Entrega sistémica de microARN mediante Virus Adeno-asociado recombinante serotipo 9 para tratar enfermedades neuromusculares en roedores
10 de agosto de 2018
Aquí describimos la entrega de microRNA usando un serotipo de virus adeno-asociado recombinante 9 en un modelo de ratón de una enfermedad neuromuscular. Una sola administración periférica en ratones dio lugar a la sobreexpresión de miRNA sostenida en el músculo y neuronas del motor, proporcionando una oportunidad de estudio miRNA función y potencial terapéutico en vivo.
El objetivo general de este método es seleccionar y administrar un microARN utilizando un vector de virus adenoasociado recombinante. A continuación, se administra al músculo esquelético y a las neuronas motoras de ratones, y se evalúa su eficacia en la mejora de los fenotipos de la enfermedad. Este método puede ayudar a responder la importante pregunta de si se puede emplear una estrategia de silenciamiento basada en microARN para tratar afecciones neuromusculares.
La principal ventaja de esta técnica es el uso del virus del serotipo 9 adenoasociado para administrar un microARN a través de la circulación sistémica a la médula espinal y el músculo esquelético de ratones, para silenciar directamente un gen de la enfermedad objetivo. Divida el stock de plásmidos AAV-microRNA en alícuotas de 100 a 200 microlitros que contengan una carga viral de diez a cien billones de genomas por mililitro. A continuación, cargue una alícuota en una jeringa y coloque una aguja de calibre 27 a 30.
Ahora, usando un protector de ratón estándar, asegure un ratón con la cola expuesta. Luego, limpie la cola con alcohol al 70% y coloque una almohadilla tibia debajo de la cola durante unos 30 segundos para aumentar la vasodilatación. Ahora, en la parte distal de la cola, inserte la aguja en la vena de la cola con el bisel hacia arriba y en un ángulo poco profundo, unos 15 grados.
Luego, inyecte el virus y espere unos segundos antes de retirar la aguja. Después de retirar la aguja, aplique una presión moderada con dos dedos para detener el sangrado. Luego, regrese al animal a su jaula de origen.
Durante la inyección de la vena de cola, no es raro ver un destello de sangre en el centro de la aguja. Al inyectar, no debe haber resistencia. Si la cola comienza a blanquearse e hincharse, retire la aguja y vuelva a intentarlo proximal a la ubicación de entrada anterior.
Para estas pruebas, los ratones deben tener más de cuatro semanas de edad y asegurarse de recopilar una medida de referencia antes del tratamiento. La sala de pruebas debe estar tranquila y oscura sin molestias. Lleve a los ratones a la habitación al menos 30 minutos antes de realizar cualquier prueba.
No moleste a los animales durante este período de aclimatación. Comience con la prueba del cable colgante. Levanta el ratón por la cola y colócalo en el centro de la rejilla de cables.
Luego, levante la cuadrícula de 15 a 20 pulgadas e invierta lentamente la pantalla para darle tiempo al mouse para ajustar su agarre. Una vez que la cuadrícula esté completamente invertida, inicie el temporizador y registre el tiempo de caída. Deje que el mouse se sostenga durante 60 segundos, si se cae antes, luego devuélvalo a la cuadrícula y repita el procedimiento.
Si el ratón se cuelga 60 segundos completos, registre 60 segundos para la puntuación y devuelva el ratón a su jaula. Permita que cada mouse tenga tres intentos de entrega de 60 segundos. De lo contrario, anote el tiempo de bloqueo más largo.
Después de la eutanasia del ratón, extraiga la médula espinal y luego extraiga el músculo esquelético del cuádriceps. Para congelar los pañuelos recolectados, llene hasta la mitad un recipiente de acero inoxidable con 2-metilbutano y sumerja el cuarto inferior del recipiente en nitrógeno líquido. Espere dos minutos antes de continuar.
Después de unos minutos, transfiera la muestra al 2-metilbutano. Cuando la muestra se vuelva blanca, transfiérala inmediatamente a un recipiente incrustado en hielo seco. Posteriormente, almacene la muestra a 80 grados centígrados.
Para el análisis bioquímico y la cuantificación de microARN, coloque el tejido recolectado en un criovial y congélelo en nitrógeno líquido. Luego, guárdelo a 80 grados centígrados. A los ratones SBMA se les inyectaron cien billones de genomas de AAV microR-298 a las cinco semanas de edad.
