Name: Iontoforesis en tiempo real con tetrametilamonio para cuantificar la fracción de volumen y la tortuosidad del espacio extracelular cerebral (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Aprende iontoforesis en tiempo real con tetrametilamonio para cuantificar la fracción de volumen y la tortuosidad del espacio extracelular cerebral en tejido vivo. Este método permite caracterizar parámetros dinámicos del ECS.

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<ol><li>Sykova, E., Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+in+brain+extracellular+space%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Diffusion in brain extracellular space.</a> Physiol Rev. 88 (4), 1277-1340 (2008).</li>
<li>Nicholson, C. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/230904011_Diffusion_and_related_transport_mechanisms_in_brain_tissue">Diffusion and related transport mechanisms in brain tissue.</a> Rep Prog Phys. 64 (7), 815-884 (2001).</li>
<li>Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-selective+microelectrodes+and+diffusion+measurements+as+tools+to+explore+the+brain+cell+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Ion-selective microelectrodes and diffusion measurements as tools to explore the brain cell microenvironment.</a> J Neurosci Methods. 48 (3), 199-213 (1993).</li>
<li>Nicholson, C., Phillips, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+diffusion+modified+by+tortuosity+and+volume+fraction+in+the+extracellular+microenvironment+of+the+rat+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ion diffusion modified by tortuosity and volume fraction in the extracellular microenvironment of the rat cerebellum.</a> J Physiol. 321, 225-257 (1981).</li>
<li>Nicholson, C., Sykova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+space+structure+revealed+by+diffusion+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extracellular space structure revealed by diffusion analysis.</a> Trends Neurosci. 21 (5), 207-215 (1998).</li>
<li>Xie, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+drives+metabolite+clearance+from+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sleep drives metabolite clearance from the adult brain.</a> Science. 342 (6156), 373-377 (2013).</li>
<li>Hrabetova, S., Nicholson, C. Biophysical properties of brain extracellular space explored with ion-selective microelectrodes, integrative optical imaging and related techniques. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Biophysical+properties+of+brain+extracellular+space+explored+with+ion-selective+microelectrodes%2C+integrative+optical+imaging+and+related+techniques">Electrochemical Methods for Neuroscience Neuroscience</a>. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC press. 167-204 (2007).</li>
<li>Rice, M. E., Okada, Y. C., Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+and+heterogeneous+diffusion+in+the+turtle+cerebellum%3A+implications+for+volume+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Anisotropic and heterogeneous diffusion in the turtle cerebellum: implications for volume transmission.</a> J Neurophysiol. 70 (5), 2035-2044 (1993).</li>
<li>Vargova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+parameters+of+the+extracellular+space+in+human+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Diffusion parameters of the extracellular space in human gliomas.</a> Glia. 42 (1), 77-88 (2003).</li>
<li>Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-barreled+and+concentric+microelectrodes+for+measurement+of+extracellular+ion+signals+in+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Double-barreled and concentric microelectrodes for measurement of extracellular ion signals in brain tissue.</a> J Vis Exp. (103), (2015).</li>
<li>Xiao, F., Hrabetova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enlarged+extracellular+space+of+aquaporin-4-deficient+mice+does+not+enhance+diffusion+of+Alexa+Fluor+488+or+dextran+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enlarged extracellular space of aquaporin-4-deficient mice does not enhance diffusion of Alexa Fluor 488 or dextran polymers.</a> Neuroscience. 161 (1), 39-45 (2009).</li>
<li>Sherpa, A. D., Pvan de Nes,, Xiao, F., Weedon, J., Hrabetova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gliotoxin-induced+swelling+of+astrocytes+hinders+diffusion+in+brain+extracellular+space+via+formation+of+dead-space+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Gliotoxin-induced swelling of astrocytes hinders diffusion in brain extracellular space via formation of dead-space microdomains.</a> Glia. 62 (7), 1053-1065 (2014).</li>
