Name: Diferenciación de los condrocitos de las células madre pluripotentes humanas inducidas por la sangre periféricas derivadas de la sangre (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Aprende a diferenciar condrocitos a partir de células madre pluripotentes inducidas derivadas de sangre periférica humana mediante un protocolo libre de suero y xeno. Este método reproducible ofrece una estrategia rentable para la reparación cartilaginosa personalizada.

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Los autores desean agradecer a Xiaobin Zhang por su plásmido. También damos las gracias a Shaorong Gao y Qianfei Wang por su amable ayuda durante el experimento. Este estudio cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No.81101346, 81271963, 81100331), el proyecto de talento de alto nivel de Beijing 215 (No.2014-3-025) y el Fondo del Hospital Chao-Yang de Beijing (No CYXX-2017-01), y la Asociación de Promoción de la Innovación Juvenil de la Academia China de Ciencias (YL).

El protocolo para la generación de HiPSCs de PBC se puede encontrar en nuestro estudio anterior [ 5] . El estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de nuestra institución. 1. Formación del Cuerpo Embrionario (EB) <ol><li> Hacer 50 ml de medio hiPSC: medio de Eagle modificado de Knockout Dulbecco (DMEM) suplementado con un reemplazo de suero knockout al 15% (KSR), suero bovino fetal al 5% (FBS), 1 x aminoácidos no esenciales, 2-mercaptoetanol 55 μM, 2 mM L -glutamina y 8 ng / ml de factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF). </li><li> Hacer 50 ml de medio de formación de EB: DMEM suplementado con KSR al 15%, FBS al 5%, aminoácidos no esenciales 1x, 2-mercaptoetanol 55 μM y L-glutamina 2 mM. </li><li> Hacer 50 ml de medio de cultivo basal: DMEM suplementado con 20% de FBS, 1 × aminoácidos no esenciales, 2-mercaptoetanol 55 μM y 2 mM de L-glutamina. </li><li> Preparar 10 ml de solución dispasa, 1 mg / ml en DMEM knockout. </li><li> CultuRe hiPSCs en placas de cultivo de tejidos de 60 mm con células alimentadoras ( es decir, una monocapa de células de fibroblastos embrionarios de ratón irradiados). Cuando las células son 80-90% confluentes, disociar las células con dispase y paso de los hiPSCs 1: 3 cada 4-5 días. Colocar las células en una incubadora de 37 ° C y 5% de CO 2 . </li><li> Se diseccionan las colonias hiPSC indiferenciadas en trozos más pequeños (aproximadamente 50 - 100 mu m de diámetro) usando una aguja de vidrio de extracción de fuego cuando las iPSC son confluentes al 80 - 90%. Generalmente, se usan colonias de hiPSC en un plato de 60 mm para generar EB en una placa de Petri de 100 mm. <ol><li> Cultivar menos de 100 pequeños trozos de colonias en una placa de Petri no adherente de 100 mm que contenga 10 ml de medio de formación de EB. Coloque los platos en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2 . </li></ol></li><li> Reemplazar aproximadamente el 25% del medio inicial con una cantidad igual del medio basal de cultivo cada 2 días. Incline el plato para dejar que los EBs se asienten. Retire con cuidado 3 mLDel medio superior y agregar 4 ml de medio de cultivo basal fresco. No molestar a los EBs. NOTA: Los EBs se caracterizan morfológicamente por las piezas de colonias, teniendo una apariencia redonda con bordes lisos bajo el microscopio. </li><li> Después de 10 días de cultivo en la placa de Petri no adherente, se cubre un nuevo plato de cultivo de tejidos de 100 mm con 4 ml de gelatina al 0,1% durante 30 minutos a 37ºC antes de su uso. </li><li> Transferir el medio más EBs de 100 mm, una placa de Petri no adherente a un tubo cónico de 15 ml. Deje que los EBs sedimenten durante 4-5 min. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y dejar menos de 0,5 ml de medio más EBs </li><li> Sembrar menos de 100 EB en un plato de cultivo de tejidos recubierto de gelatina de 100 mm con 10 ml de medio de cultivo basal. Coloque los platos en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2 . </li></ol> 2. Formación de pastillas celulares y diferenciación de condrocitos <ol><li> Hacer 10 ml de tripsina / ácido etilendiaminotetraacético al 0,25% (EDTA). Hacer 80 ml de basAl medio de cultivo: DMEM suplementado con FBS al 20%, aminoácidos no esenciales 1x, 2-mercaptoetanol 55 μM y L-glutamina 2 mM. </li><li> Hacer 10 ml de medio de diferenciación condrogénica: DMEM (glucosa alta) suplementado con solución de insulina-transferrina-selenio (ITS) al 10%, dexametasona 0,1 μM, ácido ascórbico 1 mM, piruvato sódico al 1% y factor de crecimiento transformante 10 ng / Beta 1 (TGF-β1). </li><li> Refrescar el medio con 10 ml de medio de cultivo basal después de 48 h. A continuación, refrescar el medio cada tres días con 10 ml de medio de cultivo basal. NOTA: Después de 10 días en cultivo, las proliferaciones de células fibroblásticas deberían haberse expandido desde los EB. <ol><li> Recubrir las placas de 100 mm con 4 ml de gelatina al 0,1% durante 30 minutos a 37 ° C antes de su uso. Deseche el sobrenadante celular y lave las