Glycoengineering metabólico del ácido siálico utilizando N-acil-modificado Mannosamines

El objetivo general de esta técnica es generar células o productos derivados de células con expresión de ácido siálico modificado. Por lo tanto, las células se tratan con manosaminas modificadas con N-acilo que se metabolizan a los ácidos siálicos correspondientes y posteriormente se expresan en la superficie celular. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la glicobiología, como la influencia de los glicoconjugados en las interacciones receptor-ligando.

La principal ventaja de esta técnica es que es fácil de aplicar y puramente citotóxica. Para demostrar la glicoingeniería metabólica, utilizaremos la N-acetilmannosamina, que está disponible comercialmente. Además, demostraremos la síntesis y el uso de N-propionil y N-butanoilmannosamina.

Se muestran los efectos biológicos de la glicoingeniería metabólica sobre la expresión de ácido polisiálico. Primero, disuelva 431.2 miligramos de clorhidrato de manosamina en 10 mililitros de una solución de metóxido de sodio de tres milimolares en una botella de vidrio de 15 mililitros que contenga una barra agitadora. Enfríe la mezcla en hielo a cero grados centígrados.

Mientras revuelve, agregue lentamente 210 micrómetros de cloruro de propionilo gota a gota a la solución. Luego, incube la mezcla agitadora a cero grados centígrados durante cuatro horas. Después de esto, transfiera la solución a un tubo de plástico de 50 mililitros y haga de cuatro a 8 agujeros en la tapa del tubo con una aguja fina.

Congele rápidamente la solución con nitrógeno líquido. A continuación, liofilizar la muestra hasta que se haya secado por completo. Después de la liofilización, disuelva el producto seco en acetato de etilo, metanol y agua.

Con una pipeta, cargue la solución en una columna de gel de sílice previamente preparada. Después de eluir 500 mililitros de solvente, recoja fracciones de cuatro mililitros. Transfiera las fracciones eluidas a un tubo de plástico de 15 mililitros y haga de tres a seis agujeros en la tapa del tubo con una aguja fina.

Después de congelar la solución con nitrógeno líquido, liofilizar la muestra hasta que se haya secado por completo. Cultivo de células de neuroblastoma Kelly en medio RPMI a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Antes de la aplicación de las manisominas, separe las células del neuroblastoma de Kelly incubándolas durante 10 minutos con tripsina y EDTA.

Después de neutralizar la tripsina con medio RPMI, cuente las células utilizando una cámara de Neubauer. Para medir los monosacáridos de ácido siálico, coloque las células en 500 microlitros de medio en una placa de cultivo de tejidos de 48 pocillos. Para el análisis de ácidos polisiálicos, coloque las células en tres mililitros de medio en una placa de cultivo celular de seis centímetros de diámetro.

Agregue los respectivos derivados de la maniosamina, disueltos en RPMI, a las celdas recién plateadas, en una concentración final de cinco milimolares e incube a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono, reemplazando el medio que contiene las Mannosaminas modificadas con N-acilo cada 24 horas. Después del tratamiento, decantar el medio y lavar las células con PBS. Separar las células incubándolas durante 10 minutos con tripsina y EDTA.

Neutralizar la tripsina añadiendo el mismo volumen de medio de cultivo celular a las células desprendidas. Después de esto, transfiera las celdas separadas a tubos de plástico de 15 mililitros. Centrifugar las muestras durante tres minutos a 500 veces G. Después de desechar el sobrenadante, lavar las células tres veces con cinco mililitros de PBS.

Después de la centrifugación, vuelva a suspender los gránulos celulares recolectados en 500 microlitros de tampón de lisis de HPLC helado. Ultrasónica las muestras con una aguja de procesador ultrasónico tres veces durante un período de 30 segundos a amplitudes medias-altas, enfriando las muestras en hielo durante al menos un minuto entre los ciclos. Después de centrifugar las muestras de células lisadas, separe el sobrenadante de las fracciones de membrana en tubos de plástico de 1,5 mililitros.

Para la hidrólisis ácida, agregue 150 microlitros de una solución molar de TFA a las fracciones de membrana separadas. Incubar las muestras durante cuatro horas a 80 grados centígrados con agitación a 200 a 600 RPM. A continuación, transporte las muestras a tubos de filtro de 0,5 mililitros con membranas de exclusión de tres kilodalton.

Centrifugar las muestras durante aproximadamente 30 minutos a 20.000 veces G y 21 grados Celsius, hasta que el volumen de la fase superior sea inferior a 20 microlitros. Después de esto, deseche los insertos y haga de dos a cuatro agujeros en las tapas de los tubos que contienen el ultrafiltrado con una aguja fina. Después de congelar las muestras con nitrógeno líquido, liofilizarlas durante la noche.

Vuelva a suspender las muestras secas en 10 microlitros de solución de TFA de 120 milimolares y agregue 50 microlitros de solución de DMB. Transfiera las muestras a tubos oscuros de 1,5 mililitros para protegerlas de la luz ultravioleta. Incubar las muestras de membrana celular y los estándares durante 1,5 horas a 56 grados centígrados.

