Name: Transferencia de la capacidad de formación de glándulas mamarias entre las células epiteliales basales mamarias y las células lumminales mamarias mediante vesículas extracelulares / exosomas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Descubre cómo aislar vesículas extracelulares y exosomas de células epiteliales mamarias mesenquimales para transferir propiedades de células madre a células luminales. Este método permite reprogramar células no madre.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Investigación en Salud (05A1-CSPP16-014, HJL) y del Ministerio de Ciencia y Tecnología (MOST 103-2320-B-400-015-MY3, HJL).

Todas las investigaciones relacionadas con animales cumplieron con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado de Animales. 1. Aislamiento y validación de vesículas / exosomas extracelulares <ol><li> Cultivo de células basales epiteliales mamarias, NAMECs 4 , con medio libre de suero libre de 500 mL de MCDB 170, pH 7,4 + 500 mL de DMEM / F12 con bicarbonato sódico (0,2438%); EGF (5 ng / ml); Hidrocoritisona (0,5 mu g / ml); Insulina (5 mu g / ml); Extracto de pituitaria bovina (BPE; 35 μg / ml); Y GW627368X (1 μg / ml) en platos de 15 cm. </li><li> Después de contar las células con un hemocitómetro, sembrar 1,2 x 106 células en 12 ml de medio por plato de 15 cm al día 0 durante 4 días 4 . </li><li> Después de 4 días en cultivo, centrifugar el medio de cultivo a 300 xg durante 5 min utilizando una centrífuga de mesa. Transferir el sobrenadante a un tubo cónico ( Figura 1 ). </li><li> Centrifugar el sobrenadanteA 2.000 xg durante 20 min en una centrífuga de mesa. Transferir el sobrenadante a un tubo de ultracentrífuga y dejar las células muertas y los residuos celulares ( Figura 1 ]. </li><li> Centrifugar el sobrenadante a 10.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de ultracentrífuga ( Figura 1 ). </li><li> Centrifugar el sobrenadante a 110.000 xg durante 60 min a 4 ° C. Se retira el sobrenadante y se resuspende el sedimento EV / exosoma en PBS ( Figura 1 ). </li><li> Centrifugar el sobrenadante a 110.000 xg durante 60 min a 4 ° C. Retirar el sobrenadante. Resuspender el EV / exosoma pellet en PBS ( Figura 1 ]. Resuspender el gránulo aislado de 240-480 mL de medio acondicionado con NAMEC en 100 μl. </li><li> Medir la concentración de proteína de la suspensión EV con el ensayo de proteínas BCA. Asegúrese de que la concentración es de alrededor de 20-40 μg / 100 μl. Almacenar a -20 ° C paraanálisis mas extenso. </li><li> Medir la concentración y el tamaño de los EVs / exosomes por el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA), como se describe anteriormente por Gardiner et al. 11 . Diluir los EVs / exosomas (20 μg / 100 μl) con PBS hasta 10.000 veces para el análisis de NTA. NOTA: El resultado del análisis de NTA refleja el número y tamaño de las vesículas analizadas. </li><li> Imagen EVs / exosomes con transmisión microscopía electrónica (TEM), como se describe anteriormente por Lin et al [ 4] . </li></ol> 2. Purificación de los exosomas utilizando un gradiente de densidad <ol><li> Resuspender el gránulo de 110.000 g de la etapa 1.7 en yodixanol al 40% (p / v) en PBS (2 ml). Superponer la mezcla en secuencia con alícuotas de yodixanol al 30%, 20%, 10% y 5% (p / v) en PBS (2 ml cada uno) para formar un gradiente de densidad en un tubo de ultracentrífuga. </li><li> Centrifugar la mezcla a 200.000 xg durante 8 h a 4 ° C. </li><li> Recoja cada fracción de gradiente (10 fractiOns 1 ml / fracción) con una pipeta de la parte superior del tubo. </li><li> Analizar la presencia de marcadores de exosomas ( por ejemplo, CD81, CD9, CD63 y Tsg101) en cada fracción mediante SDS-PAGE 12 y Western blot. Cargar 50 μl de suspensiones de cada fracción en un gel al 10% que contenga SDS al 0,1% (p / v) y separar las proteínas en fracciones con electroforesis en gel. </li><li> Transferir las proteínas de un gel a una membrana de PVDF e incubar la membrana con anticuerpos contra los marcadores de exosomas ( por ejemplo, CD81, CD9, CD63 y Tsg101) y la proteína doméstica GAPDH durante la noche ( Tabla de Materiales ) a 4ºC. NOTA: El resultado identifica la fracción que contiene los exosomas. </li></ol> 3. Etiquetado de vesículas / exosomas extracelulares <ol><li> Suspender los EVs / exosomas, obtenidos en el paso 1.7, en 10 μM de éster de diacetato de succinimidilo de carboxifluoresceína (CFSE) a 20 μg de proteína exosomal / 100 μl. Preparar una muestra paralela coConservando sólo CFSE y PBS, procesados ​​de la misma manera, como un control negativo para los ensayos de absorción de EV / exosoma más tarde. Dejar las mezclas a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Suspender los EVs / exosomas en 50 x volumen de PBS y centrifugar la suspensión a 110.000 xg durante 60 min a 4 ° C. Se retira el sobrenadante y se resuspende el pellet EV / exosoma en PBS. Repita el paso 3.2 una vez. </li><li> Suspender los EVs / exosomas en PBS a una concentración de 20 μg de proteína exosomal / 100 μL y luego filtrar los EVs / exosomas a través de membranas de 0,22 μm antes de añadir los EVs / exosomas a las células. </li></ol> 4. Ensayo de Absorción de Vesículas / Exosomas Extracelulares <ol><li> Para preparar el medio de cultivo, mezclar 500 ml de MCDB 170, pH 7,4 + 500 ml de DMEM / F12 con bicarbonato sódico (0,2438%); EGF (5 ng / ml); Hidrocoritisona (0,5 mu g / ml); Insulina (5 mu g / ml); Y BPE (35 mu g / ml) 4 . Placa las células HMLE epitelial mamaria humana en placas de 6 pocillos (1 x 106 &lt;/ Sup&gt; células / pocillo) un día antes del tratamiento EV / exosoma. Se a~nadieron EVs / exosoma marcados con fluorescencia CFSE de 2 μg / mL, obtenidos en el paso 3.3, al medio de cultivo de las células HMLE durante 2-6 h. Tratar las células HMLE del grupo de control negativo con la preparación paralela, descrita en el paso 3.1. </li><li> Después de la incubación de 2 a 6 h, lavar las células dos veces con 4 ml de PBS a temperatura ambiente. </li><li> Se separan las células con tripsina al 0,25% durante 10 min y se vuelven a suspender las células en PBS que contiene 0,2% de FBS. Mida la absorción EV / exosoma de la intensidad de fluorescencia en las células utilizando un analizador de células de fluorescencia [ 4] . Imagen de las células tratadas con EVs / exosomes o el control negativo mediante microscopía confocal. NOTA: La fluorescencia verde en las células es causada por la absorción de EV / exosoma. Vea la leyenda de la Figura 6 para los ajustes del microscopio. </li></ol> 5. Aislamiento de células epiteliales mamarias de ratón primario <ol><lI&gt; Preparar platos recubiertos con gelatina añadiendo 12 ml de solución de gelatina al 0,1% a platos de 10 cm. Colocar las placas en una incubadora a 37 ° C durante 30 min. Quitar la solución de gelatina y dejar las tapas de los platos en una campana de flujo laminar durante 4 h hasta que el recubrimiento de gelatina se ha secado. </li><li> Diseccionar las glándulas mamarias número 2, 3, 4 y 5 ( Figura 2 ) de ratones C57BL / 6 hembra virgen de 12 semanas usando tijeras y cortar las glándulas en pedazos pequeños (2 mm 2 ) usando una maquinilla de afeitar. </li><li> Disociar aún más la suspensión de glándulas mamarias (de 10 ratones) durante 60 minutos a 37ºC, agitación de 120 rpm con 50 ml de DMEM / F12 que contiene 0,2% de colagenasa tipo IV, tripsina al 0,2%, FBS al 5%, gentamicina 5 μg / ml , Y 1x pen-strep. </li><li> Recoger los organoides epiteliales de la mezcla por centrifugación a 350 xg durante 10 min. </li><li> Suspender los organoides epiteliales en 4 mL de DMEM / F12 con 0,1 mg / ml de DNasa I durante 5 min a temperatura ambiente. Añadir 6 ml de DMEM / F12 a una solución finalVolumen de 10 ml. </li><li> Centrifugar la suspensión a 400 xg durante 10 min a temperatura ambiente y descartar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el sedimento en 10 ml de DMEM / F12. Centrifugar la suspensión pero golpear el freno cuando la velocidad alcanza 400 x g. Deseche el sobrenadante. NOTA: Al golpear el freno, los organoides epiteliales se precipitan rápidamente, mientras que los fibroblastos, como células individuales, permanecen en el sobrenadante. </li><li> Repita los pasos 5.6 y 5.7 5-7 veces. Añadir una gota de la suspensión a un hemocitómetro y luego comprobar el aclaramiento de fibroblastos de la mezcla de organoides bajo microscopía después de cada ronda de centrifugación ( Figura 3 ]. </li><li> Se cubren los organoides en el plato recubierto con gelatina, obtenidos en el paso 5.1, durante 48 h con DMEM / F12 que contiene 1x ITS, 5% de FBS, 50 μg / ml de gentamicina, 10 ng / ml de EGF y 1x pen-strep. </li><li> Después de 48 h, eliminar las células flotantes en el cultivo mediante la sustitución del medio con medio de cultivo fresco sin FBS (DMEM / F12 que contiene 1x ITS, 50 μg / ml de gentamicina, 10 ng / ml de EGF y 1x pen-strep). </li><li> Confirme que una monocapa de células epiteliales mamarias migra y crece a partir de los organoides epiteliales unidos en 3 días. </li></ol> 6. Separación de las células epiteliales mamarias basales / lumínicas del ratón primario <ol><li> Después del cultivo de 3 días, separar las células mamarias primarias de ratón con una mezcla enzimática natural con actividad enzimática proteolítica y colagenolítica durante 20 minutos. Neutralizar la actividad enzimática con FBS al 5% en PBS. </li><li> Centrifugar la suspensión a 450 xg durante 10 min a temperatura ambiente y descartar el sobrenadante. Resuspender el sedimento celular en 5 mg / ml dispase durante 20 min. Neutralizar la actividad enzimática con FBS al 5% en PBS. </li><li> Centrifugar la suspensión a 450 xg durante 10 min a temperatura ambiente y descartar el sobrenadante. </li><li> Se volvieron a suspender las células en 100 μl de PBS con FBS al 0,2% a una concentración de 10 7 células / ml con el diluidoAnti-CD49f y anticuerpos