Purificación de proteínas de superficie celular biotiniladas de Rhipicephalus microplus Células epiteliales intestinales

Purificación de proteínas de superficie celular biotiniladas a partir de células epiteliales intestinales de Rhipicephalus microplus. Dentro de este estudio, se utilizó una metodología modificada basada en el gradiente de Percoll para aislar células epiteliales individuales del tejido intestinal de Rhipicephalus microplus. Las proteínas unidas a la superficie se biotinilaron y purificaron a través de perlas magnéticas de estreptavidina para su utilización en aplicaciones posteriores.

Disección del epitelio intestinal a partir de Rhipicephalus microplus semiingurgitado. Necesitarás los siguientes materiales. Adhiere una tira de cinta adhesiva al fondo de una placa de Petri.

Añade una gota de Super Glue a la cinta. Coloque el lado ventral de la garrapata hacia abajo sobre el superpegamento, dejando que se seque. Sumerja completamente la garrapata en 100 ml de PBS.

Utilizando un bisturí de tamaño 11, corte desde la parte superior de los ojos hasta los festones inferiores a ambos lados de la garrapata. Con pinzas estériles, retire completamente el escuto y el aloscutum para exponer los órganos internos. Retire los órganos finos y blancos en forma de filiformes y otras membranas.

Retire el intestino con fórceps. Guarde la tripa en HBSS y PIC helados. Disociación de células epiteliales.

Necesitarás los siguientes materiales. Vierta el intestino diseccionado en un colador de células de 70 micras dentro de un tubo Falcon de 50 ml. Como se puede formar un vacío dentro del tubo Falcon, levante el filtro para permitir la circulación del aire.

Enjuague el tejido intestinal con 50 ml de HBSS helado con PIC. Vuelva a suspender las tripas en 30 ml de HBSS helado con PIC. Si es necesario, use un raspador estéril para ayudar en la resuspensión intestinal.

Centrifugar a 500 g. Retirar el sobrenadante y repetir el proceso de lavado tres veces. Resuspender las células intestinales en 10 mL de DMEM, 2% FCS, 5 milimolares de EDTA, un milimolar de TCEP y PIC.

Mezclar suavemente. Incubar durante 60 minutos a 37 grados centígrados bajo rotación lenta con un rodillo. Filtre la suspensión a través de un filtro de celdas de 250 micras.

Vórtice el flujo a través. Y filtre a través de un filtro de células de 70 micras, recogiendo el flujo restante. Centrifugar la suspensión.

Aislamiento de células epiteliales individuales mediante un gradiente de Percoll. Necesitarás los siguientes materiales. Filtrando a través del papel de prefiltro AP15, prepare 40% y 20% de Percoll en agua Milli-Q.

Cargue una jeringa estéril con la solución de Percoll. Aplíquelo en el equipo de filtros y descargue lentamente el Percoll. Deje enfriar a cuatro grados centígrados durante una hora antes de aplicar el degradado.

Configure la bomba peristáltica como se muestra. Usando una bomba peristáltica configurada a la velocidad más baja, coloque tres ml de Percoll al 40% en un tubo ultracentrífugo de 16 ml. Deje que se asiente sobre el hielo durante 15 minutos.

La velocidad de la bomba debe conducir a un caudal inferior a un ml por minuto. Inclinando el tubo en un ángulo de 45 grados, use la bomba peristáltica para colocar el 20% de Percoll encima de la capa del 40%. Asegúrese de que el tubo de salida esté apoyado contra el tubo de centrífuga para evitar que las gotas se mezclen con las capas inferiores.

La velocidad de la bomba debe conducir a un caudal inferior a un ml por minuto. Deje que las capas se asienten sobre el hielo durante 15 minutos. Utilizando la bomba peristáltica a un caudal inferior a un mL por minuto para colocar una capa de tres mL de solución de DMEM que contiene las células epiteliales aisladas en un gradiente de Percoll del 20 al 40%.