<li>Kume-Kick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independence+of+extracellular+tortuosity+and+volume+fraction+during+osmotic+challenge+in+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Independence of extracellular tortuosity and volume fraction during osmotic challenge in rat neocortex.</a> J Physiol. 542 (Pt 2), 515-527 (2002).</li>
<li>Saghyan, A., Lewis, D. P., Hrabe, J., Hrabetova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+diffusion+in+laminar+brain+structures+exemplified+by+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Extracellular diffusion in laminar brain structures exemplified by hippocampus.</a> J Neurosci Methods. 205 (1), 110-118 (2012).</li>
<li>Fedirko, N., Svichar, N., Chesler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+and+use+of+high-speed%2C+concentric+H%2B-+and+Ca2%2B-selective+microelectrodes+suitable+for+in+vitro+extracellular+recording%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophys%22%5BJournal%5D)">Fabrication and use of high-speed, concentric H+- and Ca2+-selective microelectrodes suitable for in vitro extracellular recording.</a> J Neurophys. 96 (2), 919-924 (2006).</li>
<li>Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+from+an+injected+volume+of+a+substance+in+brain+tissue+with+arbitrary+volume+fraction+and+tortuosity%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Diffusion from an injected volume of a substance in brain tissue with arbitrary volume fraction and tortuosity.</a> Brain Res. 333 (2), 325-329 (1985).</li>
<li>Nicholson, C., Tao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hindered+diffusion+of+high+molecular+weight+compounds+in+brain+extracellular+microenvironment+measured+with+integrative+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Hindered diffusion of high molecular weight compounds in brain extracellular microenvironment measured with integrative optical imaging.</a> Biophys J. 65 (6), 2277-2290 (1993).</li>
<li>Thorne, R. G., Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+diffusion+analysis+with+quantum+dots+and+dextrans+predicts+the+width+of+brain+extracellular+space%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo diffusion analysis with quantum dots and dextrans predicts the width of brain extracellular space.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (14), 5567-5572 (2006).</li>
<li>Wolak, D. J., Thorne, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+macromolecules+in+the+brain%3A+implications+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">Diffusion of macromolecules in the brain: implications for drug delivery.</a> Mol Pharm. 10 (5), 1492-1504 (2013).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

<img alt="Figura 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55755/55755fig10.jpg" /> Figura 10: Datos no ideales que demuestran problemas técnicos comunes. (A) Los diagramas de problemas técnicos comunes con microelectrodos de iontoforesis: Comparación de la liberación normal de TMA de un microelectrodo funcionamiento iontoforesis con tres fuentes que demuestran problemas técnicos. [Aumento alto, a1] La corriente en una fuente iontoforética ideal es llevada igualmente por la libera...

<html> El espacio extracelular (ECS) es la red de canales interconectados exteriores a todas las células cerebrales y contiene tanto fluido intersticial como matriz extracelular ( Figura 1a y Figura 1b ). La distribución de muchas sustancias necesarias para la función de las células cerebrales, incluyendo nutrientes, hormonas y neurotransmisores, se produce por difusión a través de la ECS. Los cambios en los parámetros físicos de este espacio, incluyendo el volumen, la geometría y la matriz extracelular, pueden afectar drásticamente la difusión a través de la ECS y las concentraciones de iones locales que bañan las células cerebrales, que tienen un profundo impacto en la función de las células cerebrales 1 , 2 . La iontoforesis en tiempo real (RTI) se utiliza para determinar dos características estructurales de una región del cerebro: fracción volumétrica y tortuosidad 3 , 4 ,&quot;Xref&quot;&gt; 5. La fracción de volumen ( α ) es la proporción de volumen de tejido ocupado por la ECS ( V ECS ) con respecto al volumen de tejido total ( tejido V ) en un volumen elemental representativo; <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/55755/55755eq1.jpg" /> La tortuosidad ( λ ) es el obstáculo relativo que una sustancia encuentra cuando se difunde a través de una región del cerebro en comparación con un medio sin obstrucciones; <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/55755/55755eq2.jpg" /> Donde D * (cm 2 s -1 ) es el coeficiente de difusión efectiva de la sustancia en el cerebro y D (cm 2 s -1 ) es el coeficiente de difusión libre de la sustancia en un medio libre, tal como gel de agarosa diluido. Hoy en día, la sustancia de sonda más comúnmente utilizada para la RTI es el