anti-EpCAM en hielo durante 1 h en la oscuridad. </li><li> Lavar las células con PBS y luego incubar las células con anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo en hielo durante 30 minutos en la oscuridad. </li><li> Lavar y volver a suspender las células en PBS con 0,2% de FBS. </li><li> Clasificar el EpCAM hi / CD49f lo células epiteliales mamarias luminal en un clasificador de células [ 4] . </li></ol> 7. Tratamiento extracelular de vesículas / exosomas <ol><li> Seed las células epiteliales mamarias lumonales EpCAM hi / CD49f seleccionadas de la etapa 6,7 ​​en placas de 6 pocillos recubiertas con gelatina (2 x 10 ^ { 5 } células / pocillo) y luego se tratan con PBS o EVs / exosomas derivados de NAMEC de 2 μg / mL Obtenido en el paso 1.7. </li><li> Para asegurar la eficacia biológica de los VE / exosomas en el tratamiento de cultivo a largo plazo, reemplazar el medio de cultivo celular con medio fresco que contenga PBS o 2 μg / mL de EVs / exosomas derivados de NAMEC cada dos días. No divida el mouse primaDurante el tratamiento de 10 días. </li></ol> 8. Inyección de grasa de células epiteliales mamarias <ol><li> Anestesiar a una mujer de 3 semanas de edad C57BL / 6 ratones con isofluorano 2-3% inhalante. </li><li> Coloque el ratón anestesiado en la espalda. Retire la piel del abdomen medio con una crema de afeitar / cabello y limpie el sitio de la cirugía con tres ciclos alternos de alcohol al 70% y yoduro de povidona. </li><li> Hacer una incisión vertical de 1,5 cm a través de la piel a lo largo de la región ventral torácico-inguinal con tijeras y, alternativamente, exponer las almohadillas de grasa mamaria derecha e izquierda 4. </li><li> Limpie cada almohadilla de grasa quitando el parénquima de las glándulas con unas tijeras. Localice el ganglio linfático en la almohadilla de grasa y luego retire el parénquima de la glándula entera debajo del ganglio linfático. NOTA: Dos tercios de la almohadilla de grasa deben permanecer en su lugar. </li><li> Se separan las células obtenidas de la etapa 7.2 con una mezcla enzimática natural (véase la Tabla de Materiales ) con proteolítica aY la actividad enzimática colagenolítica durante 10 min. Neutralizar la actividad enzimática con FBS al 5% en PBS. </li><li> Centrifugar la suspensión a 450 xg durante 10 min a temperatura ambiente y descartar el sobrenadante. Contar las células con un hemocitómetro y suspender las células en PBS a una concentración tal que 15 μL contengan la dosis celular deseada (10 4 -10 2 células / almohadilla). </li><li> Inyectar 15 μL de suspensión de células epiteliales mamarias en una almohadilla grasa usando una jeringa de vidrio de 100 μL unida a una aguja 27G. </li><li> Repita los pasos 8.4-8.7 para la almohadilla de grasa en el otro lado. </li><li> Cierre la piel con clips de herida. </li></ol> 9. Suelo entero de la glándula mamaria <ol><li> Eutanasia el ratón con CO 2 más dislocación cervical a las 8 semanas después de la inyección celular (Paso 8.7). </li><li> Hacer una incisión vertical a través de la capa de la piel de la región torácica a la región inguinal con tijeras y luego exponer tanto la derecha y la izquierda 4 thAlmohadillas de grasa amiga. Retire las glándulas mamarias cuarto ( Figura 2 ). </li><li> Se separan las almohadillas de grasa en portaobjetos de microscopio de vidrio y se fijan las almohadillas de grasa con fijador de Kahle (formaldehído al 4%, EtOH al 30% y ácido acético glacial al 2%) a temperatura ambiente durante la noche. Precaución: El fijador de Kahle es irritante. Realice este paso en un capó químico. </li><li> Lave las almohadillas de grasa en 250 ml de EtOH al 70% durante 15 minutos y luego en 250 ml de dH $ ₂ $ O durante 5 min. Mancha las almohadillas de grasa con alumbre de carmín (1 g de carmín y 2,5 g de sulfato de aluminio y potasio en 500 ml de dH $ ₂ $ O) a temperatura ambiente durante la noche. </li><li> Lavar las almohadillas de grasa con 250 ml de EtOH al 70% durante 15 min, 250 ml de EtOH al 95% durante 15 min y 250 ml de EtOH al 100% durante 15 min. </li><li> Limpie las almohadillas de grasa en xileno durante días y detenga la incubación de xileno cuando las almohadillas de grasa se vuelven transparentes. Precaución: El xileno es irritante. Realice este paso en un capó químico. </li><li> Monte las diapositivas conTh y tomar imágenes (2.400 dpi) de las almohadillas de grasa utilizando un escáner digital de diapositivas. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los exosomas a menudo llevan características de las células que las liberaron, y la cantidad de exosomas liberados puede ser inducida por los estímulos [ 4] . El medio de cultivo de células puede ser recogido y sometido a ultracentrifugación diferencial para EV / exosome colección ( Figura 1 ]. Actualmente no existe un acuerdo general sobre un método ideal para aislar EVs / exosomas. El método óptimo utilizado aquí ha sido determinado por la aplicación descendente <s...

