Detección de ligandos estrogénica en productos de Cuidado Personal con una pantalla de estrógeno levadura optimizado para el laboratorio de enseñanza de pregrado

El objetivo general de este procedimiento es utilizar una prueba de detección de estrógenos en levadura para cuantificar agonistas del receptor de estrógeno humano extraídos de productos de cuidado personal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la toxicología, la alteración endocrina y la ecofisiología, ya que detecta y cuantifica estrógenos ambientales en el agua, los alimentos y los productos de cuidado personal. Las principales ventajas de esta técnica in vitro son que es económica, ampliamente utilizada y proporciona una excelente plataforma para enseñar habilidades técnicas de laboratorio.

La detección de estrógenos ambientales es fundamental porque pueden alterar la señalización hormonal, especialmente durante el desarrollo fetal y los períodos de transición fisiológica como la pubertad. Las partes más difíciles de este método son los cálculos y el análisis de datos, que hemos simplificado mediante el desarrollo de una aplicación de fácil uso. Asimismo, es esencial una pipetación precisa.

Este protocolo comienza con la preparación de los reactivos. Prepare medios de glucosa y galactosa, controles de vehículo con etanol al 50 % y estándares de estradiol que se utilizarán el primer día del ensayo, así como tampón LacZ, ditiotreitol y carbonato de sodio para el segundo día. Esterilice los medios de glucosa y galactosa por filtración a través de un filtro de 0,2 micrómetros.

Hasta 23 productos diferentes de cuidado personal o PCP y controles de extracción se pueden probar por triplicado en una sola placa de 96 pocillos. Los PCP incluyen jabón, crema para el cabello, champú, protector solar, maquillaje, crema de afeitar y loción. Para fines de filmación, las muestras se prepararán a partir de solo ocho PCP.

Combine un gramo de cada muestra con 10 mililitros de etanol anhidro en un tubo cónico de 15 mililitros. Además, prepare un control negativo de extracción que consista en 11 mililitros de etanol anhidro en un tubo cónico de 15 mililitros. Homogenice el contenido de cada tubo cónico durante 30 minutos mediante una combinación de agitación manual y vortexeo.

Centrifugar los tubos cónicos a la velocidad máxima permitida en una centrífuga con rotor de cubetas durante 10 minutos. Verter el sobrenadante de cada tubo a través de un filtro celular de 40 micrómetros hacia un tubo cónico de 50 mililitros. Luego, transferir el contenido de cada tubo cónico de 50 mililitros a un vial de centelleo de vidrio.

Deje que el etanol se evapore completamente dejando los viales abiertos en una campana ventilada durante una semana. Proteja las muestras en proceso de secado de la luz para evitar la degradación de los componentes sensibles a la luz. Cuando las muestras estén secas, reconstituya cada muestra en un mililitro de etanol al 50% y luego agite en vórtex para homogeneizar.

Dos noches o aproximadamente 42 horas antes de preparar las placas para el ensayo de estrógeno en levadura o placas YES, utilice técnica estéril para subcultivar la levadura agregando 0,1 mililitros de cada cultivo activo de levadura a 10 mililitros de medio con glucosa esterilizado por filtración en un matraz Erlenmeyer estéril. Incube a 30 grados Celsius y continúe incubando los cultivos originales como reservas. Dos días después, en el día uno del ensayo YES, utilice técnica estéril para diluir los cultivos de levadura suspendidos y el medio con galactosa esterilizado por filtración en un vaso de precipitados estéril.

Confirme la densidad óptica pipeteando 120 microlitros de cada muestra de levadura por triplicado junto con tres blancos de medio de galactosa en una placa de poliestireno transparente. Utilice un espectrofotómetro de placa para verificar que el cultivo de levadura diluido tenga una densidad óptica neta de 0,065 ± 0,005 a una longitud de onda de 610 nanómetros. Determine la OD610 neta de la levadura restando la OD610 de los blancos de medio de galactosa.

