Name: In Vitro Diferenciación de células madre mesenquimales humanas en células funcionales en cardiomiocitos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Aprende a diferenciar células madre mesenquimales humanas en cardiomiocitos funcionales mediante señales ambientales y formación de agregados. Este método ofrece una alternativa sin agentes farmacológicos para terapias cardiovasculares.

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Los autores agradecemos a los siguientes miembros del personal y de investigación personal por sus contribuciones: Matthew Librach, Leila Maghen, Tanya A. Baretto, Shlomit Kenigsberg y Andrée Gauthier-Fisher. Este trabajo fue financiado por el fondo de investigación de Ontario la - excelencia en la investigación (ORF-RE, redondo #7) y crear programa Inc.

Todos los estudios con animales se realizaron e informaron de acuerdo con las directrices ARRIVE48. Todos los estudios se realizaron con la aprobación de la junta de ética en investigación institucional (REB número 454-2011, Sunnybrook Research Institute; REB 29889, Universidad de Toronto, Toronto, Canadá). Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado Animal de la Red Universitaria de Salud (Toronto, Canadá), y todos los animales recibieron cuidado humanitario de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio,8ª edición (Institutos Nacionales de Salud 2011).
1. Cultivo de tejidos
<ol>
	<li>Cultivo de HUCPVCs FTM, HUCPVCs de término (previamente establecidos, n ≥ 3 líneas independientes para cada uno)42 y BMSCs disponibles comercialmente en medio esencial alfa-mínimo (MEM) suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un cóctel de penicilina/estreptomicina (P/S) al 1%. Cultivo de cardiomiocitos primarios de rata y cocultivos de MSC-cardiomiocitos en el Medio Eagle Modificado de Dulbecco: Mezcla de nutrientes F-12 (DMEM-F12) que contiene 10% de FBS y 1% de P/S. 
	NOTA: Esterilice el medio con un filtro de 0,2 μm. Almacene las soluciones medias preparadas a 4 °C durante un máximo de 3 semanas.</li>
	<li>Mantener los cultivos celulares en incubadoras humidificadas (95% de humedad relativa, 37 °C y 5% de CO2) y paso a 70-80% de confluencia, determinado por microscopía de contraste de fases. Utilice volúmenes apropiados de medio para el tamaño de la placa de cultivo de tejidos utilizada (p. ej., 10 mL en una placa de 10 cm y 2 mL por pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos). Utilice estas condiciones de referencia cultural mientras dure el protocolo.</li>
	<li>Disociar las monocapas de MSC para el paso o el establecimiento de cocultivo de MSC-cardiomiocitos utilizando una solución de enzima de disociación (2 mL/pocillo en una placa de 6 pocillos) e incubar a 37 °C durante 4 min.</li>
	<li>Transfiera las células disociadas a un tubo de 15 ml y centrifugue a 400 x g durante 5 min.</li>
	<li>Aspire el sobrenadante sin alterar la pastilla celular y vuelva a suspender las células en 1 ml de un medio de cultivo adecuado para el recuento utilizando un contador de células automatizado. Siembra las celdas como se describe en las siguientes secciones del protocolo.</li>
</ol>
2. Preparación de cocultivos primarios de cardiomiocitos de rata-MSC
<ol>
	<li>Obtener tejido cardíaco para el aislamiento primario de cardiomiocitos.
	<ol>
		<li>Eutanasia de las crías de rata (5-6 días después del parto) utilizando la asfixia por CO2. Ajuste las cámaras deCO2 al 20% de reemplazo de gas (caudal = 0,2 x volumen de la cámara por minuto). Confirmar el exitus por la ausencia del reflejo de pellizco.</li>
		<li>Retire las aurículas con los vasos sanguíneos principales que conectan usando instrumentos esterilizados (es decir, pinzas y tijeras curvas)41. Transfiera los corazones a tubos de 50 ml que contengan PBS estéril con 1% de P/S (PBS-P/S) en hielo.</li>
		<li>Corta los ventrículos por la mitad y deja que la sangre se lave en un plato de 10 cm con 10 ml de PBS-P/S en hielo. Corte las paredes ventriculares en trozos pequeños (diámetro = 2-3 mm) con unas tijeras curvas.</li>
		<li>Transfiera las piezas de corazón de 10-12 animales a un tubo de 50 ml con una pipeta serológica y deje que se asienten.</li>
		<li>Retire la mayor cantidad posible de PBS-P/S sin quitar ninguna pieza de corazón. Agregue 10 mL de nuevo PBS-P/S.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Digiere el tejido cardíaco para aislar los cardiomiocitos.
	<ol>
		<li>Deje que las piezas del corazón se asienten. Sustituir el PBS-P/S por 10 mL de tripsina al 0,15% en PBS y agitar a 37 °C durante 10 min.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante. Repita la digestión descrita en el paso 2.2.1 tres veces más, pero decante los sobrenadantes en tubos de recolección de 50 mL que contengan 10 mL de FBS al 100%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Centrifugar las células (400 x g, 5 min) y aspirar el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en DMEM-F12 que contenga 10% de FBS y 1% de P/S y siembre en una placa de 6 pocillos (1 x 105 celdas/cm2, 2 mL de medio por pocillo).</li>