Los exosomas pueden mediar en la comunicación celular mediante la transferencia de membrana y proteínas citosólicas, lípidos y ARN entre las células 1 . Se ha demostrado que la comunicación mediada por exosomas está implicada en muchos procesos fisiológicos y patológicos ( es decir, presentación de antígenos, desarrollo de tolerancia 2 y progresión tumoral 3 ). Los exosomas a menudo tienen contenidos similares a los de las células de origen que los liberan. Por lo tanto, los exosomas pueden llevar a las propiedades celulares específicas de las células de origen y la transferencia de estas propiedades a las células de ingerirlos [ 4] . Los exosomas son vesículas de membrana de doble capa de 50 a 150 nm y presentan marcadores específicos ( por ejemplo, CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix y TSG101). Por lo tanto, los exosomas deben caracterizarse por diversos métodos para diferentes aspectos. La microscopía electrónica de transmisión puede usarse para visualizar vesículas de membranaTales como los exosomas 4 , 5 . El análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) y el análisis dinámico de dispersión de luz (DLS) se utilizan para medir el tamaño y el número de exosomas purificados 4 . El contenido de membrana lipídica de los exosomas puede ser verificado por gradiente de densidad. Los marcadores exosomales, tales como CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix y TSG101 6 , 7 , pueden medirse mediante transferencia Western. Las células basales mamarias tienen la capacidad de generar glándulas mamarias cuando se implantan en almohadillas de grasa, mientras que las células luminales no pueden 8 , 9 , 10 . Por lo tanto, las células basales mamarias también se denominan unidades de repoblación mamaria. Mediante el uso del modelo de células basales y lumínicas mamarias, se puede examinar la capacidad de EVs / exosomas para transferir características de células entre diferentes poblaciones celulares. Este trabajoDemuestra el método de transferencia de la capacidad de formación de glándulas de las células epiteliales basales mamarias a las células epiteliales lumínicas mamarias utilizando EVs / exosomas derivados de células epiteliales basales mamarias. Luminal células epiteliales mamarias adquirieron las propiedades basales de las células después de la ingestión de EVs / exosomas secretados a partir de células basales y, a continuación, pueden formar glándulas mamarias [ 4] .