tetrametilamonio catiónico pequeño (TMA). TMA tiene un peso molecular de 74 g / mol, se disocia completamente en solución y tiene una carga positiva. RTI estudios con este ion han demostrado que α <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/55755/55755eq3.jpg" /> 0,2 y λ <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/55755/55755eq3.jpg" /> 1,6 1 , 2 . Esto significa que el ECS es aproximadamente el 20% del volumen total del cerebro y que la difusión de una pequeña molécula inerte ocurre aproximadamente 2,5 veces más lenta en el ECS que en un medio sin obstrucciones 3 . Sin embargo, ambos α y λ varían con la edad, región y estado del cerebro y en condiciones patológicas 1 . Las alteraciones de estos parámetros se han relacionado con el desarrollo del cerebro, el envejecimiento, el sueño, la epilepsia y muchos otros procesos y enfermedades fundamentales del cerebro 1, 6 . Mientras que otras técnicas miden α y λ , RTI puede medir tanto en regiones localizadas de tejido vivo en tiempo real. Por esta razón, RTI se ha convertido en una herramienta indispensable para investigar los cambios en α y λ durante desafíos agudos y reversibles. La teoría que apoya RTI fue originalmente validada por Nicholson y Phillips, y la técnica se ha utilizado ampliamente desde entonces 4 , 7 . Los experimentos que emplean RTI comienzan con la liberación de un pulso de TMA desde un microelectrodo fuente por iontoforesis en un gel de agarosa diluido. Una vez expulsados, los iones se difunden libremente lejos de la fuente puntual, eligiendo entre un número potencialmente infinito de trayectos aleatorios ( Figura 1d ). La concentración cambiante del ion se mide con el tiempo utilizando un microelectrodo selectivo de iones (ISM) situado aproximadamente100 μm de distancia ( Figura 1c ). Los cambios en la concentración de TMA se representan gráficamente y se ajustan a una curva que permite calcular tanto el D como el número de transporte del microelectrodo de iontoforesis (parámetros discutidos en el Protocolo). Con estos valores, el procedimiento se repite en una región cerebral de interés para obtener D * y para calcular tanto α como λ . El control del microelectrodo de iontoforesis, la recopilación de datos, la representación gráfica y la adaptación de la curva de concentración de TMA y el cálculo de los parámetros experimentales son típicamente realizados por los programas Wanda y Walter, específicamente diseñados para este fin (el software y sus manuales son Libremente disponible de los autores a petición). La sección del Protocolo de esta revisión describe los procedimientos básicos necesarios para diseñar y realizar la RTI en rodajas de cerebro de roedores. La técnica también se ha utilizado en la no-barraIncluyendo los cortes del cerebro humano y las preparaciones in vivo del cerebro 1 , 4 , 6 , 8 , 9 . La sección Resultados representativos proporciona resultados ideales y no ideales para resaltar matices en la interpretación de datos. Finalmente, la sección de Discusión abarca brevemente técnicas de resolución de problemas, limitaciones de RTI, técnicas alternativas usadas para estudiar el ECS y aplicaciones futuras de RTI. <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55755/55755fig1.jpg" /> Figura 1: Diagramas de difusión a través de ECS. (A) Diagrama de ECS: Demuestra el tamaño y la ubicación de la ECS en una sección de cerebro típico. El amarillo marca el ECS entre los procesos grises de las células cerebrales. El volumen de ECS es aproximadamente 20% del volumen de tejido total ( es decir, la fracción de volumen = 0.2) en condiciones fisiológicas. B ) Diagrama ampliado del ECS: Destaca los parámetros físicos que contribuyen a la tortuosidad, incluyendo la geometría de las células cerebrales (gris) y la matriz extracelular (diagrama como una malla de glicosaminoglicanos multicolores y proteoglicanos). ( C ) Diagrama 3D de difusión de una fuente puntual: Demuestra el movimiento neto de moléculas inertes de una fuente iontoforética a una ISM. Excluyendo barreras de difusión y captación celular, las moléculas se difunden hacia el exterior en todas las direcciones, produciendo un frente de concentración esférica. El ISM cuantifica la concentración local de las moléculas inertes liberadas de la fuente iontoforética. D ) Simulación por computadora de la difusión en ECS del cerebro: [Extremo izquierdo] Configuración para la simulación de Monte Carlo; Las esferas verdes representan los procesos de las células cerebrales y la cruz roja representa una fuente puntual. Esta configuración modela el tejido cerebral diagrama en la Figura 1a . [Imágenes medias] 3 y6 moléculas que realizan movimientos al azar mientras que difunden a través del espacio extracelular del cerebro, demostrado en 2 dimensiones. [Derecha] Caminatas aleatorias de muchas moléculas liberadas de la fuente puntual. El movimiento neto de todas las moléculas desde la fuente puntual está hacia fuera como se representa en la Figura 1c . Los paseos aleatorios acumulados delimitan los espacios entre las celdas ( es decir, el ECS, véase la referencia 5 para una explicación adicional). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55755/55755fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Convertidor A/D y D/A</td><td>National Instruments Corporation</td><td>NI USB-6221 DAQ</td><td>El NI USB-6221 todavía se vende como un dispositivo 'Legacy' por NI. Recomiendan usar DAQ de la serie NI USB-6341 X para nuevas instalaciones, sin embargo, no hemos probado las unidades más nuevas. Describimos el uso del NI USB-6221 con MATLAB y Windows 7 (32 bits). Alternativas: el convertidor A/D PCI-MIO-16E-4 mucho más antiguo (utilizado solo en Windows XP o sistemas operativos anteriores) con panel de conectores BNC-2090 BNC y cable SH68-68-EP. Como se señala en el Manual de Wanda, está disponible un programa experimental de MATLAB para utilizar archivos binarios de Axon.</td></tr><tr><td>agarosa</td><td>Lonza</td><td>NuSieve GTG Agarose #50081</td><td>para preparar gel de agarosa diluido para mediciones RTI</td></tr> amplificador <tr><td>para ISM</td><td>Dagan</td><td>Modelo IX2-700 Preamplificador intracelular dual Amplificador de</td><td>iones y voltaje de referencia con N = 0.1 (para barril de referencia) y N = 0.001 (para barril de iones) Etapas de cabeza</td></tr><tr><td>Miscroscopio de compuestos biológicos (con objetivo 4x y 10x)</td><td></td><td></td><td>para astillar las puntas de los microelectrodos e inspeccionar los microelectrodos; varios proveedores, p. ej.</td></tr><tr><td>Tubo de vidrio capilar de borosilicato Theta</td><td>AmScope Harvard Apparatus</td><td>Warner Instruments modelo TG200-4; pedido #64-0811</td><td>tubo de vidrio de doble barril para microelectrodos selectivos de iones y microelectrodos iontoforéticos; Diámetro exterior 2,0 mm, diámetro interior 1,4 mm, tabique 0,2 mm, longitud 10 cm</td></tr><tr><td>cepillo</td><td>Winsor & Newton</td><td>University Series 233, cepillo</td><td>de mango redondo de tamaño 0, disponible en Amazon</td></tr><tr><td>Bunsen quemador</td><td>Cámara Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>para visualizar micropipetas</td><td>Olympus</td><td>OLY-150</td><td>requiere monitor, el filtro IR en el iluminador de la subetapa es opcional</td></tr><tr><td>Registrador</td><td></td><td></td> <td>de gráficospara registrar continuamente los voltajes en el microelectrodo selectivo de iones durante la calibración en patrones de tetrametilamonio y durante el experimento RTI; p. ej. Kipp & Zonen tipo BD112 carta de doble canal registrada, disponible</td></tr><tr><td>clorotrimetilsilano reacondicionado, puriss., > 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>catálogo # 92360</td><td>para silanización; ATENCIÓN: inflamable, toxicidad aguda (oral, dérmica, inhalación), corrosión cutánea, daño ocular, reacciona violentamente con el agua, consulte la información de seguridad de Sigma-Aldrich para obtener una descripción completa</td></tr><tr>Software<td>comercial</td><td>MathWorks</td><td>MATLAB, caja de herramientas de adquisición</td> de <td>datos para la adquisición y el análisis de datos utilizando los programas Wanda y Walter. Tenga en cuenta que hay una licencia académica disponible.</td></tr><tr><td>gafas de protección ocular</td><td>Microscopio</td> compuesto de etapa fija Fisher <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>puede utilizar otros microscopios compuestos con pinzas de etapas fijas</td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>#11251-10</td><td>para astillar el vidrio capilar; Dumond #5, preferiblemente usado y que ya no es necesario para el trabajo fino</td></tr><tr><td>campana</td><td></td><td></td> de <td>humos para la silanización y el llenado de la punta del barril selectivo de iones con intercambiador de iones líquidos; varios proveedores, p. ej. Captair con filtro apropiado vendido por Erlab</td></tr><tr><td>portaobjetos de microscopio de vidrio</td><td>Fisher</td><td>#12-550A</td><td>para astillar las puntas de los microelectrodos</td></tr><tr><td>calentador/agitador</td><td>Fisher</td><td>Corning PC-420D</td><td>para preparar gel de agarosa diluido y soluciones</td></tr><tr><td>de agitación unidad iontoforética</td><td>Dagan</td><td>ION-100 y PS-100</td><td>ION-100 es una unidad de iontoforesis de un solo canal +/- 130 V conforme; PS-100 es una fuente de alimentación externa; alternativas: p. ej. Axoprobe-1A fabricado por Axon Instruments (ahora Molecular Devices), fuera de producción, compruebe la disponibilidad de unidades reacondicionadas (eBay y otros