células con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) una vez. </li><li> Se digieren las células con 3 ml de tripsina / EDTA al 0,25% a 37 ° C durante 5 min y se neutralizan con 4 mL de medio de cultivo basal. </li></ol></li><li> Disociar las células en células individuales pipeteando hacia arriba y hacia abajo 5-10 veces y pasarlos a través de una malla de nylon de 70 μm. Centrifugar la suspensión celular a 200 xg durante 5 min. Vuelva a sembrar las células en un nuevo plato de cultivo de tejidos recubierto de gelatina de 100 mm con 10 ml de medio de cultivo basal. </li><li> Refrescar el medio con 10 ml de medio de cultivo basal después de 48 h. A continuación, refrescar el medio cada tres días con 10 ml de medio de cultivo basal. NOTA: Las células adquieren una morfología homogénea similar a los fibroblastos. </li><li> Cuando se alcanza la confluencia del ~ 90-100% ( es decir, aproximadamente 5-7 días), se cosechan las células con 3 ml de tripsina / EDTA al 0,25% a 37 ° C durante 5 min. Neutralizar con 4 ml de medio de cultivo basal. Disociar las células en células individuales pipeteando hacia arriba y hacia abajo 5 veces. Utilice un hemocitómetro para contar el número de células. <ol><li> Coloque 3 x 10 5 células en un tubo de polipropileno de 15 ml. Centrifugar a 200 xgDurante 5 minutos a temperatura ambiente (RT). Re-suspender las células en 1 ml de medio de diferenciación condrogénica. </li></ol></li><li> Centrifugar las células a 300 xg durante 3 min y mantener las células en forma de pellets pequeños. Colocar el tubo en el 37 ° C y 5% CO 2 incubadora durante 21 días. No atornille la tapa firmemente y deje que el intercambio de gas. </li><li> Reemplazar 3/4 del medio de cultivo cada tres días con medio de diferenciación condrogénica fresca. NOTA: Después de 21 días en cultivo, deben formarse gránulos hiPSC-condrogénicos (hiPSC-Chon). También se recogen células madre mesenquimatosas humanas (MSC), como control positivo, y se cultivan en el medio de diferenciación condrogénica durante 21 días para formar pastillas condrogénicas (hMSC-Chon). </li></ol> 3. Análisis de la diferenciación condrogénica <ol><li> Preparar 10 ml de formalina con tampón neutro al 10%. </li><li> Preparar 50 ml de reactivo azul alciano al 0,1% y 50 ml de reactivo azul de toluidina al 1%. </li><li> PrEpare 1 mL de los anticuerpos primarios: anticuerpos policlonales de conejo contra el colágeno II (1:50) o anticuerpos monoclonales de ratón contra el colágeno X (1:50). También, preparar anticuerpos secundarios de conejo o de ratón. </li><li> Hacer 1 mL de solución de papaína: 10 U / mL en PBS con acetato de sodio 0,1 M, EDTA 2,4 mM y L-cisteína 5 mM. </li><li> Hacer 100 ml de solución de colorante azul de dimetilmetileno (DMMB): 100 μl de azul de 1,9-dimetilmetileno 16 mg / L, glicina 40 mM, NaCl 40 mM y HCl 9,5 mM; PH 3,0. </li><li> Evaluar la diferenciación condrogénica por azul alcian y azul toluidina manchas de las secciones de pellets. <ol><li> Fijar un gránulo hiPSC-Chon o pellet hMSC-Chon en 1 mL de formalina con tampón neutro al 10% durante 24 h. </li><li> Transferir el pellet a 1 ml de etanol al 70% en H 2 O. deshidratar el pellet con 1 ml de una serie de etanol graduada (es decir, 25, 50, 75, 90, 95, 100, y 100%, 3 minutos cada uno). </li><li> Aclare el gránulo en 1 ml de xileno al 100% tres veces. InfiltratE el gránulo con parafina durante 1 h en un horno a 65 ° C. Incrusta el gránulo en bloques de parafina con un molde de 7 x 7 x 5 mm 3 bases, siguiendo los procedimientos histológicos de rutina 6 . </li><li> Hacer secciones adyacentes por microtomo con un grosor de aproximadamente 4 μm 7 . Adherir las secciones sobre diapositivas de vidrio. </li><li> Seque los portaobjetos durante 2 h a 60 ° C en un horno. Desparafinar las secciones en tres ciclos (3 min cada uno) utilizando 100% de xileno. </li><li> Utilice una serie de alcohol decreciente para la rehidratación ( es decir, 100, 100, 95, 95, 70, 50 y 25% en H 2 O, 3 min cada uno) y luego realice un enjuague final con agua desionizada durante 5 min. </li><li> Mancha las secciones con 0,1% de azul alciano reactivo o 1% toluidina tinción azul durante 4-5 h y luego enjuagar con agua destilada. </li><li> Deshidratar con una serie graduada de etanol ( es decir, 25, 50, 75, 90, 95, 100 y 100%, 3 min cada), seguido de tresEps de clarificación en xileno al 100%. Montar las diapositivas y visualizarlas bajo un microscopio. </li></ol></li><li> Realizar la inmunohistoquímica. NOTA: Las secciones de pellets adicionales se evalúan adicionalmente mediante inmunohistoquímica. <ol><li> Después de la desparafinización y la rehidratación, llevar las diapositivas a ebullición en 1 mM EDTA, pH 8,0 (impermeable en agua hervida por autoclave). Dejarlos reposar durante 8 min a una temperatura de sub-ebullición y luego dejar que los portaobjetos se enfríen a TA. </li><li> Enjuague los portaobjetos con agua desionizada 3 veces. Incubar las secciones en 3% H 2 O 2 solución en metanol a TA durante 15 min para bloquear la actividad