<table><tbody><tr><td>MCDB 170&nbsp;</td><td>USBiológico</td><td>M2162</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td></td><td></td> Ultracentrífuga Thermo 1250062 <td></td></tr><tr><td>Optima L-100K</td><td>Rotor Beckman</td><td>393253</td><td></td></tr><tr><td>SW28 Ti Rotor</td><td>Beckman</td><td>342204</td><td></td></tr><tr><td>SW41 Rotor</td><td>Beckman</td><td>331306</td><td></td></tr><tr><td>NANOSIGHT LM10</td><td>Malvern</td><td>NANOSIGHT LM10</td><td>para análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA)</td></tr><tr><td>Optiprep&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td>Solución al 60% (p/v) de iodixanol en agua (estéril).</td></tr><tr><td>Anticuerpo CD81</td><td>GeneTex</td><td>GTX101766</td><td>1:1.000 en 5% p/v de leche en polvo descremada, 1x TBS, 0,1% Tween 20 a 4 & deg; C, durante la noche&nbsp;</td></tr><tr><td>Anticuerpo CD9</td><td>GeneTex</td><td>GTX100912</td><td>1:1.000 en leche en polvo descremada al 5% p/v, 1x TBS, 0,1% Tween 20 a 4 & deg; C, durante la noche&nbsp;</td></tr><tr><td>Anticuerpo CD63</td><td>Abcam</td><td>Ab59479</td><td>1:1.000 en 5% p/v de leche en polvo descremada, 1x TBS, 0,1% Tween 20 a 4 &deg; C, durante la noche&nbsp;</td></tr><tr><td>Anticuerpo TSG101</td><td>GeneTex</td><td>GTX118736</td><td>1:1.000 en leche en polvo descremada al 5% p/v, 1x TBS, 0,1% Tween 20 a 4 & deg; C, durante la noche&nbsp;</td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>GeneTex</td><td>GTX100118</td><td>1:6,000 en 5% p/v de leche en polvo descremada, 1x TBS, 0.1% Tween 20 a 4 & deg; C, durante la noche&nbsp;</td></tr><tr><td>CFSE (carboxifluoresceína succinimidil diacetato éster)</td><td>Thermo</td><td>V12883</td><td></td></tr><tr><td>FACSCalibur</td><td>BD Biosciences</td><td>analizador de</td><td></td> células de fluorescencia</tr><tr><td>colagenasa Tipo IV&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>tripsina</td><td>Thermo 27250018</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; ITS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3146</td><td>una mezcla de insulina humana recombinante, transferrina humana y selenito de sodio</td></tr><tr><td>accutasa</td><td>ebioscience</td><td>00-4555-56</td><td>una mezcla de enzimas naturales con actividad enzimática proteolítica y colagenolítica</td></tr><tr><td>dispasa&nbsp;</td><td>STEMCELL</td><td>7913</td><td>5 mg/mL = 5 U/mL</td></tr><tr><td>anticuerpo anti-CD49f</td><td>Biolegend</td><td>313611</td><td>1:50</td></tr><tr><td>anticuerpo anti-EpCAM</td><td>Biolegend</td><td>118213</td><td>1:200</td></tr><tr><td>FACSAria</td><td>BD Biosciences clasificador</td><td>de</td>células alumbre carmín Sigma-Aldrich C1022 células epiteliales mamarias humanas <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> (células HMLE, NAMECs)<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>regalos del Dr. Robert Weinberg</td></tr><tr><td>permount</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>bicarbonato de sodio</td><td>Zymeset&nbsp;</td><td>BSB101</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-015</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocoritisona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-H0888</td><td></td></tr><tr><td>Insulina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-I9278</td><td></td></tr><tr><td>BPE (extracto de hipófisis bovina)</td><td>Hammod Cell Tech&nbsp;</td><td>1078-NZ</td><td></td></tr><tr><td>GW627368X&nbsp;</td><td>Plato de</td> cultivo <td>Cayman 10009162</td><td></td></tr><tr><td>15 cm</td><td>Falcon&nbsp;</td><td></td><td></td>353025</tr><tr><td>centrífuga de sobremesa</td><td>Eppendrof&nbsp;</td><td>Centrífuga 3415R</td><td></td></tr><tr><td>tubo ultracentrífugo</td><td>Beckman 344058</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS (solución salina tamponada con fosfato)&nbsp;</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>BCA Ensayo de proteínas</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>23228</td><td></td></tr><tr><td>Microscopía electrónica de transmisión</td><td>Hitachi</td><td>HT7700</td><td></td></tr><tr><td>gelatina&nbsp;</td><td>STEMCELL</td><td>7903</td><td></td></tr><tr><td>plato de cultivo de 10 cm</td><td>Falcon&nbsp;</td><td></td><td></td>353003</tr><tr><td>placa de cultivo de 6 pocillos</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>hembra C57BL/6 ratones</td><td>NLAC (Centro</td><td></td><td></td>Nacional</tr><tr><td>de Animales de Laboratorio FBS (Suero Fetal Bovino)</td><td>BioWest&nbsp;</td><td>S01520</td><td></td></tr><tr><td>gentamicina</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>15710072</tr><tr><td>Pen/Estreptococo</td><td>Corning</td><td>30-002-CL</td><td></td></tr><tr><td>DNasa I</td><td>5PRIMER</td><td>2500120</td><td></td></tr><tr><td>isofluorano&nbsp;</td><td>Halocarbono</td><td>NPC12164-002-25</td><td></td></tr><tr><td>formaldehído</td><td>MACRON</td><td>H121-08</td><td></td></tr><tr><td>EtOH (etanol)</td><td>J.T. Baker</td><td>800605</td><td></td></tr><tr><td>ácido acético glacial</td><td>Panreac</td><td>131008.1611</td><td></td></tr><tr><td>sulfato de aluminio y potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12625</td><td></td></tr><tr><td>Xileno&nbsp;</td><td>Leica</td><td>3803665</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu; membranas m</td><td>Merck Millipore</td><td>Millex-GP</td><td></td></tr><tr><td>AUTOCLIP Pinzas para heridas, 9 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>427631</td><td></td></tr><tr><td>AUTOCLIP Aplicador de pinzas para heridas</td><td>BD Biosciences</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>CellMask&trade; Rojo</td><td>Intenso Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Tinción de membrana plasmática</td> <td>C10046</td></tr></tbody></table>

