Diferenciación de los condrocitos de las células madre pluripotentes humanas inducidas por la sangre periféricas derivadas de la sangre

El objetivo general de este procedimiento es generar células de linaje condrogénico a partir de células madre pluripotentes inducidas derivadas de sangre periférica humana, o células IPS. Este método puede ayudar a responder las preguntas clave en el campo de la regeneración del cartílago sobre el uso de células de sangre periférica derivadas del paciente como células C para la generación de células IPS para la reparación del cartílago. Las principales ventajas de esta técnica son que es fácilmente reproducible y que la diferenciación de los condrocitos se produce en condiciones séricas y libres de xeno.

Comience por sembrar células IPS humanas en medio IPSC humano de cuatro mililitros en una placa de cultivo de tejidos de 60 milímetros que contenga una monocapa de células alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón irradiadas. Cultive las células a 37 grados centígrados en dióxido de carbono al cinco por ciento. Cuando las células madre son confluentes en un 80 a 90 por ciento, disocie las células con una solución diespacial para el subcultivo.

Después de dos o tres pasajes, use una aguja de vidrio estirada al fuego para diseccionar la colonia de IPSC indiferenciada confluente del 80 al 90 por ciento en fragmentos más pequeños, y transfiera no más de 100 piezas de cultivo celular a una nueva placa de Petri no adherente de 100 milímetros que contenga 10 mililitros de medio de formación de cuerpo embrioidal. La disociación mecánica es mejor que la digestión automática porque reduce el daño celular a pequeños fragmentos de células que se transfieren al nuevo contenedor de cultivo, y anuncia la eliminación manual de las células alimentadoras, que reprimen la diferenciación de las células IPS humanas. Regrese las células IPS humanas a la incubadora de cultivos celulares.

Después de dos días, incline el plato para dejar que los cuerpos embrioides se asienten y reemplace con cuidado tres mililitros del medio de formación del cuerpo embrioide con cuatro mililitros de medio de cultivo basal fresco. Después de 10 días, se habrán formado los cuerpos embrioides. Cubra un plato nuevo de 100 milímetros con cuatro mililitros de gelatina al 0,1 por ciento durante 30 minutos a 37 grados centígrados.

Transfiera los cuerpos embrioides con el sobrenadante a un tubo cónico de 15 mililitros y deje que los cuerpos se asienten durante cuatro o cinco minutos. Aspire todo menos los últimos 0,5 mililitros de medio y vuelva a suspender los cuerpos embrioides en 10 mililitros de medio de cultivo basal fresco. Cuando la gelatina se haya solidificado, deséchela.

A continuación, siembre las células en la placa recubierta de gelatina y coloque la placa en la incubadora de cultivos celulares. Después de 10 días en cultivo, los cuerpos embrioides se habrán diferenciado en excrecencias de células fibroblásticas. Para inducir la diferenciación de condrocitos, lavar el cultivo con DPBS y separar las células con tres mililitros de tripsina EDTA al 0,25 por ciento a 37 grados Celsius durante cinco minutos.

Cuando las células se hayan levantado del fondo de la placa, neutralice la reacción con cuatro mililitros de medio de cultivo basal fresco y titule suavemente el cultivo de cinco a 10 veces. Filtre la suspensión celular a través de un colador de malla de nailon de 70 micras y recoja las células por centrifugación. A continuación, siembre las células en una nueva placa de 100 milímetros recubierta de gelatina en 10 mililitros de medio de cultivo basal fresco.

Cuando el cultivo alcance una confluencia del 90 al 100 por ciento, coseche las células con tres mililitros de tripsina EDTA al 0,25 por ciento, como se acaba de demostrar para el conteo. Transfiera una alícuota de tres veces 10 a la quinta de celdas a un tubo de polipropileno de 15 mililitros para la centrifugación. Y resuspender el pellet en un mililitro de medio de diferenciación condrogénica.

Luego, centrifugue las células nuevamente y coloque el tubo en la incubadora de cultivo celular durante 21 días sin alterar el pellet. Las células condrogénicas pueden ensamblarse in vitro, produciendo métricas extracelulares características cuando se encuentran en condiciones de cultivo de alta densidad. Después de 21 días en cultivo, se habrá formado una pastilla condrogénica de células IPS humanas.

Después de 21 días de cultivo, las células condrogénicas humanas de IPSC son positivas para azul alcián y toluidina en tinción azul, lo que indica una diferenciación condrogénica exitosa del pellet de HIPSC. El análisis inmunohistoquímico del colágeno 2 y el colágeno 10 confirma aún más su fenotipo similar al de los condrocitos. El análisis de glicosaminoglicanos sulfatados revela que el contenido de glicosaminoglicanos sulfatados de las células está significativamente regulado al alza en los gránulos condrogénicos de IPSC humanos, en comparación con las células fibroblásticas humanas de IPSC, los cuerpos embrioides y las células IPS humanas indiferenciadas.

Además, las células condrogénicas IPSC humanas demuestran un alto nivel de expresión génica del linaje de condrogenocitos y marcadores de condrocitos completamente diferenciados, lo que sugiere el logro de una diferenciación condrogénica exitosa. Un método de cultivo de varios pasos utilizado para diferenciar las IPSC humanas en condrocitos, incluida la diferenciación espontánea a través de la formación de EB, el crecimiento celular a partir de EB, el cultivo celular monocapa tras el cultivo celular y el cultivo de gránulos en 3D. El fenotipo de los condrocitos se evalúa mediante análisis histológico, análisis bioquímico y expresión génica condrogénica.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar un método de cultivo de varios pasos para inducir la diferenciación de células IPS humanas en condrocitos. Esta técnica podría ser más específica para el paciente y más rentable.