In Vitro Diferenciación de células madre mesenquimales humanas en células funcionales en cardiomiocitos

El objetivo general de este procedimiento experimental es inducir y observar la inducción cardiomiogénica de células madre mesenquimales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las células madre mesenquimales, como por ejemplo, qué remedios pueden ser inducidos por señales ambientales para generar cardiomiocitos funcionales. La principal ventaja de esta técnica, es que aplica formación de agregados y capas fetales cardíacas, en lugar de agentes farmacológicos o material genético.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de las enfermedades cardiovasculares, ya que profundiza en el potencial cardiomiogénico de las células madre mesenquimales. Demostrando este procedimiento conmigo estarán la señorita Farwah Iqbal, estudiante de doctorado de nuestro laboratorio, Max Librach y Nadav Gasner, ambos aprendices de nuestro laboratorio. Después de aislar las partes de los cachorros de rata de acuerdo con el protocolo de texto, corte los ventrículos por la mitad y transfiéralos a un plato de 10 centímetros con 10 mililitros de PBS y raya diplomática en hielo, para permitir que la sangre se lave.

Luego, con unas tijeras curvas, corte las paredes ventriculares en trozos pequeños con un diámetro de dos a tres milímetros. Con una pipeta serológica, transfiera las piezas de corazón de 10 a 12 animales a un tubo de 50 mililitros y deje que se asienten. Retire la mayor cantidad posible de PBS P/S, sin quitar ninguna pieza de corazón.

A continuación, añada 10 milímetros de PBS P/S fresco. Para aislar los cardiomiocitos, después de que las piezas del corazón se asienten, use tripsina al 0,15% en PBS, para reemplazar el PBS P / S e incubar el tejido a 37 grados centígrados con agitación, durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante.

Luego, repita la digestión de tripsina tres veces más, excepto, los sobrenadantes del decantador en tubos de recolección de 50 mililitros que contengan 10 mililitros de 100% FBS. A continuación, centrifuga los tubos de las células y aspira el sobrenadante. A continuación, utilice DMEM-F12 con 10% de FBS y 1% de P/S para resuspender las células y sembrarlas en una placa de seis pocillos.

Una vez que las células se hayan unido, reemplace el medio con dos mililitros de medio fresco. Para preparar MSC previamente teñidas, retire el medio de los cultivos de MSC que hayan alcanzado una confluencia del 70% al 80% en platos de 10 centímetros y agregue tres mililitros de solución de disociación celular. Incubar los platos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante cinco minutos.

Transfiera las celdas disociadas a un tubo de 15 mililitros y centrifugue a 400 x G durante cinco minutos. Aspire el sobrenadante sin interrumpir el gránulo celular y vuelva a suspender las células. A continuación, utilice un contador de células automatizado para contar las células.

Diluir las células a una concentración de 1 x 10 a la sexta MSC por mililitro, en DMEM-F12 que contenga 10% de FBS y 1% de P/S. A continuación, a las células en tubos de centrífuga de 1,5 mililitros, se añade un colorante fluorescente viable e intransferible y se incuban las MSC durante media hora. Después de centrifugar los tubos a 400 x G durante cinco minutos, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet a una concentración de 1 x 10 a la sexta MSC por mililitro.

A continuación, transfiera las MSC a los cardiomiocitos a una concentración de 10 x 10 a la cuarta célula por pocillo de la placa de seis pocillos. Para hacer cocultivos de agregados, prepare una suspensión de MSCs de una sola célula en alfa MEM, suplementada con un 10% de FBS y un 1% de P/S. Inicie la formación de agregados, colocando 25 gotas de microlitros de suspensión celular en la superficie interna de las tapas de las placas de cultivo de tejidos de 10 centímetros.

Coloque las tapas en sus contrapartes inferiores que contengan PBS P / S. Incube los platos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Bajo un microscopio estereoscópico, observe la formación de agregados en las gotas después de tres días.

Si más del 80% de las gotas contienen agregados formados, utilice una micropipeta de un mililitro para recoger las gotas de los párpados y transferir los agregados directamente a las monocapas primarias de cardiomiocitos de rata. Incubar los cocultivos agregados durante un máximo de dos semanas. Cambiar el volumen completo del medio cada 72 horas.

A diario, utilice la microscopía de campo claro para observar los agregados que se adhieren a las capas de células fetales. Registre los agregados de contratación cuando se observen. Los agregados activos se contraen de forma sincronizada, sugerimos una conductancia entre ellos a lo largo de la capa fetal, que no tiene actividad física.

Aspire el medio y agregue dos mililitros de PBS por pocillo del plato de seis pocillos. A continuación, retire el PBS y añada dos mililitros de solución de disociación por pocillo. Incubar los platos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante tres minutos.

Como se muestra aquí, las HMSC de tres tipos diferentes mostraron una abundancia y apariencia similares en los cocultivos directos. Dos o tres días después de transferir las gotas colgantes a las células cardíacas en cocultivos agregados, las FTM y las PBC de término huck aparecieron en agregados más grandes en comparación con las observadas en las BMSC. En este experimento, el análisis de citometría de flujo de la expresión de CD49F en MSCs indiferenciadas mostró que el 96% de las PBC de FTM huck, denominadas 89% de las PBC de huck y 53% de las BMSC, fueron positivas para CD49F de superficie celular.

La citometría de flujo en TRA ganó 85 células, mostró la regulación positiva del marcador asociado a cardiomiocitos, SIRPA en las PBC FTM huck y PBC huck a término, pero no en las BMSC de cocultivos directos de cardiomiocitos. Como se ve aquí, la regulación positiva de cx43 fue significativamente mayor en las PBC FTM huck en comparación con las PBC huck o BMSC a término en cocultivos directos. El análisis de microscopía fluorescente reveló que la diferenciación de FTM y PBC de término, ambas reguladas al alza cx43.

Con PBC a término huck en una proporción más alta que FTM. Sin embargo, la microscopía de fluorescencia reveló que se observaron puntos positivos para cx43 en la membrana celular de las PBC FTM huck y que eran predominantemente citoplasmáticos en las células a término. Finalmente, como se ve aquí, se realizó microscopía de fluorescencia de alto aumento en células humanas seleccionadas, después del co-cultivo y se confirmó la alta abundancia de cx43 en la membrana plasmática.

Una vez dominados, los pasos clave de este procedimiento se pueden realizar en una hora cada uno, si se realizan correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante mantener precauciones asépticas. Tejidos animales primarios implicados que pueden introducir contaminación, si no se manipulan adecuadamente.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el cultivo adicional de agregados en contracción, para responder preguntas adicionales, como la longevidad de estas estructuras. Después de su desarrollo, esta técnica permite a los investigadores en el campo de las MSC explorar el potencial de diferenciación de fuentes más jóvenes de células madre mesenquimales, como los tejidos extraembrionarios. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar agregados de MSC y combinarlos con capas fetales de tejido primario directo, de una manera que proporcione una inducción adecuada para la diferenciación cardiomiogénica.

No olvide que trabajar con BRDU puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el manejo adecuado de los desechos citotóxicos al realizar este procedimiento.