transferencia de la capacidad de formación de glándulas mamarias entre las células epiteliales basales mamarias y las células lumminales mamarias mediante vesículas extracelulares / exosomas

Transfer of Mammary Gland-forming Ability Between Mammary Basal Epithelial Cells and Mammary Luminal Cells via Extracellular Vesicles/Exosomes

Las células pueden comunicarse a través de exosomas, ~ 100-nm vesículas extracelulares (VE) que contienen proteínas, lípidos y ácidos nucleicos. Las vesículas extracelulares derivadas de células epiteliales mamarias no adherentes / mesenquimales (NAMEC) pueden aislarse a partir del medio NAMEC mediante ultracentrifugación diferencial. Basándose en su densidad, los VE pueden purificarse mediante ultracentrifugación a 110.000 x g. La preparación EV de la ultracentrifugación puede separarse adicionalmente usando un gradiente de densidad continuo para evitar la contaminación con proteínas solubles. Los EV purificados pueden entonces ser evaluados adicionalmente usando un análisis de seguimiento de nanopartículas, que mide el tamaño y el número de vesículas en la preparación. Las vesículas extracelulares con un tamaño comprendido entre 50 y 150 nm son exosomas. Los EVs / exosomas derivados de NAMEC pueden ser ingeridos por células epiteliales mamarias, que pueden medirse mediante citometría de flujo y microscopía confocal. Algunas propiedades de las células madre mamarias ( por ejemplo, la capacidad de formación de glándulas mamarias) puedenSe transfiere desde el tallo-como NAMECs a las células epiteliales mamarias a través de la NAMEC derivados EVs / exosomes. Las células epiteliales mamarias primarias aisladas EpCAM hi / CD49f no pueden formar glándulas mamarias después de ser trasplantadas en almohadillas de grasa de ratón, mientras que las células epiteliales mamarias basales EpCAM lo / CD49f hi forman glándulas mamarias después del trasplante. La captación de EVs / exosomas derivados de NAMEC por EpCAM hi / CD49f para células epiteliales mamarias luminales les permite generar glándulas mamarias después de ser trasplantadas en almohadillas de grasa. Los EVs / exosomas derivados de las células epiteliales mamarias de tipo madre transmiten la capacidad de formación de glándulas mamarias a EpCAM hi / CD49f para las células epiteliales mamarias luminales.

