La perfusión como un método para la visualización vascular Ambystoma mexicanum

El objetivo general de este procedimiento es visualizar la vasculatura del ajolote. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la medicina regenerativa sobre las complejidades de la revascularización de los tejidos en regeneración en el ajolote. La principal ventaja de esta técnica de visualización vascular es que todos los vasos sanguíneos del animal se pueden visualizar fácilmente en un microscopio fluorescente estándar.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la regeneración de las extremidades de los ajolotes, también se puede aplicar a otros tejidos, como la cola, el corazón, los ojos, las branquias u otros órganos. Antes de abrir el tórax del ajolote, primero confirme el nivel adecuado de sedación mediante un pellizco en los dedos de los pies. Luego, use pinzas quirúrgicas para pellizcar la piel a lo largo del eje central del pecho, justo debajo de la línea de los hombros.

Con un bisturí, haga una incisión donde se tira de la piel hacia arriba y retire un parche cuadrado de piel sobre el pecho para revelar dos placas de cartílago. A continuación, abra una ventana sobre la cavidad torácica y desgarre con cuidado el tejido conectivo sin cortar ningún vaso sanguíneo importante. Use pinzas para levantar cada placa de cartílago individualmente, extirpando cada placa con tijeras quirúrgicas.

Pellizque cuidadosamente el pericardio expuesto con las pinzas. Tirar del tejido hacia arriba y perforarlo con las tijeras quirúrgicas, lo suficientemente profundo como para extirpar el pericardio sin lesionar el corazón. Luego, extirpe suavemente el pericardio para exponer el corazón y la aorta, para ver claramente el corazón a aproximadamente cinco milímetros de la aorta, ramificándose fuera del corazón.

Para perfundir el ajolote, coloque un soporte de abrazadera con una aguja de mariposa cargada junto a un marco de espuma de poliestireno, de modo que el brazo de la pinza se manipule fácilmente para la inserción de la aguja. Encienda una bomba peristáltica para enjuagar 0.7x PBS a través del tubo de la bomba y apunte la punta de la aguja hacia el aspecto rostral. Deslice las pinzas por debajo del arco aórtico y tire ligeramente hacia arriba.

Luego, maniobre la combinación de pinza de aguja, de modo que la aguja corra a lo largo de la aorta hacia la cabeza del animal, e inserte la aguja unos cinco milímetros en la aorta, manteniendo las pinzas detrás de la aorta como soporte. Una inserción exitosa puede confirmarse mediante un agrandamiento visible de las aurículas cardíacas. Laerar rápidamente una aurícula y permitir que la sangre drene.

Luego, perfunde el ajolote con unos 20 a 30 mililitros de PBS. Después de una perfusión exitosa, el animal debe cambiar de color rosa claro a blanco. Cuando se haya perfundido todo el PBS, detenga la bomba peristáltica y mueva el extremo libre del tubo a un tubo de 15 mililitros de solución de Dil.

Vuelva a poner en marcha la bomba, teniendo cuidado de evitar la creación de burbujas en el tubo y perfundir el animal con todo el material de Dil en funcionamiento. En una perfusión exitosa, el ajolote cambiará a un color rosa brillante que será más notable en las branquias. Cuando se haya perfundido todo el Dil, detenga la bomba y coloque el extremo libre del tubo en una solución de paraformaldehído al 4%.

A continuación, vuelva a poner en marcha la bomba y perfunda al menos 10 mililitros del fijador. Cuando se haya administrado todo el paraformaldehído, detenga la bomba y retire la aguja. Transfiera el ajolote a un plato de plástico y colóquelo en una platina de microscopio fluorescente.

Luego, con las luces apagadas, seleccione un filtro que permita la excitación de Dil, que emite una luz roja anaranjada. Después de una perfusión exitosa, la tinción de Dil es visible como una señal roja de admisión en todos los tejidos del ajolote, incluida la cola, las extremidades, las branquias y los ojos. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en una hora si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe tener cuidado de no lacerar los vasos sanguíneos principales o el corazón al abrir la cavidad torácica e insertar la aguja en línea con la aorta para evitar punciones directas. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como las preparaciones esqueléticas, para responder preguntas adicionales. Tras su desarrollo, esta técnica abrió el camino para que los investigadores del campo biomédico exploraran la vasculatura de diferentes especies.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar una perfusión cardíaca del ajolote con el tinte de carbocianina, Dil. No olvide que trabajar con agujas y paraformaldehído puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como usar el equipo de protección personal adecuado, mientras se realiza el procedimiento.