Transferencia de la capacidad de formación de glándulas mamarias entre las células epiteliales basales mamarias y las células lumminales mamarias mediante vesículas extracelulares / exosomas

Los objetivos generales de este procedimiento son aislar las células madre transfiriendo vesículas y exosomas extracelulares de las células madre. Y evaluar la capacidad de transferencia de estas nanopartículas. El meso puede responder preguntas clave en el campo de las células madre sobre el clima, las células madre derivan en células trans o vesículas.

O el exosoma puede transferir la propiedad de las células madre a las células no madre. La principal ventaja de esta técnica es que las células madre inducidas derivan en vesículas de células trans. Y el exosoma se puede usar para reprogramar directamente células no madre en células madre.

La demostración del procedimiento estará a cargo del investigador postal LeMonsier, junto con el asistente quirúrgico Pei-Ling, Wen-Tin y Shih-Yin, todos de mi laboratorio. Comience sembrando un punto dos veces diez a la sexta células epiteliales mamarias no adherentes/mesenquimales, o NAMECs en 12 mililitros de medio por plato de 15 centímetros para un cultivo de cuatro días en una incubadora de cultivos celulares. En el cuarto día, coseche el medio de cultivo para la centrupción de la mesa.

A continuación, transfiera el sobrenadante a un tubo cónico para una segunda centrifugación de mesa. A continuación, transfiera el sobrenadante a una nueva ultracentrífuga y realice la ultracentrifugación durante 30 minutos. Al final del centrifugado, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de ultracentrífuga y vuelva a ultracentrífugar el sobrenadante.

Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el paladar del exosoma de la vesícula extracelular en PBS para una tercera ultracentrifugación. Luego, vuelva a suspender el paladar en PBS fresco y ultracentrífugo las partículas celulares por última vez. Retirar el sobrenadante y volver a suspender el paladar del exosoma de la vesícula extracelular en 100 microlitros de PBS.

A continuación, mida la concentración de proteínas de la suspensión de vesículas extracelulares mediante un ensayo de ácido bicinconínico. La concentración debe ser de aproximadamente 20 a 40 microgramos por cada 100 microlitros. Para medir la concentración y el tamaño de las vesículas y exosomas extracelulares, diluya las partículas celulares a dos microgramos de proteína por cada 100 mililitros de PBS.

Y analizar las partículas mediante análisis de seguimiento de nanopartículas. Para purificar los exosomas por gradiente de densidad, después de la tercera ultracentrifugación, resuspender el paladar en dos mililitros de 40 por ciento de yodixanol en PBS. Y superponga la suspensión de la celda con volúmenes secuenciales de dos mililitros de 30 por ciento, 20 por ciento, 10 por ciento y cinco por ciento de yodixanol.

Separe la fracción celular mediante ultracentrifugación en gradiente de densidad utilizando una pipeta para recolectar cada una de las diez capas de gradiente al final de la centrifugación. A continuación, analizar la presencia de marcadores de exosomas en cada fracción mediante SDS page y western blot según protocolos estándar. Uso de anticuerpos contra los marcadores de exosomas apropiados de interés.

Para tratar las células epiteliales mamarias con las vesículas extracelulares y los exosomas primero, siembre dos veces la tienda hasta el quinto flujo clasificado epcam hi-CD 49F células epiteliales mamarias de baja luminal por placa en placas de seis pocillos recubiertas de gelatina. A continuación, tratar cada cultivo celular con dos microgramos por mililitro de las vesículas y exsomas extracelulares derivados de NAMEC. Sustitución del medio de cultivo por vesículas y exosomas extracelulares frescos cada dos días durante diez días.

Al final del período de tratamiento, coloque una hembra de ratón 57 BL6 anestesiada de tres semanas de edad en posición supina y retire el pelaje de la parte media del abdomen. Desinfecte el sitio de la cirugía con tres ciclos alternos de alcohol al 70 por ciento y povodona yodada. Y hacer una incisión vertical de un punto de cinco centímetros a través de la piel, a lo largo de la región inguinal torásica ventral.