sitios)</td></tr><tr><td>intercambiador de iones líquido (LIX) para tetrametilamonio</td><td>Intercambiador de iones de potasio IE190</td> de <td>World Precision Instruments</td><td>Nota: esto es equivalente al intercambiador de potasio Corning original 477317 basado en tetrafenliborato: no confunda con el intercambiador de potasio portador neutro originario del laboratorio del Dr. Simon, ETH, Zurich, que no detecta el tetrametilamonio, y es vendido por Fluka. También puede hacer usted mismo un intercambiador de iones líquido para tetrametilamonio: 3% en peso de tetrakis de potasio = borato de (p-clorofenil) disuelto en 2,3-dimetilnitrobenceno. Compre productos químicos de Fluka (ahora parte de Sigma). Véase Oehme y Simon (1976) Anal. Chim. Acta 86, 21-25; PRECAUCIÓN: Las propiedades toxicológicas de este intercambiador de iones líquidos no se han determinado completamente. La ingestión o el contacto con el cuerpo humano puede ser perjudicial. ¡Tenga el debido cuidado! Los intercambiadores de iones líquidos deben almacenarse en un lugar fresco fuera de la luz solar directa.</td></tr><tr><td>soporte de microelectrodo</td><td>WPI</td><td>M3301EH</td><td>para sostener el prefabricado de microeletrodo selectivo de iones para la silanización y llenar la punta del barril selectivo de iones con intercambiador de iones líquidos; WPI vende dos versiones de este soporte, M3301EH transparente y M3301EH negro. En nuestra experiencia, el M3301EH transparente parece ser más resistente que el M3301EH negro.</td></tr><tr><td>micromanipulador</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td>para posicionar el microelectrodo selectivo de iones prefabricado durante la silanización y el llenado de la punta del barril selectivo de iones con intercambiador de iones líquidos; puede ser sustituido por cualquier micromanipulador de tres ejes en buen estado de funcionamiento</td></tr><tr><td>extractor de micropipetas</td><td>Sutter Instruments Modelo</td><td>P-97</td><td>para tirar de tubos de vidrio de doble cañón; se pueden usar otros tiradores siempre que puedan acomodar tubos de vidrio de doble barril de gran diámetro</td></tr><tr><td>Termómetro de microsonda</td><td>Physiotemp</td><td>Modelo BAT-12R</td><td>La sonda fina de este termómetro se coloca cerca de la aguja del sitio de registro</td></tr><tr><td></td><td>BD</td><td>Jeringas y agujas # 305122 (calibre 25)</td> <td>para silanización; Agujas BD PrecisionGlide de 25 G x 5/8 pulgadas (0,5 mm x 16 mm)</td></tr><tr><td>objetivo 5X seco</td><td>Olympus</td><td>MPlan N</td><td></td></tr><tr><td>objetivo 10X inmersión en agua</td><td>Olympus</td><td>UMPlan FL N</td><td>10X objetivo es inmersión en agua, apertura numérica es 0,3, distancia de trabajo es de 3,3 mm recipientes</td></tr><tr><td>de plástico (con tapas)</td><td>Fisher</td><td>#14-375-148</td><td>para almacenar soluciones estándar de tetrametilamonio y microelectrodos</td></tr><tr><td>plataforma y platina de traslación x-y para microscopio de platina fija</td><td>EXFO</td><td>Gibraltar La plataforma Burleigh</td><td>sostiene la cámara de corte, los micromanipuladores y los accesorios, la platina de traslación x-y mueve el microscopio sin comprometer la estabilidad</td></tr><tr><td>del registro minicopa</td><td></td><td></td> porosa <td>para mediciones de RTI en un gel de agarosa diluido;</td></tr><tr><td>adhesivo reutilizable</td> casero <td>Bostik</td><td>Blu-Tack</td><td>para asegurar microelectrodos a recipientes de retención y otros usos; varios proveedores, disponibles en Amazon</td></tr><tr><td>micromanipulador robótico con posicionamiento preciso x, y, z</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td>se necesitan dos micromanipuladores para sostener por separado el microelectrodo selectivo de iones y el microelectrodo iontoforético. También es posible pegar micropipetas en una matriz espaciada (ver texto).</td></tr><tr><td>unidad de acondicionamiento de señal con filtro de paso bajo</td><td>Axon Instruments</td><td>CyberAmp 320 o 380</td><td>ya no está disponible en el fabricante, pero puede estar disponible en E-Bay; alternativas: e.g. Filtro/Amplificador FLA-01 de Cygnus Technology. Se trata de un instrumento de un solo canal con un corte mínimo de 10 Hz que utiliza un filtro Bessel multipolar, pero la empresa puede estar dispuesta a modificarlo para una frecuencia de corte más baja (2 Hz) si es necesario.