	<li>Después de 1 h, transfiera el medio que contiene células no adheridas a un tubo de 50 ml y deseche las células adheridas. Cuente las celdas en suspensión y vuelva a colocarlas en nuevas placas de 6 pocillos (1 x 105 celdas/cm2, 2 mL de DMEM-F12 que contengan 10% de FBS y 1% de P/S por pocillo).</li>
	<li>Inhibe la proliferación celular con bromodeoxiuridina (BrdU). 
	Precaución: BrdU es un teratógeno fuerte y se sospecha que es mutágeno. Asegúrese de proporcionar la capacitación adecuada y consulte la hoja de datos de seguridad antes de usar.
	<ol>
		<li>Una vez que las células se hayan adherido, reemplace el medio en la placa de 6 pocillos con DMEM-F12 que contenga 10% de FBS, 1% de P/S (2 mL de medio por pocillo) y 5 μM de BrdU. Incubar durante 16 h (37 °C, 5% CO2).</li>
		<li>Retire el medio que contiene BrdU y reemplácelo con DMEM-F12 que contenga 10% de FBS y 1% de P/S (2 mL de medio por pocillo).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Prepare las MSC previamente teñidas.
	<ol>
		<li>Una vez que los cultivos de MSC estén al 70-80% de confluencia en placas de 10 cm, retire el medio de cultivo y agregue 3 mL de solución de disociación celular. Incubar la placa a 37 °C y 5% de CO2 durante 5 min.</li>
		<li>Transfiera las células disociadas a un tubo de 15 ml y centrifugue a 400 x g durante 5 min.</li>
		<li>Aspire el sobrenadante sin alterar el pellet celular y vuelva a suspender las células en 1 mL de DMEM-F12 que contiene 10% de FBS y 1% de P/S para el recuento utilizando un contador de células automatizado.</li>
		<li>Diluir las células hasta una concentración de 1 x 106 MSC/mL de DMEM-F12 que contenga 10% de FBS y 1% de P/S.</li>
		<li>Incubar las MSC con colorante fluorescente viable e intransferible (5 μM, 30 min, 37 °C, 5% CO2) en tubos de centrífuga de 1,5 mL durante 1 h.</li>
		<li>Centrifugar los tubos a 400 x g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en DMEM-F12 que contiene 10% de FBS y 1% de P/S para una concentración celular de 1 x 106 MSC/mL. Repita esto un total de 3 veces.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transfiera las MSC a los cardiomiocitos (paso 2.5.2) a una concentración de 10 x 104 células por pocillo de la placa de 6 pocillos.</li>
</ol>
3. Preparación de cocultivos agregados
<ol>
	<li>Prepare una suspensión de una sola célula de MSCs (2 x 104 células/mL de medio, pasaje # ≤ 6) en alfa-MEM suplementada con 10% de FBS y 1% de P/S (ver paso 2.6). 
	NOTA: Consulte la sección 1 del protocolo para el paso de células. Alternativamente, pre-tiña las MSC según el paso 2.6.</li>
	<li>Inicie la formación de agregados colocando gotas de 25 μL de suspensión celular (500 células) en la superficie interna de las tapas de las placas de cultivo de tejidos de 10 cm (hasta 50 gotas por tapa). Coloque las tapas en sus contrapartes inferiores que contengan PBS-P/S. Incubar a 37 °C y 5% CO2. 
	NOTA: Coloque 5-7 mL de PBS-P/S en el plato de cultivo debajo de las gotas colgantes para evitar la evaporación de las gotas.</li>
	<li>Observe la formación de agregados en las gotas después de 3 días utilizando un microscopio estereoscópico. Si más de 40 de las 50 gotas contienen agregados formados, recoja las gotas de los párpados con una micropipeta de 1 ml y transfiera los agregados directamente a las monocapas primarias de cardiomiocitos de rata (preparados en los pasos 2.1-2.7; 10 gotas/pocillo). Evite el pipeteo vigoroso para preservar la integridad de los agregados.</li>
	<li>Mantenga los cocultivos agregados en las incubadoras hasta por 2 semanas, cambiando el volumen completo del medio (2 mL de DMEM-F12 que contiene 10% de FBS y 1% P/S por pocillo) cada 72 h.
	<ol>
		<li>Observe diariamente los agregados que se adhieren a las capas de células alimentadoras utilizando microscopía de campo claro. Registre los agregados de contratación cuando se observen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparar los agregados para el análisis.
	<ol>
		<li>Retire el medio y agregue 2 mL de PBS por pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos. Retire el PBS y agregue 2 mL de solución de disociación por pocillo. Incubar durante 3 min a 37 °C y 5% de CO2.</li>
		<li>Centrifugar a 400 x g durante 5 min para obtener un pellet de celda. Vuelva a suspender en medio, como se especifica para las aplicaciones descritas en los pasos siguientes (consulte los pasos 4.1, 5.1 y 6.1) y pase a través de un filtro de células de 70 μm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Citometría de flujo (FC) y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS)