peroxidasa endógena. </li><li> Enjuagar los portaobjetos con agua desionizada y sumergirlos en DPBS durante 5 min. Aplique 50-100 μl de anticuerpo primario diluido apropiadamente (1:50) a las secciones de los portaobjetos y luego incube en una cámara humidificada a RT durante 1 h. </li><li> Lavar los portaobjetos 3 veces (5 min cada uno) con DPBS. Incubar la saMples con los correspondientes anticuerpos secundarios ( es decir, anti-conejo o ratón) durante 15 min a RT. </li><li> Lavar los portaobjetos 3 veces (durante 5 min cada uno) con DPBS. Realizar la detección de DAB bajo un microscopio. </li><li> Lavar los portaobjetos con DPBS 3 veces (2 min cada uno). Contraste los núcleos de las células sumergiendo los portaobjetos en hematoxilina durante 1-2 min. Deshidratar con una serie de etanol graduada (25, 50, 75, 90, 95, 100 y 100%, 3 min cada uno) seguido de tres pasos consecutivos de clarificación con xileno. Finalmente, monte las diapositivas y visualícelas bajo el microscopio. </li></ol></li><li> Detectar el contenido de sGAG. <ol><li> Digerir gránulos condrogénicos en solución de papaína a 60 ° C durante 2 h. </li><li> Determinar el contenido de ADN utilizando el kit de ensayo dsDNA y el sistema de fluorómetro. Mida el contenido de sGAG mezclándolo con solución de colorante DMMB bajo medición de absorbancia a 525 nm 8 . </li><li> Calcular la concentración de sGAG frente a una curva estándar deSulfato de condroitina de tiburón. </li></ol></li><li> Realice el análisis PCR en tiempo real de los marcadores de diferenciación condrogénica en píldoras HiPSC-Chon. <ol><li> Coseche 3-4 de los mismos gránulos condrogénicos añadiendo 500 μl de reactivo de extracción enfriado con hielo a un tubo. Vórtice bien. Incubar la muestra durante 5 min a TA. </li><li> Añadir 0,1 ml de cloroformo. Vórtice la muestra durante 15 s e incubar a RT durante 3 min. Centrifugar la muestra durante 15 min a 12.000 xg y 4 ° C. Transferir la fase acuosa superior (aproximadamente 250 μl) a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Añadir 25 μl de acetato de sodio y 1 μl de glucógeno a la muestra. Precipitar el ARN mezclándolo con 250 μl de alcohol isopropílico. Mezcle bien. Incubar la muestra a RT durante 10 min. </li><li> Centrifugar durante 10 min a 12.000 xg y 4 ° C. Retire completamente el sobrenadante. Lavar el sedimento de ARN dos veces con 500 μl de etanol al 75%. </li><li> Centrifugar durante 5 minA 7.500 xg y 4 ° C. Retire todo el etanol restante y seque con aire la pastilla de ARN durante 5-10 minutos. Disolver el ARN en 10 μl de agua libre de nucleasa. </li><li> Convertir el ARN en cDNA utilizando un sistema de transcriptasa inversa. Sujeción de las muestras de cDNA a PCR en tiempo real utilizando qPCR kit master mix (2x) y un sistema de PCR en tiempo real [ 9] . NOTA: Las secuencias de cebadores son: H AGGRECAN -F: TCGAGGACAGCGAGGCC; H AGGRECAN -R: TCGAGGGTGTAGCGTGTAGAGA; H beta - ACTIN - F : TTTGAATGATGAGCCTTCGTCCCC; H beta - ACTIN - R: GGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGC; H COL2 - F: TGGACGATCAGGCGAAACC; H COL2- R: GCTGCGGATGCTCTCAATCT; H SOX9 - F: AGCGAACGCACATCAAGAC; H SOX9- R: CTGTAGGCGATCTGTTGGGG; H COL10 -F: ATGCTGCCACAAATACCCTTT; H COL10- R: GGTAGTGGGCCTTTTATGCCT. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Diekman, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+tissue+engineering+using+differentiated+and+purified+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Cartilage tissue engineering using differentiated and purified induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (47), 19172-19177 (2012).</li>
<li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134 (5), 877-886 (2008).</li>
<li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human blood.</a> Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).</li>
<li>Zhang, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Proteomics+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cellular reprogramming of human peripheral blood cells.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (5), 264-274 (2013).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+blood+cells+into+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+new+cell+source+for+cartilage+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of blood cells into induced pluripotent stem cells as a new cell source for cartilage repair.</a> Stem Cell Res Ther. 7 (31), (2016).</li>
<li>Canene-Adams, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry.</a> Methods Enzymol. 533, 225-233 (2013).</li>
<li>Solchaga, L. A., Penick, K. J., Welter, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+differentiation+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells%3A+tips+and+tricks%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells: tips and tricks.</a> Methods Mol Biol. 698, 253-278 (2011).</li>
<li>Oldershaw, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+toward+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human embryonic stem cells toward chondrocytes.</a> Nat Biotechnol. 28 (11), 1187-1194 (2010).</li>