</td></tr><tr><td>alambre de plata</td><td>A-M Systems</td><td>#7830</td><td>diámetro 0.015", desnudo (sin recubrimiento)</td></tr> <tr><td>cámara de corte</td><td>Aparato de Harvard</td><td>Warner modelo RC-27L</td><td>esta es la cámara de corte por inmersión; no utilice la interfaz</td></tr> cámara de corte <tr><td>microscopio estereoscópico</td><td></td><td></td><td>para la silanización y el llenado de la punta del barril selectivo de iones con intercambiador de iones líquidos; montado horizontalmente; varios proveedores</td></tr><tr><td>jeringa, 10 mL</td><td>BD</td><td>Jeringas y Agujas #309604</td><td>para rellenar microelectrodos y para silanización; BD Luer-Lok</td></tr><tr><td>filtro de jeringa con punta 0.22 y micro; m poro</td><td>Whatman</td><td>#6780-1302</td><td>para filtrar soluciones de relleno; disponible en</td></tr><tr><td>Fisher jeringa aguja, calibre 28, 97mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>MicroFil MF28G-5</td><td>para rellenar microelectrodos</td></tr><tr><td>Tubería de teflón (=PTFE)</td><td>Suministro de componentes</td><td>STT-28 Pared de luz de tubo de PTFE (calibre 28)</td><td>para la silanización de barriles selectivos de iones; se adapta a agujas BD PrecisionGlide de 25 G x 5/8 pulg. Nota: El teflón es esencial, los tubos de PVC se derretirán con cera caliente.</td></tr><tr><td>sistema de control de temperatura</td><td>Harvard Apparatus</td><td>Warner Modelos TC-344B y SH-27A</td><td>TC-344B es un controlador de temperatura automático dual, SH-27A es un calentador en línea; el controlador y el calentador funcionan con cámaras de corte Warner</td></tr><tr><td>cloruro de tetrametamamonio (TMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-3411</td><td>solución de 5 M; ATENCIÓN: toxicidad aguda (oral, dérmica, inhalación), carcinogenicidad, peligroso para el medio ambiente acuático, consulte la información de seguridad de Sigma-Aldrich para obtener una descripción completa</td></tr><tr><td>micrótomo de cuchilla vibratoria</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td>para cortar cortes de cerebro</td></tr><tr><td>xilenos</td><td>Fisher</td><td>X5-1</td><td>para silanización; PRECAUCIÓN: inflamable, toxicidad aguda (oral, dérmica, inhalación), corrosión cutánea, daño ocular, carcinogenicidad, consulte la información de seguridad de Fisher para obtener una descripción completa</td></tr></tbody></table>

iontoforesis en tiempo real con tetrametilamonio para cuantificar la fracción de volumen y la tortuosidad del espacio extracelular cerebral

Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space

Esta revisión describe los conceptos básicos y el protocolo para realizar el método de iontoforesis en tiempo real (RTI), el patrón oro para explorar y cuantificar el espacio extracelular (ECS) del cerebro vivo. El ECS rodea todas las células cerebrales y contiene tanto el líquido intersticial como la matriz extracelular. El transporte de muchas sustancias necesarias para la actividad cerebral, incluyendo neurotransmisores, hormonas y nutrientes, se produce por difusión a través de la ECS. Los cambios en el volumen y la geometría de este espacio ocurren durante los procesos cerebrales normales, como el sueño, y condiciones patológicas, como la isquemia. Sin embargo, la estructura y la regulación de ECS cerebral, particularmente en estados enfermos, sigue siendo en gran parte inexplorada. El método RTI mide dos parámetros físicos del cerebro vivo: fracción volumétrica y tortuosidad. La fracción de volumen es la proporción de volumen de tejido ocupado por ECS. La tortuosidad es una medida del impedimento relativo que una sustancia encuentra cuando se difunde a través de un cerebroEn comparación con un medio sin obstrucciones. En RTI, una molécula inerte es pulsada desde un microelectrodo fuente en el cerebro ECS. A medida que las moléculas se difunden lejos de esta fuente, la concentración cambiante del ion se mide con el tiempo usando un microelectrodo selectivo de iones situado aproximadamente a 100 μm de distancia. A partir de la curva de difusión resultante, tanto la fracción volumétrica como la tortuosidad pueden ser calculadas. Esta técnica se ha utilizado en rebanadas cerebrales de múltiples especies (incluyendo seres humanos) e in vivo para estudiar los cambios agudos y crónicos de ECS. A diferencia de otros métodos, RTI se puede utilizar para examinar tanto los cambios reversibles e irreversibles de la ECS cerebral en tiempo real.

La utilidad de la técnica RTI se demuestra en un experimento diseñado para medir los cambios en α y durante un desafío hipoosmolar ( Figura 8 y Figura 9 ). Se ha demostrado previamente que la reducción de la osmolaridad de la ECS mediante lavado sobre ACSF hipotónico producirá una disminución en α y un aumento en λ 13 . <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1...

Este protocolo describe la iontoforesis en tiempo real, un método que mide los parámetros físicos del espacio extracelular (ECS) de los cerebros vivos. La difusión de una molécula inerte liberada en el ECS se utiliza para calcular la fracción volumétrica de ECS y la tortuosidad. Es ideal para estudiar cambios reversibles agudos en ECS cerebral.