<ol>
	<li>Incubar suspensiones celulares (1 x 105 células en 200 μL de PBS que contengan 3% de FBS) con anticuerpos primarios conjugados con fluoróforos (FITC o APC) (es decir, CD49f, Cx43, TRA-1-85, HLA-A, HLA-G y SIRPA para FC o TRA-1-85 para FACS; 1:40) a 4 °C durante 30 min, protegidos de la luz.</li>
	<li>Centrifugar (400 x g, 5 min) y resuspender las células en 1 mL de PBS con 3% de FBS para FC o PBS con 0,5% de FBS para FACS. 
	NOTA: El FC de las MSC fue optimizado por Hong et al.41.</li>
	<li>Mantenga las celdas a 4 °C en la oscuridad hasta que estén listas para ser analizadas por FC (al menos 1 x 104 eventos) o FACS. Ordene las celdas como se describe41. Vuelva a colocar las celdas clasificadas de alta positividad TRA-1-85 en placas de 6 pocillos (1 x 104 celdas/pocillo, 2 mL de DMEM-F12 que contienen 10% de FBS y 1% de P/S) dentro de 1 h. 
	NOTA: Para la estrategia de activación del antígeno de superficie de células humanas TRA-1-85, consulte la figura complementaria.</li>
</ol>
5. Inmunocitoquímica (ICC) y Microscopía
<ol>
	<li>Vuelva a colocar las suspensiones celulares obtenidas de los cocultivos (paso 3.5.2) o FACS (sección 4) en portaobjetos de cámara (1 x 104 celdas/pocillo, 2 mL de DMEM-F12 que contienen 10% de FBS y 1% P/S por pocillo). Deje que las células se adhieran durante la noche en una incubadora de cultivo de tejidos (consulte la sección 1 para conocer las condiciones).</li>
	<li>Fije las celdas usando 3 mL de paraformaldehído (PFA) al 4% en PBS durante 15 min a temperatura ambiente. Lavar 3 veces con 3 mL de PBS que contiene 1% de albúmina sérica bovina (BSA; PBS-BSA) durante 5 min por lavado. 
	Precaución: Use el equipo de protección personal adecuado cuando manipule PFA.</li>
	<li>Permeabilizar las células en 3 mL de PBS-BSA con Triton X-100 al 0,1%. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min para antígenos intracelulares (es decir, actinina alfa sarcomérica (aSarc) y Cx43), o 25 min para antígenos intranucleares (es decir, Mef2c y antígeno nuclear humano (HuNu)). Lavar 3 veces con 3 mL de PBS-BSA durante 5 min por lavado.</li>
	<li>Bloquee las muestras contra reacciones de anticuerpos inespecíficas con 3 mL de PBS que contengan un 5% de suero de cabra normal (NGS) y un 1% de BSA durante 15 min a temperatura ambiente. Lavar 3 veces con 3 mL de PBS-BSA durante 5 min por lavado.</li>
	<li>Incubar las células en los anticuerpos primarios (es decir, Mef2c, aSarc, Cx43 y HuNu) diluidos 1:200 en 3 mL de PBS-BSA a 4 °C durante la noche.</li>
	<li>Lavar 3 veces con 3 mL de PBS-BSA durante 5 min por lavado e incubar con anticuerpos secundarios durante 30 min a temperatura ambiente. Lavar 3 veces con 3 mL de PBS-BSA durante 5 min por lavado.</li>
	<li>Guarde las muestras teñidas en 3 mL de medio de montaje.</li>
	<li>Adquiera imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia. Utilice un objetivo de 10X (NA = 0,3) y un objetivo de 20X (NA = 0,45) para obtener imágenes de menor aumento. Utilice cubos de filtro de fluorescencia y longitudes de onda para GFP (ex = 470/22 nm, em = 525/50 nm) y RFP (ex = 531/40 nm, em = 593/40 nm) para los anticuerpos secundarios utilizados (consulte la Tabla de materiales y equipos).</li>
	<li>Cuantifique las imágenes utilizando software de procesamiento de imágenes (consulte la Tabla de materiales y equipos para conocer el software recomendado). Normalice las lecturas de intensidad de fluorescencia a las adquisiciones de control secundario.</li>
</ol>
6. Aislamiento de ARN y RT-PCR cuantitativa
<ol>
	<li>Prepare muestras de ARN a partir de cultivos de MSC indiferenciados o MSC clasificados a partir de cocultivos utilizando aislamiento de ARN basado en columnas, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Prepare 1 x 104 a 1 x 106 células en 0,7 mL de tampón de lisis celular (proporcionado con el kit de aislamiento de ARN) por muestra.</li>
	<li>Prepare ADNc a partir de hasta 2 μg de ARN por reacción RT de 100 μL.</li>
	<li>Realice qPCR utilizando 10 ng de ADNc por reacción (40 ciclos, temperatura de recocido/extensión de 60 °C).
	<ol>
		<li>Utilice cebadores para MY6H y cTnT humanos en una concentración de 500 nM y de 1 a 100 ng de ADNc por reacción (consulte la Tabla de materiales y equipos). Utilice GAPDH, ACTB y HPRT como normalizadores internos de limpieza. Utilice cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos disponibles comercialmente como control positivo. 
		NOTA: Exprese el cambio de plegamiento de la expresión en comparación con las muestras indiferenciadas de ADNc derivadas de MSC.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