Después de la incubación, agregue cuatro microlitros de solución de hidróxido de sodio de 400 milimolares a cada muestra para detener la reacción de etiquetado. Para el análisis de HPLC, ajuste la temperatura de la columna a 40 grados Celsius y configure el detector de fluorescencia a 373 nanómetros para la excitación y 448 nanómetros para la omisión, respectivamente. Inyecte 10 microlitros de volumen de muestra y separe las sondas durante 15 minutos a un caudal de 0,5 mililitros por minuto con metanol, acetonitrilo y agua como eluyente.

Para el análisis de espectrometría de masas, inyecte 20 microlitros de cada muestra de HPLC recolectada en un sistema de detección selectiva de masas LC. En el software de evaluación del sistema de detección selectiva de masas LC, seleccione el pico de interés en el cromatograma iónico total. Visualice el espectro de masas del pico resuelto y muestre la relación masa-carga positiva entre 300 y 700.

Agregue un mililitro de tampón de lisis Western blot a los gránulos previamente preparados de células de glicoingeniería y vórtice. Incubar las muestras durante 30 minutos en hielo, vórtice cada cinco minutos. A continuación, centrifugar las muestras durante 1,5 horas a 20.000 veces G y cuatro grados centígrados.

A continuación, recoge el sobrenadante que contiene las proteínas de las células lisadas en tubos de 1,5 mililitros. Prepare las muestras para la página SDS añadiendo 10 microlitros de tampón de muestra Laemmli a 90 microlitros de cada fracción de proteína. Hervir las muestras durante cinco minutos.

Después de cargar las muestras en un gel de acrilamida SDS al 8%, haga funcionar el gel a 25 miliamperios durante dos horas a temperatura ambiente. Cuando termine, retire con cuidado la cubierta de vidrio del gel y corte la parte superior del gel que contiene los bolsillos de carga. A continuación, coloque el gel sobre una membrana de micro nitrocelulosa de 0,2, previamente empapada en tampón Western blot.

Transfiera las proteínas a la nitrocelulosa de acuerdo con la recomendación del sistema. Después de retirar la membrana de nitrocelulosa del sistema de transferencia, tiñe la mancha con rojo de Ponceau para visualizar las proteínas y, por lo tanto, controlar la calidad de la transferencia. Luego, transfiera la membrana de nitrocelulosa a una cámara de plástico y agregue 10 mililitros de solución de bloqueo.

Después de incubar la membrana de nitrocelulosa, decantar la solución de bloqueo y agregar el anticuerpo monoclonal anti-ácido polisiálico 735 en PBS. Después de la incubación, lave la membrana al menos tres veces durante cinco minutos con PBS. Ahora, agregue el anticuerpo secundario policlonal anti-IgG de ratón acoplado a la peroxidasa de rábano picante, a la membrana de nitrocelulosa.

Después de incubar y lavar la membrana, transfiérala a una placa de un generador de imágenes adecuado. Luego, detecte la señal de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ácido neuroamínico N-glicolil marcado con DMB, eluye entre siete y nueve minutos.

Y, el ácido N-acetil neuramínico marcado con DMB eluye entre 10 y 12 minutos. Varios picos más pequeños observados en el cromatograma representan DMB no reaccionando e intermedios de reacción. Los cromatogramas de HPLC de los lisados celulares muestran varios picos indefinidos, que representan impurezas internas y subproductos de DMB de la reacción con otros alfa cetoácidos presentes en los lisados celulares.

El tratamiento con N-acetil manosamina a menudo conduce a la depleción del ácido N-glicolilneuramínico en la superficie celular. En los cromatogramas de células lisadas tratadas con ácido neuroamínico N-propionil o ácido neuramínico N-butanoil, se observan picos que indican la aparición de los correspondientes ácidos siálicos no naturales. La reacción de DMB con las especies de ácido siálico conduce a un aumento de la masa molecular de 116,2 dalton, en comparación con las especies de ácido siálico que no están marcadas con este colorante.

Además de las especies iónicas potenciadas, también se observan los aductos de sodio. DMB-Neu5Gc eluye poco después de la especie DMB no reaccionada o parcialmente reaccionada, lo que explica la aparición de picos indefinidos en el espectro de masas de DMB-Neu5Gc. El tratamiento de las células de neuroblastoma de Kelly con N-propionilmannosamina o N-butanoilmannosamina conduce a una reducción de la expresión de ácido polisiático en la superficie celular.

Por otro lado, el tratamiento con N-acetilmannosamina conduce a un aumento de la expresión de ácido polisiático. Mediante la aplicación de esta técnica, se pueden generar células con sialilación total en varios días. Estas células de glicoingeniería pueden utilizarse en otros experimentos.

Por ejemplo, para estudiar las interacciones receptor-ligando o, como se muestra aquí, para inhibir la expresión de ácido polisiático. El procedimiento de ingeniería metabólica presentado aquí está optimizado para experimentos con ácido siálico. Sin embargo, el mismo procedimiento también se puede utilizar en experimentos con animales.

Esperamos que nuestro protocolo presentado y esta producción de video sea una ayuda para que los autores lleven la glicoingeniería metabólica a los laboratorios para analizar la función y también el papel biológico del ácido siálico y los receptores de ácido siálico en los sistemas biológicos. Los químicos orgánicos podrían sintetizar mannosaminas modificadas con N-acilo con estructuras más complejas y usarlas como se sugiere en nuestro protocolo. Siguiendo nuestro protocolo, todas las muestras deben analizarse inmediatamente después del etiquetado con fluorescencia.

Por lo tanto, no debe haber retrasos entre los analizadores HPLC y ACMS.