Preparación de vesículas de membrana plasmática de células madre mesenquimales de médula ósea para terapia potencial de reemplazo de citoplasma

El objetivo general de este procedimiento es administrar una nueva terapia de reemplazo de citoplasma al músculo gastrocnemio de ratones utilizando vesículas de membrana plasmática, o PMV derivadas de células madre mesenquimales de médula ósea de ratón o BMSC. Este método puede ayudar a responder preguntas con la suplementación de células con citoplasma joven de otras BMSC a través de la fusión de PMV puede mejorar o incluso revertir los fenotipos asociativos de edad. La principal ventaja de esta técnica es que la encapsulación de PMV del citosol BMSC puede ser inducida instantáneamente por extrusiones mecánicas.

Cuando se demuestra este método, es fundamental que, a medida que se extruye y se construyen, los pasos son difíciles de aprender mediante pruebas para poseerlo realmente. Para generar los PMV, primero se cultivaron BMSC de ratón en medio de cultivo DMEM completo en un pocillo de una placa de seis pocillos en una incubadora humidificada a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Cuando las células hayan alcanzado el 90% de confluencia, enjuague el pocillo con 0,5 mililitros de PBS libre de calcio y separe las células con 0,5 mililitros de tripsina-EDTA al 0,25%.

Después de tres minutos a 37 grados centígrados, golpee la placa con la palma de la mano varias veces para facilitar la disociación celular y detener la digestión con un mililitro de medio de cultivo. Transfiera las células a un tubo cónico de cinco mililitros para la centrifugación y vuelva a suspender el pellet en cuatro mililitros de medio de cultivo fresco. A continuación, divida las células entre dos pocillos de una nueva placa de seis pocillos y devuelva la placa a la incubadora de cultivos celulares durante 24 horas.

Al día siguiente, recoja las células de un pozo mediante digestión con tripsina como se acaba de demostrar. Resuspender el pellet en 0,5 mililitros de medio de cultivo fresco después de la recolección por centrifugación. Cargue las células en una jeringa de insulina de un mililitro y conecte la jeringa a una unidad de filtro.

Presione rápidamente el émbolo para exprimir las celdas a través del filtro y deseche el medio extruido. A continuación, cargue y dispense 0,5 mililitros de medio de cultivo adicional a través del filtro como se acaba de demostrar, recogiendo el medio de la segunda extrusión. Siembre 150 microlitros del medio recolectado en un plato con fondo de vidrio de 35 mililitros y deje que las vesículas se asienten durante unos 10 minutos.

A continuación, confirme la presencia de VMP en un microscopio de contraste de fase invertida equipado con una cámara CCD que utiliza una lente de objetivo 20 veces. Para rastrear el recinto mitocondrial y el potencial de membrana en los PMV, tiñe un cultivo de BMSC confluente al 90% con un colorante mitocondrial apropiado o una sonda de potencial de membrana mitocondrial, respectivamente, en un medio de cultivo fresco durante 30 minutos a 37 grados Celsius. A continuación, enjuague las células tres veces con 0,5 mililitros de PBS por lavado y recoja las células por digestión con tripsina para la generación de PMV como se acaba de demostrar para su visualización por microscopía confocal.

Para rastrear la localización citoplasmática de las proteínas PMV, primero diluya dos microgramos de ADN plasmídico superenrollado para un casete de expresión de EGFP y seis microlitros de reactivo de transfección catiónica en tubos individuales de 0,5 mililitros que contienen 50 microlitros de DMEM libre de suero. Agite los tubos, seguido de una breve centrifugación. A continuación, añada el reactivo de transfección gota a gota en el tubo que contiene la solución de ADN diluida.

Agite la mezcla de transfección de ADN de forma robusta durante un minuto, seguido de un breve centrifugado en una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, alimente un cultivo de BMSC confluente al 30% en una placa de seis pocillos con dos mililitros de medio de cultivo fresco y agregue la mezcla de ADN gota a gota a las células. 48 horas después de su transfección, se recolecta el BMSC por digestión con tripsina y se preparan los VMP como se acaba de demostrar.

A continuación, los PMV pueden analizarse mediante microscopía confocal utilizando un objetivo de aceite 100 veces. Antes de inyectar los PMV, etiquete un cultivo de BMSC con un tinte fluorescente de tinción de membrana en un mililitro de medio de cultivo fresco a 37 grados Celsius durante 30 minutos y recoja las células por digestión con tripsina. Vuelva a suspender las células marcadas en 0,5 mililitros de medio de cultivo fresco suplementado con un microgramo de polietileno amina y prepare los PMV como se ha demostrado.

A continuación, concentre los PMV por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en 100 microlitros de medio de cultivo fresco con un suave remolino. A continuación, cargue las células en una jeringa de insulina de un mililitro equipada con una aguja de calibre 30 y desinfecte el exterior del músculo gastrocnemio de un ratón BALB/c anestesiado con etanol al 75%. A continuación, inyecte lentamente todo el volumen de PMV en el músculo y permita que el animal se recupere bajo una lámpara de calor.

Después de 12 horas, espolvoree etanol al 75% sobre el músculo, abra la piel con unas tijeras y extraiga todo el músculo gastrocnemio en ambos extremos. Enjuague el músculo con PBS y colóquelo bajo un microscopio de fluorescencia. Usando la lente del objetivo de 20 veces, retire los trozos de tejido muscular no fluorescente con una cuchilla de afeitar afilada y pique los trozos fluorescentes restantes de color rojo intenso en cubos de unos nueve milímetros cúbicos.

Incruste cada cubo en un medio de temperatura de corte óptimo. Luego sumerja los cubos en nitrógeno líquido durante cinco minutos. Y almacenar las muestras de tejido a menos 20 grados centígrados hasta su análisis.

Los PMV generados a partir de BMSC, como se ha demostrado, exhiben predominantemente un tamaño en el rango de aproximadamente tres micrómetros de diámetro, examinados bajo microscopía de contraste de fase utilizando el objetivo de 20 veces. La transfección de BMSC con un casete de expresión fluorescente durante 48 horas ilustra la encapsulación citoplasmática de la proteína EGFP por los PMV. Además, el uso de un tinte mitocondrial fluorescente revela que una gran fracción de los PMV contienen mitocondrias.

La mayoría de los cuales dan positivo para un colorante de potencial de membrana mitocondrial, lo que indica la funcionalidad de las mitocondrias. El tratamiento con aminas de polietileno antes de su administración in vivo evita la agregación de PMV durante su concentración centrífuga para la eliminación de componentes celulares. El marcaje con colorante de membrana de las BMSC antes de la generación de PMV facilita la generación de PMV rastreables por fluorescencia.

De hecho, la visualización de secciones congeladas del músculo gastrocnemio después de la administración intramuscular de PMV marcados indica la entrega de PMV al citoplasma de la célula muscular, probablemente a través de endocitosis. Al intentar el procedimiento de generación de PMV, es importante recordar cargar la jeringa con el número adecuado de células para presionar el émbolo rápidamente al enjuagar las células a través del filtro. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la terapia con células madre exploraran el tratamiento de enfermedades relacionadas con la edad en ratones.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar PMV de BMSC para la administración de citoplasma en el músculo gastrocnemio de ratones.