<li>Monje, L., Varayoud, J., Luque, E. H., Ramos, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+exposure+to+bisphenol+A+modifies+the+abundance+of+estrogen+receptor+alpha+transcripts+with+alternative+5%27-untranslated+regions+in+the+female+rat+preoptic+area%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Neonatal exposure to bisphenol A modifies the abundance of estrogen receptor alpha transcripts with alternative 5'-untranslated regions in the female rat preoptic area.</a> J Endocrinol. 194 (1), 201-212 (2007).</li>
<li>Teramura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+mesenchymal+progenitor+cells+with+chondrogenic+property+from+mouse-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reprogram%22%5BJournal%5D)">Induction of mesenchymal progenitor cells with chondrogenic property from mouse-induced pluripotent stem cells.</a> Cell Reprogram. 12 (3), 249-261 (2010).</li>
<li>Su, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+integration-free+ips+cells+from+human+adult+peripheral+blood+using+BCL-XL+together+with+Yamanaka+factors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of integration-free ips cells from human adult peripheral blood using BCL-XL together with Yamanaka factors.</a> PLoS One. 8 (5), e64496(2013).</li>
<li>Carey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+factor+stoichiometry+influences+the+epigenetic+state+and+biological+properties+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (6), 588-598 (2011).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+nonviral+method+to+generate+integration-free+human-induced+pluripotent+stem+cells+from+cord+blood+and+peripheral+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells.</a> Stem Cells. 31 (3), 458-466 (2013).</li>
<li>Staerk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).</li>
<li>Qu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+in+chondrocyte+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic differentiation of human pluripotent stem cells in chondrocyte co-culture.</a> Int J Biochem Cell Biol. 45 (8), 1802-1812 (2013).</li>
<li>Guzzo, R. M., Gibson, J., Xu, R. H., Lee, F. Y., Drissi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+iPSC-derived+mesenchymal+stem+cells+to+chondroprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human iPSC-derived mesenchymal stem cells to chondroprogenitor cells.</a> J Cell Biochem. 114 (2), 480-490 (2013).</li>
<li>Koyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+differentiated+into+chondrogenic+lineage+via+generation+of+mesenchymal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells differentiated into chondrogenic lineage via generation of mesenchymal progenitor cells.</a> Stem Cells Dev. 22 (1), 102-113 (2013).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+insulin-transferrin-selenium+in+auricular+chondrocyte+proliferation+and+engineered+cartilage+formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of insulin-transferrin-selenium in auricular chondrocyte proliferation and engineered cartilage formation in vitro.</a> Int J Mol Sci. 15 (1), 1525-1537 (2014).</li>
<li>Guzzo, R. M., Scanlon, V., Sanjay, A., Xu, R. H., Drissi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+cell+type-specific+iPS+cells+with+enhanced+chondrogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Establishment of human cell type-specific iPS cells with enhanced chondrogenic potential.</a> Stem Cell Rev. 10 (6), 820-829 (2014).</li>
<li>Goepfert, C., Slobodianski, A., Schilling, A. F., Adamietz, P., Portner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+engineering+from+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Biochem+Eng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cartilage engineering from mesenchymal stem cells.</a> Adv Biochem Eng Biotechnol. 123, 163-200 (2010).</li>
<li>Ingber, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+and+developmental+biology%3A+going+biomimetic%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering and developmental biology: going biomimetic.</a> Tissue Eng. 12 (12), 3265-3283 (2006).</li>
<li>Yoshida, Y., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+stem+cell+advances%3A+induced+pluripotent+stem+cells+for+disease+modeling+and+stem+cell-based+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration.</a> Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).</li>
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Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, proporcionamos un protocolo para generar condrocitos de PBCs a través de iPSCs. Debido a que los PBC son más comunes y ampliamente utilizados en el campo clínico, se presentan como una alternativa potencial para la reprogramación. En este estudio, los vectores episomales (EV) se utilizaron para reprogramar PBCs en iPSCs, siguiendo el método establecido por Zhang et al. 11 . Este enfoque libre de integración no implica la integración de la genotoxicidad asociada a virus, que se cree...