Los ratones SBMA portan el transgén del receptor de andrógenos humanos con un tracto de poliglutamina anormalmente expandido. A las diez semanas, normalmente desarrollan signos de enfermedad neuromuscular. La médula espinal lumbar y el músculo cuádriceps se extrajeron en varios momentos después del tratamiento para su análisis.
La RT-PCR cuantitativa mostró que la expresión de micro-R298 alcanzó su punto máximo en el músculo esquelético después de ocho semanas, y que la expresión alcanzó su punto máximo en la médula espinal a las 12 semanas. Diez semanas después de la inyección, se detectó GFP en ambos tejidos. Y la expresión de GFP colocalizada con el marcador de la neurona motora colina acetiltransferasa.
En un experimento de seguimiento, los ratones fueron inyectados aleatoriamente con el virus, o vehículo, a las siete semanas de edad y luego se pesaron y analizaron el comportamiento semanalmente, hasta las 40 semanas de edad. Diez semanas después de la inyección, los ratones tratados comenzaron a aumentar de peso y comenzaron a mostrar un mejor rendimiento motor. La PCR cuantitativa en tiempo real reveló que el tratamiento reduce los niveles de transcripción de AR en los tejidos afectados.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo administrar un microARN utilizando un vector de virus adenoasociado recombinante a través de la inyección de vano de cola. Y cómo realizar ensayos de comportamiento que pueden ayudar a evaluar la eficiencia del microARN administrado para mejorar la atrofia y la debilidad de las extremidades inferiores en ratones. La implicación de esta técnica se extiende hacia los enfoques de terapia génica, ya que una terapia génica segura y eficaz requiere una transferencia específica del transgén terapéutico a los tejidos específicos.
La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando nos dimos cuenta de que la enfermedad causada por mecanismos tóxicos de ganancia de función, como el SBMA, se beneficiaría de la sobreexpresión de microARN naturales dirigidos específicamente a la reparación de tres primos de la transcripción de la enfermedad.
Descripción general
Este artículo presenta un método para la administración de un microARN (miARN) mediante un vector de virus adenoasociado recombinante (rAAV) dirigido al músculo esquelético y a las neuronas motoras en un modelo murino de atrofia muscular espinal y bulbar (SBMA). El enfoque tiene como objetivo evaluar la eficacia del silenciamiento génico mediado por miARN en la mejora de los fenotipos de enfermedad neuromuscular, con implicaciones para la terapia génica en trastornos con efecto tóxico de ganancia de función.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Terapia génica
- Investigación de enfermedades neuromusculares
- Neurociencia molecular
Antecedentes
- La interferencia de ARN mediante vías endógenas de miARN regula la expresión génica postranscripcionalmente.
- La regulación génica mediada por miARN es una estrategia terapéutica prometedora para trastornos neurológicos causados por mutaciones con ganancia tóxica de función.
- La administración eficiente de miARN terapéuticos a los tejidos diana sigue siendo un desafío importante.
- La AMBS es una enfermedad neuromuscular causada por la expansión de poliglutamina en el gen del receptor de andrógenos (AR).
Objetivo del estudio
- Determinar si la sobreexpresión de un miARN recién identificado que dirige al AR (miR-298) puede mejorar los fenotipos de la enfermedad en ratones con AMBS.
- Evaluar la eficacia de la administración sistémica del miR-298 mediante vectores rAAV9.
- Evaluar el impacto del miR-298 sobre los niveles del AR mensajero y la función neuromuscular.
Métodos Utilizados
- Preparación de vectores rAAV9 que codifican miR-298, fraccionados para inyección.
- Administración sistémica mediante inyección en la vena de la cola en ratones con AMBS utilizando una aguja de calibre 27–30.
- Evaluación conductual mediante la prueba del alambre colgante para analizar la función motora.
- Obtención de tejidos (médula espinal y músculo cuádriceps) para análisis bioquímico y cuantificación de ARNmi mediante RT-PCR cuantitativa.
- Inmunofluorescencia para detectar la expresión de GFP y su co-localización con marcadores de neuronas motoras.