El Dr. Clifford L. Librach es común titular de la patente: métodos de aislamiento y uso de células derivadas de tejido de cordón umbilical de primer trimestre, en Canadá y Australia.

La diferenciación cardiaca de células madre ha estado en desarrollo durante más de dos décadas, con varias diversas estrategias están utilizados para generar cardiomiocitos-como las células procedentes de MSC. Muchas de estas estrategias, sin embargo, son ineficientes, y las condiciones a menudo no son representativas del ambiente transplantada células encuentro en vivo.
En contraste con los métodos existentes, el protocolo presentado aquí utiliza una combinación de capas de alimentad...

Insuficiencia cardíaca congestiva (CHF) persiste como una causa importante de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. CHF ocurre a menudo después de la masiva pérdida de cardiomiocitos y el desarrollo de tejido cicatricial sin células como el resultado patológico de un infarto de miocardio (IM)1. Mientras que el corazón es un órgano parcialmente renovado, la residente madre y progenitoras celulares piscina responsable de ejecutar la regeneración tisular significativamente disminuye en abundancia y la función en pacientes envejecidos, a menudo convertirse en insuficiente para la recuperación óptima después de la lesión. Así, hay gran interés en el desarrollo de tratamientos experimentales que implican el trasplante de células de un donante sano en el miocardio dañado. Es imprescindible que las células del donante no sólo restauración la estructura del tejido, sino que también logran la recuperación funcional del miocardio afectado.
El corazón nativo emplea tejido reside en el corazón y endógenas originados en la médula ósea las células madre para después de la lesión de reparación2,3,4. Regenerativa células huésped derivadas y del donante-por igual-deben tener la capacidad de obtener el fenotipo apropiado y la función en el microambiente del miocardio remodelado, junto con la capacidad de manera eficiente y segura reemplazar las células perdidas. Métodos de diferenciación in vitro se han utilizado ampliamente para lograr la producción de cardiomiocitos de alta eficiencia, basada en la célula de vástago5,6. El perfil de expresión de marcadores de linaje cardíaco se utiliza para definir el proceso de diferenciación de células madre hacia el linaje cardíaco7. Diferenciación marcadores tempranos, tales como NKX2.5, factor potenciador de miocito 2C (Mef2c) y GATA48,9, pueden ser un indicio de la iniciación del proceso cardiomiogenético. Cardiomiocitos maduros marcadores utilizados para evaluar la eficacia de diferenciación son señal de regulador de la proteína α (SIRPA)10, troponina cardíaca T (cTnT)11, cadena pesada de miosina cardiaca (MYH6)8,12,13y conexina 43 (Cx43)14,15,16. Los métodos utilizando células madre embrionarias (ESCs) y células madre pluripotentes (PSC) han sido completamente optimizados y discutido sobre los detalles de factores inductivos de gradientes de nutrientes y oxígeno y la sincronización exacta de acción5,6,7,17,18. Sin embargo, tecnologías basadas en el ESC y el PSC aún presentan múltiples problemas éticos y de seguridad, junto con características electrofisiológicas e inmunológicos subóptima19,20. Transplantados con estas células a menudo experiencia immunorejection y requiere inmunosupresión permanente. Esto se debe principalmente a unir mal histocompatibilidad complejo () las moléculas de MHC en el host y de los donantes y a la resultante t-célula respuesta21. Mientras que los MHC de clase I que empareja es una posible solución, una práctica clínica más accesible requeriría una fuente de células que es universal immunoprivileged para superar la preocupación de rechazo.
Como una fuente alternativa de la célula para su uso en aplicaciones clínicas, MSCs y, en particular, BMSCs, han sido investigados para su uso en la regeneración de los tejidos desde su descripción inicial en 199522. MSCs se creen para ser residente células regenerativas que pueden encontrarse en casi cualquier tejido vascularizado23. A aislamiento de la fuente deseada, MSCs pueden ampliarse fácilmente en la cultura tienen capacidad amplia paracrina y poseen a menudo immunoprivileged o inmunomoduladores propiedades24,25. Su seguridad y eficacia han ya demostrados en varios estudios preclínicos, en particular para la regeneración cardiaca3,26.
Muchas estrategias de diferenciación de MSC utilizan a agentes farmacológicos, tales como 5-azacitidina22 y27de DMSO y crecimiento o factores morfogénicos, como ordenación5,7,28,29 o angiotensina II30, con eficacia variable. Sin embargo, estas estrategias no están basadas en los obstáculos que un ingenuo regenerador celular es probable encontrar después de autoguiado hacia el blanco o ser entregado al sitio de lesión en vivo. Estrategias más fisiológicamente relevantes, mientras que la más difícil de definir y manipular, se basan en la premisa que la diferenciación MSC puede ser inducida a través de señales del microambiente del tejido propio. Estudios previos han demostrado que la exposición a los lysates de la célula cardiaca31 o el miocardio ventricular32,33o dirigen contacto con cardiomiocitos primarios en vitro15,34, puede aumentar la expresión de marcadores cardiacos en MSCs. Otros han demostrado cardiomyogenesis espontánea después de tratar heridas cardiacas con MSCs35,36,37,38, aunque en parte, la fusión de BMSCs y cardiomiocitos39,40 generados por el miocardio naciente. A nuestro conocimiento, todavía no se han divulgado cardiomiocitos funcionales, espontáneamente contratación de MSCs humanos (hMSCs) de cualquier fuente de tejido.
El consenso actual es que todos MSCs surgen de células perivasculares23. Jóvenes de MSCs con propiedades pericyte puede ser aislado de la región perivascular del tejido de cordón umbilical humano41,42,43. En comparación con BMSCs, HUCPVCs poseen potencial mayor diferenciación y varias otras ventajas regenerativas, tanto en vitro41,44 y en vivo45,46,47. En particular, la fuente ser la interfaz materno-fetal, HUCPVCs tienen menor inmunogenicidad en comparación con adultos fuentes de MSCs. Nuestra investigación se centra en la caracterización y aplicaciones preclínicas de FTM HUCPVCs, la fuente más joven de MSCs investigado, que previamente hemos demostrado aumentaron multilineage proliferativa y mayor capacidad de diferenciación, incluyendo en el linaje de cardiomiogenético41.
Aquí, presentamos un protocolo que combina capas de alimentador primario de la célula cardiaca y formación agregada como fuerzas inductivas para lograr la diferenciación de cardiomiogenético completa de MSCs. agregados proporcionan un entorno 3D que modela mejor condiciones en vivo frente a culturas adherentes 2D. Utilizando capas cardiacas alimentador proporciona un entorno que es representativa del sitio de trasplante definitivo de las MSCs. Nos demuestran que jóvenes fuentes de MSCs aisladas de cordón umbilical antes o después del parto tienen una mayor capacidad para formar agregados y alcanzar el fenotipo cardíaco en comparación con adultos BMSCs, mientras que todavía mantiene su privilegio inmune. Además de la elevación escarpada de genes marcadores de linaje cardíaco y la expresión inducida de intracelular (es decir, reposo y MYH6) y proteínas de la superficie de la célula (es decir, SIRPA y Cx43) específico para cardiomiocitos, demostramos que se puede aprovechar el potencial de diferenciación de la FTM HUCPVCs con este método y que puede dar lugar a contraer espontáneamente cardiomiocitos-como las células.