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The corresponding author was updated from:
Yueying Li 
yueyinglee2010@hotmail.com 
Key Laboratory of Genomic and Precision Medicine, Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences
The corresponding author is now listed as:
Tie Liu 
waterkins@163.com 
Department of Orthopedics, Beijing Chao-Yang Hospital, Capital Medical University

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Erratum: Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

El tejido del cartílago tiene una capacidad muy baja para auto-reparación y regeneración. Varias intervenciones quirúrgicas y tratamientos biológicos se utilizan para restaurar el cartílago y la función de las articulaciones, con resultados insatisfactorios. El reciente desarrollo de la tecnología de células madre puede cambiar todo el campo de reparación de cartílago 1 . Varias células madre han sido estudiadas como células de semillas, pero las células madre pluripotentes inducidas por el hombre (hiPSCs) parecen ser la opción más prometedora, ya que pueden proporcionar muchos tipos de células específicas del paciente sin causar reacciones de rechazo 2 . Además, pueden superar la limitada naturaleza proliferativa de las células adultas y mantener su auto-renovación y habilidades pluripotentes. Además, la orientación génica puede usarse para cambiar el genotipo para obtener tipos específicos de condrocitos. Los fibroblastos han sido ampliamente utilizados para generar iPSCs porque sus potenciales de reprogramación también han sido bien estudiados.Sin embargo, todavía hay algunas limitaciones que deben ser superadas, como la biopsia dolorosa de los pacientes y la necesidad de la expansión in vitro de los fibroblastos, lo que puede dar lugar a mutaciones genéticas [ 3] . Recientemente, los PBCs resultaron ventajosos para la reprogramación 4 ; Además, eran comúnmente utilizados y abundantemente almacenados. Es posible que puedan reorientar el enfoque del estudio de la piel. Sin embargo, a nuestro leal saber y entender, hay pocos informes sobre reprogramación PBC seguida de diferenciación en condrocitos. En el presente estudio, utilizamos PBCs como una fuente alternativa de reprogramar en iPSCs y luego diferenciar el iPSCs en el linaje condrogénico a través de un sistema de cultivo de pellets con el fin de imitar la formación de condrocitos.