Resultados principales
- La inyección en la vena caudal de rAAV9-miR-298 provocó una sobreexpresión sostenida y ampliamente distribuida de miR-298 en el músculo esquelético y en las neuronas motoras.
- La expresión de miR-298 alcanzó su punto máximo en el músculo esquelético a las 8 semanas y en la médula espinal a las 12 semanas posteriores a la inyección.
- El reportero GFP confirmó la transducción exitosa y la co-localización con marcadores de neuronas motoras.
- Los ratones con AMBS tratados mostraron una mejora en la ganancia de peso y en el desempeño motor en comparación con los controles.
- La RT-PCR cuantitativa demostró niveles reducidos de ARNm de AR en los tejidos afectados tras el tratamiento.
Conclusiones
- La administración sistémica de miR-298 mediante rAAV9 es eficaz para dirigirse al músculo esquelético y a las neuronas motoras en ratones con AMBS.
- La sobreexpresión de miR-298 mejora los fenotipos neuromusculares y reduce los niveles del ARNm patogénico de AR.
- Este enfoque demuestra el potencial de las estrategias de silenciamiento génico basadas en miARN para tratar enfermedades neuromusculares causadas por mutaciones con efecto tóxico de ganancia de función.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La administración sistémica de miARN mediante vectores rAAV9 permite el silenciamiento génico dirigido en tejidos neuromusculares, abordando un desafío clave en la interferencia de ARN terapéutica para trastornos con efecto tóxico de ganancia de función. Este enfoque brinda confianza predictiva en la interacción con el blanco y en la medición de resultados funcionales, afectando directamente las decisiones en las etapas iniciales del descubrimiento y en las fases traslacionales. La capacidad del método para lograr una modulación sostenida y específica de tejidos en genes relacionados con la enfermedad lo posiciona como una plataforma reutilizable para la innovación en terapia génica dentro de carteras de enfermedades neuromusculares.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación directa de la función de genes relacionados con enfermedades mediante la silenciación mediada por ARNmi in vivo.
- Apoya la reducción de riesgos biológicos al demostrar la interacción con el blanco en tejidos relevantes.
- Facilita la confianza predictiva en la prueba de hipótesis terapéuticas para trastornos neuromusculares.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Prepara modelos animales validados para ensayos moleculares y conductuales posteriores.
- Normaliza la administración y cuantificación de agentes de silenciamiento génico entre cohortes.
- Permite la medición reproducible de la función motora y la reducción de transcritos como resultados cuantitativos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con modelos relevantes para la enfermedad en el desarrollo traslacional de biomarcadores.
- Proporciona continuidad desde el descubrimiento mecanicista hasta la evaluación preclínica de la eficacia.
- Apoya el avance ajustado al riesgo mediante la vinculación de puntos finales moleculares y funcionales.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método de administración sistémica de miARN une el descubrimiento inicial, la validación del blanco y la evaluación de la eficacia preclínica en modelos de enfermedades neuromusculares.
- Biología del Descubrimiento: Demuestra la comprobación de hipótesis in vivo y la aclaración de vías para objetivos con función tóxica adquirida.
- Selección: Establece la preparación y reproducibilidad del ensayo para puntos finales conductuales y moleculares.
- Análisis: Proporciona lecturas cuantitativas de RT-PCR y conductuales para la comparación entre condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta la eficacia del silenciamiento génico con la mejora funcional en sistemas relevantes para la enfermedad.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma escalable para evaluar candidatos adicionales de miARN u objetivos de enfermedad.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en las estrategias de terapia génica.
- Valor operativo: Proporciona una modulación génica estandarizada, escalable y reproducible in vivo.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de continuar o descartar proyectos y mejora la eficiencia del capital al vincular resultados moleculares y fenotípicos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos a terapia génica para indicaciones neuromusculares.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la preparación de vectores virales y en técnicas de administración in vivo.
- Necesita acceso a infraestructura para ensayos moleculares y conductuales cuantitativos.
- Exige estandarización entre equipos para los protocolos de inyección, recolección de tejidos y análisis.
- Puede ser necesaria una adaptación para diferentes secuencias de miARN o modelos de enfermedad.
- Las limitaciones prácticas incluyen la dosificación del vector, la especificidad tisular y el monitoreo de la expresión a largo plazo.