<table><tbody><tr><td>0,25% Tripsina/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>Para la disociación celular</td></tr><tr><td>Alpha-MEM</td><td>Gibco</td><td>12571071</td><td>Para medios de cultivo HUCPVC y BMSC.</td></tr><tr><td>Anticuerpo CD49f conjugado con PE</td><td>Biolegend</td><td>313612</td><td>Marcador de integrina para el</td></tr><tr><td>anticuerpo humano Cx43/GJA1 conjugado con FC APC</td><td>R& Marcador</td><td></td><td>Connexin 43 de D Systems FAB7737A para el</td></tr><tr><td>anticuerpo HLA-A2 conjugado con FC FITC,</td><td>Genway Biotech Inc.</td><td>GWB-66FBD2 Marcador de</td><td>inmunogenicidad para</td></tr> el <tr><td>anticuerpo anti-HLA-G [MEM-G/9] conjugado con</td> FITC <td>FITC Abcam</td><td>ab7904</td><td>Marcador de inmunogenicidad para</td></tr><tr><td>el anticuerpo SIRPA/CD172a de ratón conjugado</td> con FC <td>FITC AbD Serotec/Bio-Rad</td><td>MCA2518F</td><td>Marcador cardíaco para</td></tr><tr><td>el anticuerpo humano TRA-1-85/CD147 conjugado con FC APC</td><td>R& D Systems</td><td>FAB3195A</td><td>Marcador de células humanas para el</td></tr><tr><td>anticuerpo humano TRA-1-85/CD147 conjugado con FITC</td> y FACS <td>R& D Systems</td><td>FAB3195F</td><td>Marcador de células humanas para FC y FACS</td></tr><tr><td>Anti-conexina 43/GJA1 anticuerpo</td><td>Abcam</td><td>ab11370</td><td>Cx43. Para el</td></tr><tr><td>anticuerpo secundario de absorción cruzada ICC Goat anti-conejo IgG (H + L), Alexa Fluor 555</td><td>Life Technologies</td><td>A-21428</td><td>Para el</td></tr><tr><td>anticuerpo ICC Anti-sarcomérico alfa actinina [EA-53]</td><td>Abcam</td><td>ab9465</td><td>aSARC. Para el</td></tr><tr><td>anticuerpo secundario de absorción cruzada IgM de cadena pesada contra el ratón ICC Goat, Alexa Fluor 555</td><td>Life Technologies</td><td>A-21426</td><td>Para el</td></tr><tr><td>anticuerpo de conejo ICC Mef2C (D80C1) XP</td><td>Nueva Inglaterra BioLabs Ltd.</td><td>5030S</td><td>para el</td></tr><tr><td>anticuerpo secundario IgG (H + L) anti-conejo ICC Donkey, Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A-21206</td><td>para el</td></tr><tr><td>anticuerpo ICC Anti-núcleos (HuNu) (clon 235-1)</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB1281</td> para el microscopio <td>estereoscópico ICC</td></tr><tr><td>MZ9.5</td><td>Leica</td><td></td><td>Para agregados de imágenes.</td></tr><tr><td>Microtubos centrífugos de 1,5 ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>Para teñir MSCs con colorante fluorescente.</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Software de procesamiento de imágenes de código abierto.</td></tr><tr><td>Aria II&nbsp;</td><td></td><td>Instalaciones BD</td><td>UHN SickKids FC. Para la clasificación de celdas.</td></tr><tr><td>Células estromales mesechimales de la médula ósea</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td>BMSCs</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030-100G</td><td>BSA. Para preparar soluciones para ICC</td></tr><tr><td>BrdU</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB3424</td><td>Precaución: BrdU es un teratógeno fuerte y se sospecha que es mutágeno. Asegúrese de recibir la capacitación adecuada y consulte la SDS antes de usar.</td></tr><tr><td>Instalación Canto II</td><td>BD</td><td></td><td>UHN SickKids FC. Para citometría de flujo.</td></tr><tr><td>ADNc EcoDry Premix</td><td>Clontech/Takara</td><td>639570</td><td>Para la preparación de ADNc para qPCR</td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA Dye</td><td>Life Technologies</td><td>C7025</td><td>Imágenes fluorescentes de citoplasma celular</td></tr><tr><td>Contador de células automatizado Countess</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>C10227</td><td>Para recuento celular</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6421</td><td>Para medio de cultivo de cardiomiocitos primarios de rata.</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>D-PBS de Dulbecco, sin Ca2+, Mg2+</td></tr><tr><td>EVOS</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Microscopio fluorescente propio</td></tr><tr><td>FACSCalibur</td><td>BD</td><td></td><td>Interno. Para citometría de flujo.</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (Hyclone)</td><td>GE Healthcare SH3039603</td><td></td><td>FBS. Componente del medio de cultivo celular.</td></tr><tr><td>Sondas IDT Prime Time qPCR</td><td>Tecnologías de datos integradas</td><td>FAM fluoróforo http://www.idtdna.com/pages/products/gene-expression/primetime-qpcr-assays-and-primers</td><td></td></tr><tr><td>Lab Vision PermaFluor Medio de montaje acuoso</td><td>ThermoScientific</td><td>TA-030-FM</td><td>Para el almacenamiento de células para someter a ICC</td></tr><tr><td>LSR II&nbsp;</td><td></td><td>Instalaciones BD</td><td>UHN SickKids FC. Para citometría de flujo.</td></tr><tr><td>Instalaciones de MoFlo Astrios</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>UHN SickKids FC. Para la clasificación de celdas.</td></tr><tr><td>Suero de cabra normal</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>5425S</td><td>NGS. Se utiliza en la solución de bloqueo para ICC</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Chamber Coverglass, 8 pocillos</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>155409</td><td>Para preparar muestras para ICC</td></tr><tr><td>OmniPur Triton X-100 Surfactant</td><td>EMD Millipore</td><td>9410-OP</td><td>Como componente de la solución permeable cuando se preparan células para ICC</td></tr><tr><td>Paraformaldehído, solución al 16%, EM Grade</td><td>Electrónica Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Para la fijación de células para ICC.</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Componente del medio de cultivo celular.</td></tr><tr><td>Imprimaciones</td><td>Sigma</td><td>Custom Standard DNA Oligos, Desalado, 0.2 &mu; mol</td><td><fuerte>CTnT_F:</fuerte> GGC AGC GGA AGA GGA TGC TGA A; <fuerte>CTnT_R:</fuerte> GAG GCA CCA AGT TGG GCA TGA ACG A; <fuerte>MYH6 F:</fuerte> GCA AAG TAC TGG ATG ACA CGC T; <fuerte>MYH6 R:</fuerte> GTC ATT GCT GAA ACC GAG AAT G</td></tr><tr><td>Disco giratorio de quórum Confocal</td><td>Zeiss</td><td></td><td>SickKids Instalación de imágenes</td></tr><tr><td>ReproCardio Cardiomiocitos derivados de células hiPS</td><td>ReproCell</td><td>RCD001N</td><td>Control positivo para qPCR</td></tr><tr><td>RNeasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>Para aislar ARN para qPCR</td></tr><tr><td>Rotor-Gene SYBR Green PCR Kit</td><td>Qiagen</td><td>204074</td><td>Para qPCR con mezcla maestra</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>A1049101</td><td>Para MSC, medio de cocultivo de monocitos.</td></tr><tr><td>Ensayos de cebadores TaqMan qPCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4444556</td><td>Para qPCR</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td>Tinción de células para viabilidad y recuento</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>272500108</td><td>Para la disociación celular</td></tr><tr><td>Volocity</td><td>Perkin-Elmer</td><td>Volocity 6.3</td><td>Software de imagen</td></tr><tr><td>0.2 &mu; Filtro de poros</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>566-0020</td><td>Para la esterilización de medios de cultivo</td></tr><tr><td>de tejidos HERAcell 150i CO2 Incubadora</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51026410</td><td>Para incubar células</td></tr><tr><td>Salina tamponada con fosfato de Dulbecco</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>PBS. 1X, Sin cloruro de calcio y cloruro de magnesio</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Almedic</td><td>7727- A10-704</td><td>Para entregar corazón de rata. Puede usar cualquier pinza similar.</td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>Fine Science Tools</td><td>14059-11</td><td>Para picar corazón de rata. Se recomiendan tijeras curvas.</td></tr><tr><td>Tubo de 50 mL</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>Para la recolección durante la recolección de cardiomiocitos y los procedimientos generales de cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>Tubo de 15 mL</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>Para procedimientos generales de cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>Placas de 6 pocillos</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>CA73520-906</td><td>Para cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos de 10 cm</td><td>Corning</td><td>25382-428</td><td>Para la formación de agregados</td></tr><tr><td>Microscopio Axiovert 40C</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Para la obtención de imágenes de campo claro a través del cultivo de tejidos y el resto del protocolo</td></tr><tr><td>70 &mu; filtro de células m</td><td>Fisherbrand</td><td>22363548</td><td>Para garantizar una suspensión de una sola célula antes de la citometría de flujo o la clasificación</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>EMD Millipore</td><td>9410-1L</td><td>Se utiliza en la solución de permeabilización para ICC</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H1399</td><td>Tinción utilizada durante la visualización de la localización de Cx43</td></tr></tbody></table>