Asegúrese de que el tubo de salida esté apoyado contra el tubo de centrífuga para evitar que las gotas se mezclen con las capas inferiores e interrumpan el gradiente. Centrifugar a 600 g durante 10 minutos. Recoja las interfases entre el DMEM, el gradiente de Percoll del 20 % y el gradiente de Percoll del 20 % y el 40 % para aislar células individuales epiteliales.

Biotinilación de proteínas de superficie celular y aislamiento de proteínas de superficie biotiniladas. Necesitarás los siguientes materiales. Biotinilato 100 microlitros de células epiteliales unicelulares utilizando el kit de conjugación de biotina tipo A según las instrucciones del fabricante.

Agregue 100 microlitros de PBS, 1% de Triton X-100, 10% de glicerol, 100 micromolares de glutatión oxidado y PIC a las células biotiniladas. Incubar en hielo durante una hora con una mezcla suave cada 10 minutos. Centrifugar el extracto celular a 20.000 g a cuatro grados centígrados durante 20 minutos y reservar.

Prepare 50 microlitros de perlas magnéticas de estreptavidina lavando con 1.000 microlitros de TBS 1%Tween-20. Mezclar suavemente moviendo con el dedo. Coloque el tubo en un soporte magnético, recogiendo las cuentas contra el costado del tubo.

Retire y deseche el sobrenadante. Combine 300 microlitros de proteínas de superficie celular biotiniladas con perlas magnéticas lavadas. Incubar durante dos horas a temperatura ambiente con agitación.

Recoja las cuentas con el soporte magnético, retire y deseche el sobrenadante. Agregue 300 microlitros de TBS 1%Tween-20 al tubo, mezclando suavemente para volver a suspender las perlas. Recoja las cuentas, retire y deseche el sobrenadante.

Repite este paso de lavado dos veces. Agregue 100 microlitros de glicina molar 1 molar pH dos a las perlas magnéticas. E incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos.

Recoja las perlas y elimine el sobrenadante que contiene proteínas de superficie biotiniladas eluidas. La figura uno es una representación del protocolo utilizado para aislar las células epiteliales y sus proteínas de superficie de una garrapata completa. Utilizando este protocolo, aproximadamente 1,2 por 10 a las siete células por ml con 75 a 80% de viabilidad y 20 a 24 microgramos de proteínas de superficie biotiniladas purificadas se pueden purificar a partir de una disección inicial de 50 garrapatas.

En las figuras 2A y 2B se muestran imágenes representativas de microscopía de fluorescencia de células epiteliales de garrapatas preparadas utilizando este protocolo. Las células aparecen como una morfología singular, esférica, de superficie lisa y un tamaño consistente en toda la muestra. Se visualiza que los aislamientos deficientes contienen una disociación incompleta de las células epiteliales individuales con poblaciones celulares variables identificadas a través de los diferentes tamaños y morfologías de las células.

La contaminación cruzada de las proteínas del huésped, figura 3A, se puede minimizar enjuagando adecuadamente las tripas de las garrapatas para producir un gradiente de Percoll blanco o claro, figura 3B. La comparación de proteínas por SDS-PAGE, figura 4A, tinción de plata, figura 4B, mancha de puntos, figura cinco, y ELISA, figura seis, indica que las metodologías descritas purificaron con éxito proteínas de superficie biotiniladas de células epiteliales individuales aisladas de intestinos de garrapatas Rhipicephalus microplus. En conclusión, los métodos utilizados en este estudio aislaron con éxito células epiteliales individuales de todo el intestino de Rhipicephalus microplus.

Se obtuvieron proteínas de la superficie de las células epiteliales de Rhipicephalus microplus para su posterior análisis y estudios. Finalmente, el protocolo desarrollado ha demostrado el rendimiento potencial de células epiteliales individuales del intestino de la garrapata y la eficiencia de las proteínas de superficie biotiniladas de la célula. El protocolo desarrollado se puede utilizar en cualquier especie de garrapata de importancia económica en un esfuerzo por investigar las interacciones entre garrapatas y huéspedes mediante el estudio de la composición de proteínas de membrana del intestino.