<table><tbody><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Invitrogen 10829018</td><td></td><td>Medio basal utilizado para el cultivo de hiPSC y el medio de formación de EB</td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td>Un suplemento de medio más definido y libre de FBS utilizado para el cultivo de hiPSC y el medio de formación de EB</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>sh30070.03</td><td>Utilizado para el cultivo de hiPSC y el medio de formación de EB, ofrece un excelente valor para la célula cultivo</td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales</td><td>Chemicon</td><td>TMS-001-C</td><td>Utilizado como suplemento de crecimiento en todos los medios de cultivo celular, para aumentar el crecimiento celular y la viabilidad</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>TMS-002-C</td><td>Un aminoácido necesario para el cultivo celular</td></tr><tr><td>Factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Una citocina utilizada para mantener la pluripotencia y la autorrenovación de las hiPSC</td></tr><tr><td>Dispasa</td><td>Invitrogen</td><td>17105041</td><td>Se utiliza para la disociación de hiPSC para el subcultivo</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>C11960</td> Medio <td>basal utilizado para el medio de cultivo MSC</td></tr><tr><td>0,1% gelatina</td><td>Millipore</td><td>ES-006-B</td><td>Se utiliza para la unión de células en las placas</td></tr><tr><td>0,25% de tripsina/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>Se utiliza para la disociación celular</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td>Una solución salina equilibrada utilizada para el lavado celular o la preparación de reactivos</td></tr> de <tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>invitrogen</td><td>21985023</td><td>Se utiliza como suplemento de crecimiento en todos los medios de cultivo celular.</td></tr><tr><td>ITS</td><td>invitrogen</td><td>41400045</td><td>insulina, transferrina, solución de selenio.Se utiliza para la diferenciación cronogénica.</td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma</td><td>4403</td><td>Conocido como vitamina C. Ayuda en el crecimiento activo y tiene propiedades antioxidantes.</td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>Añadido al medio de cultivo celular como fuente de energía además de la glucosa.</td></tr><tr><td>Factor de crecimiento transformante-beta 1</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-21C</td><td>Citoquinas que regulan la proliferación celular, el crecimiento y la diferenciación condrogénica.</td></tr><tr><td>Anticuerpos policlonales de conejo contra el colágeno II</td><td>Abcam</td><td>ab34712</td><td>Este anticuerpo reacciona con los colágenos de tipo II, que es específico de los tejidos cartilaginosos.</td></tr><tr><td>Anticuerpos monoclonales de ratón contra el colágeno X</td><td>Abcam</td><td>ab49945</td><td>Este anticuerpo reacciona con el colágeno tipo X, que es un producto de los condrocitos hipertróficos.</td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td>Para el montaje y almacenamiento a largo plazo de portaobjetos</td></tr><tr><td>Azul de toluidina</td><td>Sigma</td><td>89640</td><td>Se utiliza para la detección de proteoglicanos.</td></tr><tr><td>Azul alcián</td><td>Amresco</td><td>#0298</td><td>Se utiliza para la detección de glucosaminoglicanos.</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Sigma</td><td>P4762-25MG</td><td>Se utiliza para digerir gránulos condrogénicos.</td></tr><tr><td>Azul de dimetilmetileno</td><td>Sigma</td><td>341088-1G</td><td>Se utiliza para cuantificar glicosaminoglianos</td></tr><tr><td>Sulfato de condroitina sal sódica de cartílago de tiburón</td><td>Sigma</td><td>C4384-250MG</td><td>Se utiliza para dibujar la curva estándar para la medición del contenido de sGAG.</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS kit de ensayo</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851 (100)</td><td>Se utiliza para determinar el contenido de ADN</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>Se utiliza para el aislamiento de ARN de células</td></tr><tr><td>Sistema de transcriptasa inversa</td><td>Promega</td><td>A3500</td><td>Se utiliza para convertir el ARN en ADNc</td></tr><tr><td>Kit de qPCR SYBR FAST Master Mix</td><td>Kapa</td><td>KK4601</td><td>Se utiliza para PCR en tiempo real</td></tr></tbody></table>