in vitro diferenciación de células madre mesenquimales humanas en células funcionales en cardiomiocitos

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Infarto de miocardio y la posterior cascada isquémica como resultado la pérdida extensa de cardiomiocitos, llevando a insuficiencia cardíaca congestiva, la principal causa de mortalidad en todo el mundo. Las células madre mesenquimales (MSCs) son una opción prometedora para las terapias basadas en células reemplazar las actuales técnicas invasivas. MSCs pueden diferenciarse en linajes mesenquimales, incluyendo tipos de la célula cardiaca, pero completa diferenciación en células funcionales todavía no se ha logrado. Anteriores métodos de diferenciación se basan en agentes farmacológicos o factores de crecimiento. Sin embargo, estrategias más fisiológico relevantes también pueden habilitar MSCs a sufrir una transformación cardiomiogenético. Aquí, presentamos un método de diferenciación utilizando agregados MSC en capas de alimentador de cardiomiocitos para producir células contratantes cardiomiocitos.
Células perivasculares de cordón umbilical humano (HUCPVCs) se ha demostrado que tiene una diferenciación mayor que comúnmente investigados tipos de MSC, como médula ósea MSCs (BMSCs). Como una fuente más joven ontogeneticamente, investigamos el potencial de cardiomiogenético de HUCPVCs de (FTM) durante el primer trimestre en comparación con las más viejas fuentes. HUCPVCs FTM son una novela, rica fuente de MSCs que conservan sus útero immunoprivileged propiedades cuando cultivadas en vitro. Utilizando este protocolo de diferenciación, FTM y término HUCPVCs logrado cardiomiogenético perceptiblemente creciente diferenciación en comparación con BMSCs, tal como se indica por el aumento de la expresión de marcadores de cardiomiocitos (es decir, el factor del miocito enhancer 2 C, troponina T, cardiaca miosina de cadena pesada, señal regulador de la proteína α y conexina 43). También mantuvieron significativamente menor inmunogenicidad, como quedó demostrado por su menor expresión de HLA-A y la más alta expresión de HLA-G. Aplicación de diferenciación basada en el agregado, HUCPVCs FTM demostró formación agregada creciente potencial y genera contratación racimos de células dentro de 1 semana de co-cultivo en capas cardiacas alimentador, convirtiéndose en el primer tipo MSC para hacerlo.
Nuestros resultados demuestran que esta estrategia de diferenciación efectiva puede aprovechar el potencial de cardiomiogenético de MSCs joven, como HUCPVCs de FTM y sugiere que en vitro la diferenciación previa podría ser una estrategia potencial para aumentar su eficacia regenerativa en vivo.

Las HUCPVC presentan un potencial mayor de formación de agregados y niveles de expresión de CD49f en comparación con las BMSC:
Para inducir la diferenciación de las hMSCs (es decir, FTM HUCPVCs, HUCPVCs del término y CMMO), suspensiones individuales de CMM no diferenciadas o gotas colgantes que contienen CMMTabla 1) se transfirieron a monocapas de cardiomiocitos primarios de rata para e...

Aquí, presentamos un método para aprovechar eficientemente el potencial de diferenciación cardiaca de jóvenes fuentes de células madre mesenquimales humanas con el fin de generar las células funcionales, contratantes, cardiomiocitos-como en vitro.