Debido a que se ha demostrado que el bloqueo de la señalización PGE2 / EP4 desencadena la liberación de EV / exosoma a partir de células madre mamarias basales 4 , este trabajo presenta un método para aislar los EVs / exosomas inducidos del cultivo de células basales epiteliales mamarias (NAMEC). Dado que NAMECs se cultivan en suero libre de medio, no hay pre-existentes EVs / exosomas derivados de suero [ 13] . Para las células cultivadas e...

Este protocolo describe métodos para purificar, cuantificar y caracterizar vesículas extracelulares (EVs) / exosomas de células epiteliales mamarias no adherentes / mesenquimales y para usarlas para transferir la capacidad de formación de glándulas mamarias a células epiteliales mamarias luminales. Los EVs / exosomas derivados de células epiteliales mamarias de tipo tallo pueden transferir esta propiedad celular a células que ingieren los EVs / exosomas.

Transferencia de la capacidad de formación de glándulas mamarias entre las células epiteliales basales mamarias y las células lumminales mamarias mediante vesículas extracelulares / exosomas

Cells can communicate via exosomes, ~100-nm extracellular vesicles (EVs) that contain proteins, lipids, and nucleic acids. Non-adherent/mesenchymal ...

Los objetivos generales de este procedimiento son aislar vesículas extracelulares y exosomas que transfieren características de células madre a partir de células madre, y evaluar la capacidad de transferencia de tales características por parte de estas nanopartículas. El método puede responder preguntas clave en el campo de las células madre sobre si las células madre derivan o transfieren características mediante células trans o vesículas.O bien, el exosoma puede transferir la propiedad de célula madre a una célula que no es célula madre. La principal ventaja de esta técnica es que la célula madre inducida se deriva de la vesícula transcelular. Y el exosoma puede utilizarse para reprogramar directamente una célula no madre en una célula madre.El procedimiento será demostrado por el investigador postal LeMonsier, con la asistencia quirúrgica de Pei-Ling, Wen-Tin y Shih-Yin, todos ellos de mi laboratorio. Comience sembrando uno punto dos por diez a la sexta células epiteliales mamarias no adherentes/mesenquimales, o NAMECs, en 12 mililitros de medio por placa de 15 centímetros, para un cultivo de cuatro días en una incubadora de cultivo celular. En el día cuatro, recolecte el medio de cultivo para centrifugación en mesa.Luego, transfiera el sobrenadante a un tubo cónico para una segunda centrifugación en mesa. A continuación, transfiera el sobrenadante a un nuevo ultracentrífugo y realice una ultracentrifugación durante 30 minutos. Al final de la centrifugación, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de ultracentrífuga y ultracentrifugue el sobrenadante nuevamente.Elimine el sobrenadante y re-suspenda la paleta de exosomas de vesículas extracelulares en PBS para una tercera ultracentrifugación. Luego, re-suspenda la paleta en PBS fresco y ultracentrifugue las partículas celulares una última vez. Elimine el sobrenadante y re-suspenda la paleta de exosomas de vesículas extracelulares en 100 microlitros de PBS.Luego, mida la concentración de proteína de la suspensión de vesículas extracelulares mediante el ensayo del ácido bicinconínico. La concentración debe ser aproximadamente de 20 a 40 microgramos por 100 microlitros. Para medir la concentración y el tamaño de las vesículas extracelulares y los exosomas, diluya las partículas celulares a dos microgramos de proteína por 100 mililitros de PBS.Y analice las partículas mediante análisis de seguimiento de nanopartículas. Para purificar los exosomas mediante gradiente de densidad, después de la tercera ultracentrifugación, reconstituya el precipitado en dos mililitros de yodixanol al 40 % en PBS. Y superponga a la suspensión celular volúmenes secuenciales de dos mililitros de yodixanol al 30 %, 20 %, 10 % y 5 %.Separar la fracción celular mediante ultracentrifugación en gradiente de densidad utilizando una pipeta para recolectar cada una de las diez capas del gradiente al final de la centrifugación. Luego, analizar la presencia de marcadores de exosomas en cada fracción mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS y transferencia a membrana (western blot) según protocolos estándar, utilizando anticuerpos frente a los marcadores de exosomas de interés apropiados.Para tratar las células epiteliales mamarias con vesículas extracelulares y exosomas, primero siembre dos veces diez a la quinta células epiteliales mamarias luminas Epcam hi-CD49f low ordenadas por flujo por placa en placas de seis pocillos recubiertas con gelatina. Luego, trate cada cultivo celular con dos microgramos por mililitro de las vesículas extracelulares y exosomas derivados de NAMEC. Reemplace el medio de cultivo con vesículas extracelulares y exosomas frescos cada dos días durante diez días.Al final del período de