Exponga alternativamente las almohadillas de grasa del cuarto mamario derecho e izquierdo. Ubique el ganglio linfático en cada almohadilla de grasa y extraiga toda la glándula perancama debajo del ganglio linfático. A continuación, utilice una enzima natural con actividad prodialítica y cologenalítica para separar las células epiteliales mamarias luminales tratadas con vesículas extracelulares y exsomas.

Neutralizando la actividad enzimática, con un cinco por ciento de FBS en PBS después de diez minutos. Recoja las células por centrifugación y deseche el sobrenatente. Después de contar, diluya las células a una por diez por segunda a una por diez a la cuarta célula por 15 microlitros de concentración de PBS.

Y use una jeringa de vidrio de microlitros de 100 litros equipada con una aguja de calibre 27 para inyectar 15 microlitros de la suspensión de células epiteliales mamarias en cada almohadilla de grasa. Luego, cierre la piel con pinzas para heridas. Ocho semanas después de la inyección, haga una incisión vertical a través de la piel desde la región torásica hasta la región ingrinal y exponga las almohadillas de grasa mamaria del cuarto lado derecho e izquierdo.

Retire el cuarto glande mamario y extienda las almohadillas de grasa en portaobjetos de microscopio de vidrio individuales. Luego, transfiera los portaobjetos a una campana química y fije las almohadillas con fijadores de collies durante la noche a temperatura ambiente. A la mañana siguiente, lave las muestras en 250 mililitros de etanol al 70 por ciento durante 15 minutos.

Seguido de 250 mililitros de agua destilada durante cinco minutos. Después del lavado con agua destilada, tiña las almohadillas de grasa con alumbre carmín durante la noche a temperatura ambiente. Seguido de deshidratación en incubaciones ascendentes de etanol de 15 minutos.

Después de la última deshidratación, transfiera las muestras a zylene en una campana química hasta que las almohadillas de grasa se vuelvan transparentes. Luego, monte los portaobjetos con medio de montaje y use un escáner digital de portaobjetos para obtener imágenes de las almohadillas de grasa a 2.400 puntos por pulgada. El tamaño de las vesículas aisladas y el paladar de la ultracentrífuga suele ser de aproximadamente 100 nanómetros, medido por el análisis de seguimiento de nanopartículas.

Además, el análisis de microscopía electrónica de transmisión de fracciones ultracentrífugas de medio acondicionado NAMEC revela la presencia de abundantes vesículas de membrana. Después de la separación en gradiente de densidad, como se acaba de demostrar, los marcadores de exosomas se pueden detectar en la fracción yodoconal del 20 por ciento. El análisis emétrico del lado del flujo de células epiteliales mamarias luminales humanas comercializadas con CFSE etiquetadas como derivadas namicas, vesículas extracelulares y exsomas revela una señal de CFSE diez veces mayor en los cultivos tratados con exosomas.

Indica la absorción específica de vesículas extracelulares marcadas con CFSE y exosomas por parte de las células epiteliales mamarias. Además, mientras que las células epiteliales mamarias tratadas con PBS de control negativo no exhiben un único CFSE, también se puede observar evidencia de absorción de vesículas y exosomas extracelulares derivadas de namic por parte de las células tratadas con exosomas mediante microscopía confocal. En particular, las almohadillas de grasa de ratones inyectados con células epiteliales mamarias luminales epCAMhi/CD49Flo tratadas con vesículas extracelulares y exosomas derivados de NAMEC durante diez días adquirieron la capacidad de formar glándulas mamarias.

Tras su desarrollo, esta tecnología allanó el camino para nuestro investigador en el campo de la biología de las células madre. Explorar el uso de la célula trans derivada de células madre, vesículas y exosomas en medicina de regeneración y reprogramación celular directa.