In Vitro Diferenciación de células madre mesenquimales humanas en células funcionales en cardiomiocitos

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

El objetivo general de este procedimiento experimental es inducir y observar la inducción cardiomiogénica de células madre mesenquimales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las células madre mesenquimales, como por ejemplo, qué remedios pueden ser inducidos mediante señales ambientales para generar cardiomiocitos funcionales. La principal ventaja de esta técnica es que aplica la formación de agregados y capas cardíacas fetales, en lugar de agentes farmacológicos o material genético.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de enfermedades cardiovasculares porque profundiza en el potencial cardiomiogénico de las células madre mesenquimales. Demostrando este procedimiento conmigo estará la señorita Farwah Iqbal, estudiante de doctorado de nuestro laboratorio, así como Max Librach y Nadav Gasner, ambos becarios de nuestro laboratorio. Después de aislar las partes de las crías de rata según el protocolo descrito, corte los ventrículos por la mitad y transfiéralos a una placa de 10 centímetros con 10 mililitros de PBS y coloque sobre hielo, para permitir que se lave la sangre.Luego, utilizando tijeras curvas, corte las paredes ventriculares en pequeños trozos con un diámetro de dos a tres milímetros. Con una pipeta serológica, transfiera los trozos de corazón de 10 a 12 animales a un tubo de 50 mililitros y déjelos sedimentar. Retire la mayor cantidad posible de PBS P/S, sin eliminar ningún trozo de corazón.Luego, agregue 10 milímetros de PBS P/S fresco. Para aislar los cardiomiocitos, después de que los trozos de corazón se sedimenten, use tripsina al 0,15 % en PBS para reemplazar el PBS P/S e incube el tejido a 37 grados Celsius con agitación durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante.A continuación, repita la digestión con tripsina otras tres veces, pero vierta los sobrenadantes en tubos de recolección de 50 mililitros que contengan 10 mililitros de FBS al 100%. A continuación, centrifugue los tubos con las células y aspire el sobrenadante. Luego, use DMEM-F12 con FBS al 10 % y P/S al 1 % para resuspender las células y siembrelas en una placa de seis pocillos.Una vez que las células se hayan adherido, reemplace el medio con dos mililitros de medio fresco. Para preparar MSC premarcadas, retire el medio de los cultivos de MSC que hayan alcanzado una confluencia del 70 % al 80 % en placas de 10 centímetros y agregue tres mililitros de solución de disociación celular. Incube las placas a 37 °C y 5 % de CO₂ durante cinco minutos.Transfiera las células disociadas a un tubo de 15 mililitros y centrifugue a 400 x G durante cinco minutos. Aspire el sobrenadante sin perturbar el botón celular y re-suspenda las células. Luego, utilice un contador automático de células para contarlas.Diluya las células hasta una concentración de 1 x 10⁶ MSC por mililitro, en DMEM-F12 que contenga 10 % de FBS y 1 % de P/S. Luego, agregue a las células en tubos cónicos de 1,5 mililitros un colorante fluorescente viable y no transmisible, e incube los MSC durante media hora. Tras centrifugar los tubos a 400 × g durante cinco minutos, aspire el sobrenadante y re-suspenda el sedimento a una concentración de 1 x 10⁶ MSC por mililitro.Luego, transfiera las MSC a los cardiomiocitos a una concentración de 10 x 10 a la cuarta células por pocillo de una placa de seis pocillos. Para obtener cultivos coagregados, prepare una suspensión simple de MSC en MEM alfa, suplementado con 10% de FBS y 1% de P/S. Inicie la formación de agregados colocando gotas de 25 microlitros de la suspensión celular sobre la superficie interna de las tapas de placas de cultivo tisular de 10 centímetros.Coloque las tapas sobre sus contrapartes inferiores que contienen PBS P/S. Incube las placas a 37 grados centígrados y 5 % de dióxido de carbono. Bajo un microscopio estereoscópico, observe la formación de agregados en las gotas después de tres días.Si más del 80 % de las gotas contenían agregados formados, utilice una micropipeta de un mililitro para recoger las gotas de las tapas y transfiera los agregados directamente a monocapas primarias de cardiomiocitos de rata. Incube los cultivos co-cultivados con agregados hasta por dos semanas, cambiando el volumen completo del medio cada 72 horas.Diariamente, utilice microscopía de campo brillante para observar los agregados que se adhieren a las capas celulares fetales. Registre los agregados contráctiles cuando se observen. Los agregados activos se contraen de manera sincronizada, lo que sugiere una conductancia entre ellos a través de toda la capa fetal, la cual no presenta actividad física.Aspire el medio y agregue dos mililitros de PBS por pocillo del plato de seis pocillos. Luego elimine el PBS y agregue dos mililitros de solución de disociación por pocillo. Incube los platos a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono durante tres minutos.Como se muestra aquí, los HMSc de tres tipos diferentes mostraron una abundancia y apariencia similares en cultivos co-cultivos directos. Dos o tres días después de transferir las gotas colgantes sobre células cardíacas en cultivos co-culturales en agregados, los FTM y los PBC huck del término aparecieron en agregados más grandes en comparación con los observados a partir de los BMSc. En este experimento, el análisis citométrico de flujo de la expresión de CD49F en MSCs indiferenciadas mostró que el 96 % de los PBC huck de FTM, el 89 % de los PBC huck y el 53 % de los BMSc resultaron positivos para la superficie celular CD49F.La citometría de flujo en células TRA ganadoras 85 mostró la regulación positiva del marcador asociado a cardiomiocitos, SIRPA, en PBCs huck FTM y PBCs huck a término, pero no en BMSCs procedentes de co-cultivos directos con cardiomiocitos. Como se observa aquí, la regulación positiva de cx43 fue significativamente mayor en PBCs huck FTM en comparación con PBCs huck a término o BMSCs en co-cultivos directos. El análisis mediante microscopía fluorescente reveló que tanto las PBCs huck FTM como las PBCs huck a término en diferenciación regulan positivamente cx43.Con PBC de huck a término en una proporción mayor que los FTM. Sin embargo, la microscopía de fluorescencia reveló que las púntas positivas para cx43 se observaron en la membrana celular de los PBC de huck FTM y que predominantemente eran citoplasmáticas en las células a término. Finalmente, como se observa aquí, se realizó microscopía de fluorescencia de alto aumento en células humanas clasificadas, tras el cultivo conjunto, y se confirmó la alta abundancia de cx43 en la membrana plasmática.Una vez dominados, los pasos clave de este procedimiento pueden realizarse en una hora cada uno, si se llevan a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante mantener precauciones asépticas. Los tejidos animales primarios implicados pueden introducir contaminación si no se manipulan adecuadamente.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el cultivo adicional de agregados contráctiles, para responder preguntas complementarias, como la longevidad de estas estructuras. Una vez desarrollada, esta técnica permite a los investigadores en el campo de las CMM explorar el potencial de diferenciación de fuentes más jóvenes de células madre mesenquimales, tales como los tejidos extraembrionarios. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar agregados de CMM y combinarlos con capas tisulares fetales primarias directas, de una manera que proporcione una inducción adecuada para la diferenciación cardiomiogénica.No olvide que trabajar con BRDU puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones, como el manejo adecuado de desechos citotóxicos, durante la realización de este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este vídeo demuestra cómo llevar a cabo en la diferenciación in vitro de células madre embrionarias de ratón a cuerpos embrioides utilizando el método de gota.