diferenciación de los condrocitos de las células madre pluripotentes humanas inducidas por la sangre periféricas derivadas de la sangre

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

En este estudio, hemos utilizado las células sanguíneas periféricas (PBC) como células de semillas para producir condrocitos a través de inducida por células madre pluripotentes (iPSCs) en un método de integración libre. Después de la formación del cuerpo embrionario (EB) y la expansión de las células fibroblásticas, las iPSC se indujeron para la diferenciación condrogénica durante 21 días en condiciones sin suero y sin xeno. Después de la inducción de los condrocitos, los fenotipos de las células se evalúan mediante análisis morfológicos, inmunohistoquímicos y bioquímicos, así como por el análisis cuantitativo en tiempo real de los marcadores de diferenciación condrogénica. Los gránulos condrogénicos muestran coloración alcian azul positivo y tinción con azul de toluidina. La inmunohistoquímica de la tinción con colágeno II y X también es positiva. El contenido de glicosaminoglicano sulfatado (sGAG) y los marcadores de diferenciación condrogénica COLLAGEN 2 ( COL2 ), COLLAGEN 10 ( COL10 ), SOX9 y AGGRECAN están significativamente regulados positivamente en chondGránulos rogénicos en comparación con hiPSCs y células fibroblásticas. Estos resultados sugieren que los PBC pueden ser utilizados como células de semilla para generar iPSCs para la reparación del cartílago, que es específico del paciente y rentable.

Diferenciación condrogénica de hiPSCs: El medio de formación EB y el medio basal de cultivo se utilizaron para diferenciar los hiPSCs en el linaje mesenquimal. Se utilizó un método de cultivo en múltiples etapas ( Figura 1 ). En primer lugar, los hiPSCs se diferenciaron espontáneamente a través de EB formación durante 10 días (D10, Figura 2A ]. En segundo lugar, las célu...

Presentamos un protocolo para generar un linaje condrogénico a partir de sangre periférica humana (PB) a través de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) utilizando un método de integración libre, que incluye la formación de células embrionarias (EB), expansión de células fibroblásticas y inducción condrogénica.

Diferenciación de los condrocitos de las células madre pluripotentes humanas inducidas por la sangre periféricas derivadas de la sangre

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

El objetivo general de este procedimiento es generar células de linaje condrogénico a partir de células madre pluripotentes inducidas derivadas de sangre periférica humana, o células IPS. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la regeneración del cartílago sobre el uso de células sanguíneas periféricas derivadas del paciente como células C para la generación de células IPS destinadas a la reparación del cartílago. Las principales ventajas de esta técnica son su fácil reproducibilidad y que la diferenciación en condrocitos ocurre en condiciones libres de suero y de componentes ajenos.Comience sembrando células IPS humanas en cuatro mililitros de medio para células IPS humanas sobre una placa de cultivo celular de 60 milímetros que contenga una monocapa de fibroblastos embrionarios de ratón irradiados como células alimentadoras. Incube las células a 37 grados Celsius en un ambiente con cinco por ciento de dióxido de carbono. Cuando las células madre alcancen una confluencia del 80 al 90 por ciento, disocie las células con solución de dispasa para su subcultivo.Después de dos o tres pases, utilice una aguja de vidrio esterilizada al fuego para disecar la c

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

El artículo describe la metodología detallada para diferenciar eficazmente células madre pluripotentes humanas en cardiomiocitos mediante la modulación de la vía Wnt selectivamente, seguido por citometría de flujo análisis de marcadores de referencia para evaluar la homogeneidad e identidad de la población.