Iontoforesis en tiempo real con tetrametilamonio para cuantificar la fracción de volumen y la tortuosidad del espacio extracelular cerebral

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the ...

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar el volumen, la fracción y la tortuosidad del espacio extracelular en el tejido cerebral. Este método responde a preguntas clave sobre la relación entre el espacio extracelular y la fisiología y la enfermedad. La principal ventaja de esta técnica es que permite la caracterización en tiempo real de dos parámetros importantes del espacio extracelular.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque el microelectrodo iontoforético muestra una tendencia a cambiar sus propiedades durante los experimentos y, con frecuencia, requiere la resolución de problemas durante los experimentos. La demostración visual de este método es fundamental, ya que se requiere la manipulación precisa de un microelectrodo selectivo de iones, un electrodo iontoforético en múltiples pasos para obtener un registro exitoso. Para comenzar este procedimiento, pase ACSF que contiene tetrametilamonio, o TMA, a través de la cámara de inmersión a dos mililitros por minuto.Ajuste el controlador de temperatura a la temperatura deseada y burbujee el ACSF con un 95% de oxígeno y un 5% de dióxido de carbono durante todo el experimento. A continuación, monte el electrodo de tierra en un soporte y sumerja su punta en el ACSF que atraviesa la cámara de inmersión. A continuación, llene el vaso poroso con TMA al 0,3% de agarosa preparado previamente y colóquelo en la cámara de inmersión.Ahora, fije un microelectrodo de iontoforesis al soporte de pipeta de un micromanipulador. Conecte el cable del microelectrodo de iontoforesis a la etapa principal de la unidad de iontoforesis. A continuación, asegure un ISM calibrado al segundo micromanipulador y conecte el ISM a sus etapas principales.Luego, encienda la computadora que contiene los programas Wanda y Walter. En la GUI de Wanda, haga clic en Calibrar. A continuación, en el cuadro Calibración, rellene los voltajes medidos durante la calibración ISM y haga clic en Ajustar datos.A continuación, haga clic en Aceptar en el cuadro Calibrar para transferir automáticamente la pendiente y la interferencia generadas a la GUI principal. En el lado izquierdo de la GUI, asegúrese de que todos los parámetros experimentales estén configurados en las entradas correspondientes. A continuación, coloque una sonda de temperatura en la taza de agar.Registre la temperatura medida en la entrada de temperatura en el cuadro Electrodo de medición de la GUI. A continuación, baje los microelectrodos al menos 1.000 micrómetros de profundidad en la agarosa y céntrelos en la copa. Visualízalos bajo el microscopio usando un objetivo 10X.En el amplificador de dos canales, mueva manualmente el conector de canal ISM a la salida de sustracción de voltaje para activar la resta entre los canales de referencia e ISM. Centre las puntas entre sí en los tres ejes direccionales. A continuación, ponga a cero las posiciones relativas de ambos microelectrodos en las cajas de control del micromanipulador y asegúrese de que los microelectrodos estén centrados con exactitud y precisión.A continuación, aleje el ISM 120 micrómetros del microelectrodo de iontoforesis en un eje. Posteriormente, inicie una grabación haciendo clic en Adquirir en la GUI y permita que el programa se ejecute para una grabación completa. En este procedimiento, abra el programa Walter en la computadora.En el menú Cero registros desde, haga clic en el botón Wanda Voltoro para leer los registros generados por Wanda. En la siguiente ventana emergente, seleccione uno o más registros para leer y haga clic en Abrir. En el menú de Excel de una escritura, haga clic en Hoja 1.3 y siga las indicaciones hasta que los registros se grafiquen automáticamente.Para comenzar el procedimiento de instalación, en el menú Dos opciones, haga clic en el botón seleccionar rec. A continuación, en la ventana emergente de la figura dos, utilice el ratón para mover el punto de mira sobre el primer registro que se va a procesar y pulse cualquiera de los botones del ratón para elegir el registro. Después de eso, haga clic en curva de ajuste en el menú y use al menos 20 iteraciones de ajuste para obtener un ajuste preciso de los datos.A continuación, seleccione todo para que se ajuste a todos los puntos de datos y seleccione continuar. El programa se ajustará a la curva mostrada. A continuación, seleccione la opción de escribir el resultado en el programa de hoja de cálculo adecuado haciendo clic en Excel en el menú de siete resultados.Asigne un nombre al archivo de Excel. Anote y registre los datos generados que se utilizarán para determinar la funcionalidad del microelectrodo de iontoforesis. Si el microelectrodo de iontoforesis se considera adecuado para el experimento, registre el número de transporte promedio de todos los ensayos en el campo final TransportNum en la GUI de Wanda.En este procedimiento, coloque