tratamiento, coloque un ratón hembra de 57 BL6 de tres semanas de edad anestesiado en posición supina y retire el vello del abdomen medio. Desinfecte el sitio quirúrgico con tres ciclos alternos de alcohol al 70 por ciento y yodo de povidona. Y realice una incisión vertical de un punto cinco centímetros a través de la piel, a lo largo de la región torácica ventral inguinal.Exponga alternativamente las almohadillas de grasa mamaria cuartas derecha e izquierda. Localice el ganglio linfático en cada almohadilla grasa y retire toda la glándula perancama por debajo del ganglio linfático. A continuación, utilice una enzima natural con actividad prodialítica y cologenalítica para desprender las células epiteliales mamarias luminadas tratadas con vesículas extracelulares y exosomas.Neutralice la actividad enzimática con FBS al cinco por ciento en PBS después de diez minutos. Recolecte las células por centrifugación y deseche el sobrenadante. Después de contarlas, diluya las células a una concentración de uno por diez a la segunda hasta uno por diez a la cuarta células por 15 microlitros de PBS.Y utilice una jeringa de vidrio de 100 microlitros equipada con una aguja de calibre 27 para inyectar 15 microlitros de la suspensión de células epiteliales mamarias en cada cojín adiposo. A continuación, cierre la piel con clips quirúrgicos. Ocho semanas después de la inyección, realice una incisión vertical a través de la piel desde la región torácica hasta la región inguinal y exponga ambos cojines adiposos mamarios cuartos derecho e izquierdo.Retire el cuarto glándula mamaria y extienda las almohadillas grasas sobre portaobjetos de vidrio individuales. A continuación, transfiera los portaobjetos a una campana química y fije las almohadillas con fijadores collies durante toda la noche a temperatura ambiente. A la mañana siguiente, lave las muestras en 250 mililitros de etanol al 70 por ciento durante 15 minutos.Seguido de 250 mililitros de agua destilada durante cinco minutos. Después del lavado con agua destilada, tiña los depósitos de grasa con alumbre de carmín durante la noche a temperatura ambiente. A continuación, deshidrate mediante incubaciones ascendentes de etanol de 15 minutos.Después de la última deshidratación, transfiera las muestras a xileno en una campana química hasta que las almohadillas grasas se vuelvan transparentes. Luego, monte los portaobjetos con medio de montaje y utilice un escáner digital de portaobjetos para obtener imágenes de las almohadillas grasas a 2.400 puntos por pulgada. El tamaño de las vesículas aisladas y el paladar del ultracentrífugo suelen ser aproximadamente de 100 nanómetros, según se mide mediante análisis de seguimiento de nanopartículas.Además, el análisis por microscopía electrónica de transmisión de fracciones de ultracentrífuga del medio condicionado de NAMEC revela la presencia de abundantes vesículas de membrana. Tras la separación mediante gradiente de densidad, como se acaba de demostrar, los marcadores de exosomas pueden detectarse en la fracción de iodixanol al 20 por ciento. El análisis citométrico de flujo de células epiteliales mamarias luminosas humanas tratadas con vesículas extracelulares y exosomas derivados de namic marcados con CFSE revela una señal de CFSE diez veces mayor en los cultivos tratados con exosomas.Indicación de la captación específica de vesículas extracelulares y exosomas marcados con CFSE por parte de las células epiteliales mamarias. Además, mientras que el control negativo, las células epiteliales mamarias tratadas con PBS, no exhiben una señal de CFSE, la evidencia de la captación de vesículas extracelulares y exosomas derivados de namic por las células tratadas con exosomas también puede observarse mediante microscopía confocal. Notablemente, los cojinetes grasos de ratones inyectados con células epiteliales mamarias luminadas epCAMhi/CD49Flo clasificadas por citometría de flujo y tratadas con vesículas extracelulares y exosomas derivados de NAMEC durante diez días adquirieron la capacidad de formar glándulas mamarias.Tras su desarrollo, esta tecnología allanó el camino para que nuestro investigador avanzara en el campo de la biología de las células madre. Para explorar el uso de las células trans derivadas de células madre, así como de sus vesículas y exosomas, en la medicina regenerativa y la reprogramación directa de células.

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Research

Investigación

JoVE Journal

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Transferencia de la capacidad de formación de glándulas mamarias entre las células epiteliales basales mamarias y las células lumminales mamarias mediante vesículas extracelulares / exosomas (Video) | JoVE Journal

Transferencia de la capacidad de formación de glándulas mamarias entre las células epiteliales basales mamarias y las células lumminales mamarias mediante vesículas extracelulares / exosomas

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