Aislamiento de la población lateral en la leucemia linfoblástica aguda inducida por linfocitos T de Myc en peces cebra

El objetivo general de este procedimiento es aislar células de la población lateral a partir de un modelo de pez cebra de leucemia linfoblástica aguda inducida por myc en linfocitos T. El ensayo de población lateral se ha utilizado para identificar poblaciones de células madre y progenitoras en muchos tejidos normales y cancerosos. Sin embargo, aún no se ha aplicado a ningún modelo de cáncer en pez cebra.

La principal ventaja de esta técnica es que permite el aislamiento prospectivo de una población de células en el LLA-T de pez cebra que podría estar enriquecida en actividad de células madre cancerosas. Aunque el método que describimos aquí tiene amplias aplicaciones en la investigación de leucemia en pez cebra, también podría ser aplicable a otros tipos celulares de pez cebra malignos y no malignos. Las personas nuevas en este método podrían tener dificultades porque el método es sensible a cambios sutiles.

Aunque el método parece sencillo, se requiere una optimización para cada tipo de célula analizado. Prepare 20 mililitros de FBS al 10 por ciento inactivado por calor en PBS 0,9x. Añada un mililitro de la solución de FBS/PBS a un vial de sal sódica de heparina que contenga 300 unidades del anticoagulante.

Luego, utilizando un microscopio epifluorescente, seleccione peces en los que las células tumorales hayan invadido el 50 por ciento del cuerpo, o peces que se identifiquen con dificultad para comer o nadar. Eutanasiar al pez transfiriéndolo a una solución de uno a dos miligramos por mililitro de tricaina en agua para peces. Observe el movimiento branquial y los latidos del corazón para confirmar la eutanasia.

Después de retirar la cabeza del pez, inyecte con una pipeta 100 microlitros de solución de heparina en su cavidad corporal para eliminar los glóbulos rojos en exceso. Aspire todo el líquido que salga y píquetelo en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. Luego, utilizando puntas de pipeta nuevas, lave la cavidad corporal dos veces más o hasta que la solución de lavado no contenga sangre, y deseche el líquido recogido de todos los lavados.

Para recoger células leucémicas, inyecte 100 microlitros de solución FBS/PBS en la cavidad corporal previamente lavada. Bajo un microscopio estereoscópico, aplique presión suave sobre el cuerpo del pez con la punta de una pipeta para expulsar las células tumorales. Recoja el líquido liberado en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros.

Repita el aislamiento hasta que se recojan la mayoría de las células tumorales. Recoja todas las células en el mismo tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros y mantenga la suspensión obtenida a temperatura ambiente. A continuación, mezcle las células tumorales aisladas pipeteando suavemente para disociar los agregados celulares.

Filtre la suspensión celular a través de un filtro de malla de 40 micrómetros. Lave el filtro una o dos veces con 100 microlitros de FBS/PBS. Una vez filtrado, mantenga las células a temperatura ambiente.

Finalmente, en un nuevo tubo, mezcle dos microlitros de la suspensión celular con 18 microlitros de solución estéril de Azul de Tripano al 0,04 por ciento. Cargue 10 microlitros de la suspensión obtenida en un hemocitómetro y cuente las células tumorales fluorescentes viables. Es importante recolectar una muestra limpia de células de LLA-T.

La concentración de Hoechst tres tres tres cuatro dos utilizada aquí se basa en el número de células tumorales vivas recolectadas. Los restos celulares adicionales o las células no tumorales pueden interferir con el ensayo. Antes de la tinción celular, diluya el colorante Hoechst en agua libre de nucleasas para obtener una solución de trabajo de un miligramo por mililitro.

Guarde la solución preparada cubierta con papel de aluminio a cuatro grados Celsius. A continuación, disuelva 49,1 miligramos de verapamilo en un mililitro de DMSO para obtener una solución inhibidora de 100 micromolares. Luego, prepare la muestra añadiendo FBS/PBS, 2,5 microlitros de DMSO, 15 microlitros de colorante Hoechst al un miligramo por mililitro y 10⁶ células tumorales a un tubo fax con un volumen final de un mililitro.

Para preparar el control, agregue FBS/PBS, 2,5 microlitros de verapamilo 100 millones molar, 15 microlitros de colorante Hoechst al miligramo por mililitro, y agregue 10 a las seis células tumorales con un volumen final de un mililitro. Incube la muestra y el control en un baño de agua a 28 grados Celsius en la oscuridad durante 120 minutos. Después de la incubación, coloque inmediatamente las células sobre hielo y manténgalas en la oscuridad.

Centrifugar las células a 300 × g a 4 °C durante seis minutos. A continuación, eliminar el sobrenadante y lavar las células con un mililitro de FBS/PBS. Centrifugar las células a 300 × g a 4 °C durante seis minutos una vez más.

Una vez que las células se hayan centrifugado, retire el sobrenadante y re-suspenda las células en un mililitro de FBS/PBS. Mantenga las muestras a cuatro grados Celsius hasta la clasificación celular. Quince minutos antes de la clasificación celular, agregue dos microlitros de una solución stock de yoduro de propidio de un miligramo por mililitro por cada mililitro de la suspensión celular.

Luego, agite bien las muestras en vórtex. Analice las suspensiones de células de LLA-T de pez cebra teñidas utilizando un citómetro de flujo activado por fluorescencia. Excite las muestras con un láser UV para el análisis del colorante Hoechst y con un láser de 488 nanómetros para la detección de células de LLA-T positivas para yoduro de propidio o GFP.

Es posible que sea necesario optimizar el número de células, la concentración del colorante, la temperatura de incubación y la duración de la incubación para cada tipo celular diferente utilizado. Y los cambios en cada una de estas condiciones pueden alterar drásticamente los resultados del ensayo. Para identificar la población lateral entre las células de LLA-T aisladas de pez cebra, primero se excluyen los restos celulares y los agregados celulares.

La captación de yoduro de propidio y la expresión de GFP en una sola población celular se analizan luego para identificar las células tumorales viables. Para visualizar la población lateral, se comparan las emisiones azul y roja del colorante Hoechst. La población lateral aparece como una cola tenue de células que se extiende desde el lado izquierdo de la población celular principal hacia el eje de fluorescencia azul.

Se presentan aquí los resultados del análisis de la población lateral realizada en dos muestras diferentes de células tumorales. Se identificó una población lateral en ambos especímenes. Sin embargo, diferentes muestras tumorales contenían distintas cantidades de células de la población lateral.

Independientemente de la muestra de tumor analizada, el tratamiento de la muestra con un inhibidor de la bomba de expulsión como el verapamilo provocó la desaparición de la señal observada para las células previamente identificadas, confirmando aún más el fenotipo de población lateral. Una vez dominada, la técnica de población lateral en un linfoma linfoblástico T de pez cebra puede realizarse en menos de cuatro horas si se lleva a cabo correctamente y según lo presentado aquí. Al intentar este procedimiento, es importante recordar los pasos que han sido optimizados para el linfoma linfoblástico T de pez cebra, como la temperatura y el tiempo de incubación, la concentración del colorante y el inhibidor de la bomba de expulsión.

Estos pueden necesitar ser modificados para diferentes sistemas experimentales. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el aislamiento de ARN o ensayos de trasplante in vivo, con células de la población lateral ordenadas para abordar preguntas sobre la funcionalidad y la regulación génica de estas células. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar la población lateral de células del linfoblastoma agudo de células T en pez cebra.