un corte de cerebro de 400 micrómetros de grosor en la cámara de grabación asegurándose de que esté completamente sumergido en el ACSF que fluye. A continuación, mueva el microelectrodo de iontoforesis y el ISM por encima del campo de interés en el corte del cerebro. Sumerja ambos electrodos en el ACSF que fluye, pero por encima de la rebanada.A continuación, compense el voltaje de los canales de referencia y de detección de iones a cero milivoltios. Espere a que el voltaje en ambos canales se estabilice. En el registrador de gráficos, marque el voltaje medido en el canal de detección de iones del ISM.A continuación, coloque los microelectrodos ISM y de iontoforesis a 200 micrómetros de profundidad en el corte y a 120 micrómetros de distancia entre sí. Calcule la diferencia de voltaje entre las señales TMA medidas en el ACSF que fluye y en el cerebro e ingrese este valor en el campo Baseline Volt Millivolt en la caja de electrodos de medición de la GUI de Wanda. En el lado izquierdo de la GUI, asegúrese de que todos los parámetros experimentales se hayan ingresado correctamente.Inicie la grabación haciendo clic en Adquirir y permita que tome una grabación completa. Después de mover ambos microelectrodos fuera de la rebanada, use el registrador de gráficos para determinar cualquier cambio entre el voltaje medido ahora y su medición desde antes. Para analizar las grabaciones del cerebro, repita los procedimientos para el análisis de datos de agarosa utilizando el programa Walter.Escriba los datos en el programa de hoja de cálculo haciendo clic en Excel en el menú Walter. A continuación, registre la fracción de volumen del SEC cerebral, la tortuosidad del SEC cerebral y el aclaramiento inespecífico. Para verificar el número de transporte, tome nuevas grabaciones en agarosa y repita los procedimientos en el programa Walter para obtener el número de transporte.Inspeccione la hoja de cálculo y verifique si el número de transporte ha cambiado en más del 10% con respecto al número de transporte obtenido antes de las mediciones cerebrales. Si es así, los datos obtenidos con el microelectrodo iontoforético no son fiables. El número de transporte medido en este paso debe coincidir estrechamente con el obtenido antes de las mediciones cerebrales, de lo contrario, la fracción de volumen no puede considerarse precisa.Utilice los datos de calibración ISM recién obtenidos como entrada en el cuadro Wanda Calibrate y compruebe que el valor de la pendiente difiere en menos de un 10% de la calibración anterior. Aquí se muestran los datos representativos de un solo ensayo obtenido en agar que demuestra la curva de concentración de TMA. Y esta es una curva ajustada obtenida a partir del procesamiento de datos en Walter.La superposición de los datos en la curva ajustada demuestra que el ajuste de la curva realizado por Walter modela con precisión la difusión en este ensayo. Aquí está la tabla de mediciones de agar antes de la experimentación en el cerebro. A continuación se muestra un resumen de las mediciones tomadas en un corte de cerebro de ratón en condiciones experimentales y de control.El alfa disminuyó durante un desafío hipoosmolar, mientras que la tortuosidad aumentó como se esperaba. Alfa sobrepasó los valores de control en las condiciones de recuperación. Y aquí está la tabla de mediciones de agra después de la experimentación en el cerebro.Los números de transporte promedio antes y después del experimento estaban dentro del 10% entre sí, lo que indica que los valores registrados en el cerebro eran confiables. Una vez dominado, este procedimiento se puede realizar en 14 horas durante dos días. Desde el primer día, se fabrican y calibran los ISM.En el segundo día, los ISM se recalibran y se realiza una iontoforesis en tiempo real. Al intentar este procedimiento, es importante ser preciso en el espaciado de los electrodos. En segundo lugar, es importante aceptar un experimento solo si el número de transporte del microelectrodo iontoforético permanece estable durante todo el transcurso del experimento.Siguiendo este procedimiento, que caracteriza la difusión de pequeños cationes en el espacio extracelular, se puede pasar a realizar otras técnicas como el método de imagen óptica integrativa que permite responder a la pregunta de cómo se mueven las micromoléculas grandes en el espacio extracelular. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar el método de iontoforesis en tiempo real para cuantificar el volumen del espacio extracelular del cerebro y la tortuosidad en el cerebro vivo en la salud y la enfermedad. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.

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Iontoforesis en tiempo real con tetrametilamonio para cuantificar la fracción de volumen y la tortuosidad del espacio extracelular cerebral (Video) | JoVE Journal

Iontoforesis en tiempo real con tetrametilamonio para cuantificar la fracción de volumen y la tortuosidad del espacio extracelular cerebral

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