Alta Eficiencia Diferenciación de células madre pluripotentes humanas a cardiomiocitos y Caracterización por citometría de flujo

El estrés mecánico puede inducir la diferenciación condrogénica de las células madre, proporcionando un enfoque terapéutico potencial para la reparación del cartílago dañado. Presentamos un protocolo para inducir la diferenciación condrogénica de células madre derivadas del tejido adiposo (ASCs) utilizando la gravedad centrífuga (CG). La regulación positiva de SOX9 inducida por CG da como resultado el desarrollo de fenotipos condrogénicos.

La diferenciación condrogénica de inducción de las células madre derivadas de tejido adiposo por la gravedad centrífuga

Aquí, presentamos pluripotentes humanas protocolos de cultura de la célula de vástago (hPSC), solía diferenciarse hPSCs a CD34+ de progenitores hematopoyéticos. Este método utiliza la manipulación de la fase específica de canónica WNT de señalización especificar las células exclusivamente ya sea definitivo o primitiva hematopoyética programa.

Dirige la diferenciación de progenitores hematopoyéticos primitivo y definitivo de las células madre Pluripotent humanas

Aquí, proponemos un protocolo para la diferenciación condrogénica de células madre pluripotentes inducidas por humanos derivadas de células mononucleares de sangre del cordón umbilical.

Formación de gránulos condrogénicos a partir de células madre pluripotentes inducidas derivadas de sangre del cordón umbilical

Proponemos un protocolo que muestra cómo distinguir keratinocytes derivados de células madre pluripotentes inducidas y fibroblastos y generar un organoide de piel 3D, usando estos queratinocitos y fibroblastos. Este protocolo contiene un paso adicional de generar un modelo de ratones humanizados. La técnica presentada aquí mejorará la investigación dermatológica.

Generación de 3D piel organoide de cable derivadas de sangre inducida por las células de vástago Pluripotent

El objetivo de este protocolo es para poner a prueba la capacidad de diferenciarse en múltiples linajes celulares de células progenitoras derivadas de tejido adiposo de humanos perivascular. Diferenciación fue comparada con las células madre mesenquimales derivadas de médula ósea humana, que se conoce a diferenciarse en adipocitos, Osteocito y linajes de condrocitos.

Capacidad de diferenciación de las células del Progenitor humano aórtica adiposo Perivascular gratis

Aquí se presenta un protocolo simple para la diferenciación dirigida de células endoteliales hemogénicas de células madre pluripotentes humanas en aproximadamente 1 semana.

Diferenciación dirigida de células endoteliales hemogénicas de células madre pluripotentes humanas

Este protocolo describe y compara dos métodos representativos para diferenciar las hiPSC en células estromales mesenquimales (MSC). El método monocapa se caracteriza por un menor costo, una operación más simple y una diferenciación osteogénica más fácil. El método de los cuerpos embrioides (EB) se caracteriza por un menor consumo de tiempo.

Comparación de dos métodos representativos para la diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas en células estromales mesenquimales

Este protocolo presenta la diferenciación de osteoclastos humanos de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) y describe métodos para la caracterización de osteoclastos y precursores de osteoclastos.

Diferenciación y caracterización de osteoclastos a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas

Este protocolo detalla el aislamiento de condrocitos, condroperogenitores derivados del ensayo de adhesión a la fibronectina (FAA-CP) y condroprogenitores migratorios (MCP) del cartílago articular humano. Abarca la digestión enzimática, la adhesión a la fibronectina y los ensayos basados en la migración para aislar y caracterizar estas células.

Aislamiento de condrocitos y condroprogenitores mediante adhesión de fibronectina y ensayo migratorio

Este estudio describe un método para producir esferoides condrocíticos mediante la agregación de células en esferoides en condiciones de baja adherencia utilizando la gravedad, seguido de un cultivo de los esferoides resultantes en mini-biorreactores.

Generación de esferoides a partir de varios condrocitos utilizando condiciones de baja adherencia por gravedad y mini-biorreactores caseros

Aprende a diferenciar condrocitos a partir de células madre pluripotentes inducidas derivadas de sangre periférica humana mediante un protocolo libre de suero y xeno. Este método reproducible ofrece una estrategia rentable para la reparación cartilaginosa personalizada.

Diferenciación de los condrocitos de las células madre pluripotentes humanas inducidas por la sangre periféricas derivadas de la sangre (Video) | JoVE Journal

Diferenciación de los condrocitos de las células madre pluripotentes humanas inducidas por la sangre periféricas derivadas de la sangre

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