En la diferenciación in vitro de la madre embrionarias de ratón (MES), las células con el método de gota

Hemos establecido un protocolo para la inducción de cardioblastos directa de pluripotentes células madre embrionarias humanas mantenidas en condiciones definidas con pequeñas moléculas, lo que permite la derivación de una gran cantidad de células progenitoras cardiacas humanas y funcionales cardiovasculares cardiomiocitos para su reparación.

Derivación eficiente de los Derechos Humanos precursores cardiacos y cardiomiocitos de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

Las células madre pluripotentes, cualquiera de las células madre pluripotentes embrionarias o inducidas (iPS), constituyen una valiosa fuente de células diferenciadas humanas, incluyendo cardiomiocitos. Aquí, nos centraremos en la inducción cardiaca de las células iPS, que muestra cómo usarlos para obtener cardiomiocitos humanos funcionales a través de un protocolo de los organismos con sede en embrioide.

La generación de cardiomiocitos humanos: Protocolo de diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas Feeder libres

El artículo describe la metodología detallada para diferenciar eficazmente células madre pluripotentes humanas en cardiomiocitos mediante la modulación de la vía Wnt selectivamente, seguido por citometría de flujo análisis de marcadores de referencia para evaluar la homogeneidad e identidad de la población.

Alta Eficiencia Diferenciación de células madre pluripotentes humanas a cardiomiocitos y Caracterización por citometría de flujo

En este protocolo, se ilustrará la derivación de células progenitoras cardíacas a partir de células madre embrionarias de ratón y humanas. Una estrategia importante en este protocolo es enriquecer las células progenitoras cardíacas con citometría de flujo utilizando reporteros fluorescentes diseñados en las líneas de células madre embrionarias.

Derivación de células cardiacas progenitoras a partir de células madre embrionarias

Aquí, describimos un protocolo robusto para la derivación de cardiomiocitos humanos que combina la diferenciación cardíaca modulada por moléculas pequeñas y la purificación de cardiomiocitos mediada por privación de glucosa, lo que permite la producción de cardiomiocitos purificados para fines de modelado de enfermedades cardiovasculares y detección de fármacos.

Derivación de cardiomiocitos altamente purificada de células madre humanas pluripotentes inducidas Uso Pequeño Diferenciación molécula modulada y posterior glucosa inanición

Este manuscrito describe la creación de tejidos cardíacos de ingeniería definidos utilizando la expresión de marcadores de superficie y la clasificación de células. Los tejidos definidos se pueden utilizar en un biorreactor multitejido para investigar los mecanismos de la terapia celular cardíaca con el fin de proporcionar un sistema modelo funcional, pero controlado, del corazón humano.

Construcción de Engineered Definido Humanos cardíacos tejidos para estudiar los mecanismos de la terapia celular cardiaca

La generación de cardiomiocitos a partir de células madre pluripotentes in vitro permite el acceso a grandes cantidades de tejido cardíaco in vitro para aplicaciones clínicas y de ciencia básica.  Este protocolo utiliza el factor atrializante Grem2 tanto para aumentar el número de cardiomiocitos obtenidos como para generar cardiomiocitos con un fenotipo auricular.

La diferenciación de los cardiomiocitos auricular partir de células madre pluripotentes Uso del antagonista de BMP Grem2

La caracterización electrofisiológica de los cardiomiocitos derivados de las células madre pluripotentes humanas (hPSC-CMs) es crucial para el modelado de la enfermedad cardiaca y para la determinación de las respuestas de los fármacos. Este protocolo proporciona la información necesaria para disociar y planificar hPSC-CM en arrays de múltiples electrodos, medir su potencial de campo, y un método para analizar intervalos QT y RR.

Análisis Electrofisiológico de Cardiomiocitos Pluripotentes Humanos Pluripotentes (hPSC-CMs) Usando Matrices Multi-Electrodo (MEAs)

Aquí describimos y validamos un método para generar consistentemente cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos robustos y caracterizar su función. Estas técnicas pueden ayudar a desarrollar información mecanicista sobre las vías de señalización, proporcionar una plataforma para la detección de drogas a gran escala y modelar de forma fiable las enfermedades cardíacas.

Generación de cardiomiocitos derivados de HiPSC ventricular y preparaciones celulares de alta calidad para la caracterización del manejo del calcio

Aquí, presentamos un protocolo para generar y expandir de manera robusta los cardiomiocitos humanos a partir de células mononucleares de sangre periférica del paciente.

Generación y expansión de cardiomiocitos humanos a partir de células mononucleares de sangre periférica de pacientes

Aprende a diferenciar células madre mesenquimales humanas en cardiomiocitos funcionales mediante señales ambientales y formación de agregados. Este método ofrece una alternativa sin agentes farmacológicos para terapias cardiovasculares.

In Vitro Diferenciación de células madre mesenquimales humanas en células funcionales en cardiomiocitos

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