Utilizando un pipeteador repetidor con una punta de jeringa estéril, agregue la suspensión de levadura diluida a los pocillos de una microplaca estéril de polipropileno de 96 pocillos según este diseño de placa. Durante la pipetación, mantenga la suspensión de levadura original en agitación continua girando el vaso de precipitados o mezclando con la pipeta. Por último, agregue 120 microlitros de medio de galactosa esterilizado por filtración a los pocillos H10 a H12, indicados en verde en el diseño de la placa, para servir como controles de medio que tendrán en cuenta los absorbentes aportados únicamente por el medio.

Prepare placas separadas para cada combinación de cepa de levadura y sustrato colorimétrico que se probará. A continuación, construya una curva patrón en cada placa mediante dilución seriada según el diseño de la placa. Utilice una pipeta de canal único con puntas estériles para agregar cinco microlitros de patrón de estradiol a los pocillos A2, A2 y A3. Use una pipeta multicanal para mezclar el contenido de los pocillos mediante pipeteo y luego transfiera 205 microlitros de los pocillos A1 a A3 a los pocillos B1 a B3. Repita la transferencia de 205 microlitros hasta la fila G. Una vez completada la dilución seriada, deseche 205 microlitros de los pocillos G1 a G3. Al final de este paso, todos los pocillos del patrón deben contener 120 microlitros.

Agregue cinco microlitros de etanol al 50 % a cada pocillo del control de vehículo que contiene la suspensión de levadura, los pocillos H1, H2 y H3, indicados en azul en este diseño de placa. El siguiente paso consiste en agregar tres réplicas de cinco microlitros de muestras o controles negativos de extracción a los pocillos que contienen la suspensión de levadura, indicados en morado en el diseño de placa. Anote en qué pocillos se colocan cada muestra o control de extracción.

Para llevar un registro de qué pocillos contienen muestras y cuáles no, comience con una caja nueva de puntas y utilice puntas de las mismas posiciones en la caja que las posiciones de los pocillos correspondientes en la placa. Mezcle el contenido de los pocillos de la muestra, del control de extracción y del control de vehículo mediante pipeteo. Ajuste los volúmenes de estos pocillos a 120 microlitros retirando 205 microlitros de cada uno.

Selle cada placa con una película porosa adhesiva estéril, etiquétela y colóquela a incubar a 30 grados Celsius durante 17 horas. Después de la incubación de 17 horas, retire las placas del incubador. Si no es posible procesar las placas inmediatamente, envuélvalas en film plástico y refrigere las placas envueltas a cuatro grados Celsius durante seis días.

Cuando esté listo para procesar las placas, desenróllelas. Utilice un pipetador multicanal para mezclar el contenido de cada fila de pocillos y luego transfiera 50 microlitros de la suspensión de levadura de cada pocillo al pocillo correspondiente de una placa microplaca de poliestireno transparente de 96 pocillos. Etiquete la nueva placa.

Para evitar la contaminación cruzada entre pozos, utilice puntas de pipeta nuevas para cada pozo, pero las puntas no necesitan ser estériles. En una campana extractora, añada 20 microlitros de DTT de un molar a 20 mililitros de tampón LacZ descongelado y a temperatura ambiente, para obtener una concentración final de un milimolar de DTT. Mezcle bien el tampón LacZ.

Utilizando una pipeta repetidora, agregue 200 microlitros de tampón LacZ que contenga DTT y ya sea ONPG o CPRG a todos los pocillos de la placa de poliestireno, y mida y registre inmediatamente la densidad óptica a 610 nanómetros de todos los pocillos utilizando un lector de placas. Repita según sea necesario para placas adicionales. Cubra las placas con una tapa e incúbelas a 30 grados Celsius durante los tiempos indicados.

