8 residentes individuales teñidas de verde, y los compartimentos de células tumorales del estroma rojo y azul del corte del tumor de pulmón humano. El colágeno detectado mediante la segunda generación de armónicos y mostrado en rojo, marca el compartimento estromal. Aunque menos abundantes que los ojales tumorales, las células T CD8 migran más activamente en este compartimento en comparación con el estroma.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en generalmente cuatro o cinco horas si se realiza correctamente. Después de este video, debe tener una buena comprensión de cómo obtener muestras de tumores con inmunotinción, para monitorear las células T CD8 residentes usando un microscopio confocal.