Una vez finalizada la incubación, retire las placas del incubador. Utilice una pipeta repetidora para añadir 100 microlitros de carbonato de sodio a cada pocillo con el fin de detener la reacción de beta-galactosidasa. Mida y registre la densidad óptica a 405 nanómetros para ONPG o a 574 nanómetros para CPRG de todos los pocillos utilizando un espectrofotómetro de placas.

Se puede realizar un cálculo de los valores de LacZ utilizando una aplicación automatizada que requiere la instalación de Java. Para comenzar, abra la aplicación automatizada de LacZ descrita en el apéndice uno. Pegue las lecturas de densidad óptica a 405 nanómetros para ONPG o a 574 nanómetros para CPRG de todas las pocillos, utilizando un diseño de placa idéntico al mostrado en la figura uno.

Ingrese la duración de la incubación en horas para que el ensayo desarrolle color y haga clic en Siguiente. Pegue las lecturas de densidad óptica a 610 nanómetros para todos los pocillos. Haga clic en Enviar para mostrar los resultados de LacZ.

Los resultados de LacZ se pueden copiar utilizando comandos del teclado y pegar en una hoja de cálculo o en otros archivos según sea necesario. Comience este análisis abriendo la aplicación en línea para el análisis de datos del ensayo YES. Cargue un archivo de datos CSV formateado como se describe en la primera pestaña.

Digitalice la curva patrón de estradiol en la segunda pestaña y estime los parámetros de regresión. Vea los resultados del modelo de regresión en la tercera pestaña, y luego encuentre los valores interpolados del eje x correspondientes a los valores de LacZ de las muestras en la cuarta pestaña. Haga clic en la quinta pestaña para ver los valores de equivalente de estrógeno o EEQ de las muestras.

Finalmente, estandarice los valores de EEQ según la masa original de la muestra, como se describe en el protocolo del texto. Se muestran ejemplos de curvas patrón tras una incubación de 17 horas de levadura con 17 beta-estradiol. Por las razones expuestas en el manuscrito, el CPRG suele ser una opción de sustrato mejor que la ONPG.

De acuerdo con observaciones previas, los ensayos con levadura que expresaban ER Beta fueron más de un orden de magnitud más sensibles que los ensayos con levadura que expresaban ER Alpha. Por lo tanto, la actividad estrogénica se detectó con mayor frecuencia en levaduras que expresaban ER Beta. Un objetivo adicional del estudio fue probar tiempos de duración de incubación compatibles con la programación de un curso de laboratorio de pregrado.

Cuando se introdujo un período de refrigeración de seis días tras la incubación de 17 horas, las curvas estándar obtenidas de placas refrigeradas fueron comparables a las de placas no refrigeradas. Los errores estándar de los parámetros estimados mediante modelos de regresión logística de cuatro parámetros fueron todos menores para las placas refrigeradas que para las no refrigeradas. Por lo tanto, refrigerar las placas durante seis días reduce el error y mejora la precisión de las estimaciones de EEQ.

Una vez dominada, esta técnica puede completarse en dos o tres a cuatro sesiones de horas. Al intentar el procedimiento, es importante recordar emplear una técnica estéril en todos los pasos realizados antes del período de incubación de 17 horas, pipetear con cuidado y precisión, y seguir el diseño de la placa presentado en la figura uno. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como ensayos en animales in vivo, para investigar mecanismos adicionales de acción estrogénica y efectos en organismos completos.

Tras su desarrollo, la prueba de cribado de estrógenos en levaduras se aceptó como una medida de bajo costo para detectar ligandos estrogénicos en muestras ambientales, como alimentos, tejidos vegetales y productos de cuidado personal. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar extracciones sencillas de productos de cuidado personal, cultivar levaduras, preparar curvas de dilución estándar, llevar a cabo el ensayo YES en una placa de 96 pocillos y completar los cálculos asociados. Y no olvide que trabajar con estradiol puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes y otros equipos de protección personal, así como garantizar una eliminación adecuada durante la realización de este procedimiento.