Name: In-vitro- Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen in funktionellen Cardiomyocyte-ähnlichen Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Erfahren Sie die kardiomyogene Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen durch Umweltsignale und Aggregatbildung. Diese Methode nutzt fetale Herzzellschichten statt pharmakologischer oder genetischer Ansätze.

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Die Autoren danken den folgenden Mitarbeiter und Forschung Personal für ihre Beiträge: Matthew Librach, Leila Maghen, Tanya A. Baretto, Shlomit Kenigsberg und Andrée Gauthier-Fisher. Diese Arbeit wurde von der Ontario Research Fund - Research Excellence (ORF-RE, Runde #7) und erstellen Programm Inc. unterstützt.

Alle Studien mit Tieren wurden gemäß den ANARRIVE-Richtlinien durchgeführt und berichtet48. Alle Studien wurden mit Genehmigung des institutionellen Forschungsethikrats durchgeführt (REB-Nummer 454-2011, Sunnybrook Research Institute; REB 29889, Universität Toronto, Toronto, Kanada). Alle Tierverfahren wurden vom Animal Care Committee des University Health Network (Toronto, Kanada) genehmigt, und alle Tiere erhielten eine humane Pflege in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren, 8. Auflage (National Institutes of Health 2011).
1. Gewebekultur
<ol>
	<li>Kultur FTM HUCPVCs, Begriff HUCPVCs (zuvor etabliert, n ≥ jeweils 3 unabhängigen Linien)42 und kommerziell erhältliche BMSCs in Alpha-Minimum Essential Medium (MEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und einem 1 % Penicillin/Streptomycin (P/S) Cocktail. Kultur von primären Kardiomyozyten und MSC-Kardiomyozyten-Cokulturen der Ratte in Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nährstoffmischung F-12 (DMEM-F12) mit 10 % FBS und 1 % P/S. 
	HINWEIS: Sterilisieren Sie das Medium mit einem 0,2-μm-Filter. Vorbereitete mittelgroße Lösungen bis zu 3 Wochen bei 4 °C lagern.</li>
	<li>Bewahren Sie Zellkulturen in befeuchteten Inkubatoren (95 % relative Luftfeuchtigkeit, 37 °C und 5 % CO2) und Passage bei 70-80 % Konfluenz auf, bestimmt durch Phasenkontrastmikroskopie. Verwenden Sie geeignete Volumina des Mediums für die Größe der verwendeten Gewebekulturschale (z. B. 10 ml in einer 10-cm-Schale und 2 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Gewebekulturplatte). Verwenden Sie diese Kulturbedingungen für die Dauer des Protokolls.</li>
	<li>MSC-Monolayer für die Passage oder MSC-Kardiomyozyten-Cokultur-Etablierung mit einer Dissoziationsenzymlösung (2 ml/Well in einer 6-Well-Platte) dissoziieren und 4 min bei 37 °C inkubieren.</li>
	<li>Die dissoziierten Zellen werden in ein 15-ml-Röhrchen umgefüllt und 5 Minuten lang bei 400 x g zentrifugiert.</li>
	<li>Aspirieren Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören, und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml eines Kulturmediums, das für die Zählung mit einem automatisierten Zellzähler geeignet ist. Führen Sie ein Seeding für die Zellen aus, wie in den folgenden Protokollabschnitten beschrieben.</li>
</ol>
2. Vorbereitung von primären Kardiomyozyten-MSC-Cokulturen der Ratte
<ol>
	<li>Entnahme von Herzgewebe für die Isolierung von primären Kardiomyozyten.
	<ol>
		<li>Euthanasieren Sie Rattenwelpen (5-6 Tage nach der Geburt) mit CO2 -Erstickung. Stellen Sie die CO2 -Kammern auf 20 % Gasaustausch ein (Durchflussmenge = 0,2 x Kammervolumen pro min). Bestätigen Sie den Exitus durch das Fehlen des Einklemmreflexes.</li>
		<li>Entfernen Sie die Vorhöfe mit den verbindenden großen Blutgefäßen mit sterilisierten Instrumenten (z. B. Pinzetten und gebogenen Scheren)41. Übertragen Sie die Herzen in 50-ml-Röhrchen mit sterilem PBS mit 1 % P/S (PBS-P/S) auf Eis.</li>
		<li>Die Ventrikuli halbieren und das Blut in einer 10-cm-Schale mit 10 mL PBS-P/S auf Eis ausspülen lassen. Schneiden Sie die Ventrikelwände mit einer gebogenen Schere in kleine Stücke (Durchmesser = 2-3 mm).</li>
		<li>Übertragen Sie die Herzstücke von 10-12 Tieren mit einer serologischen Pipette in ein 50-ml-Röhrchen und lassen Sie sie sich absetzen.</li>
		<li>Entfernen Sie so viel PBS-P/S wie möglich, ohne Herzstücke zu entfernen. Fügen Sie 10 mL neues PBS-P/S hinzu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Verdauen Sie das Herzgewebe, um die Kardiomyozyten zu isolieren.
	<ol>
		<li>Lassen Sie die Herzstücke ruhen. Ersetzen Sie das PBS-P/S durch 10 mL 0,15% Trypsin in PBS und schütteln Sie es 10 Minuten lang bei 37 °C.</li>
		<li>Entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie den in Schritt 2.2.1 beschriebenen Aufschluss noch dreimal, aber dekantieren Sie die Überstände in 50-ml-Sammelröhrchen mit 10 ml 100 % FBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Die Zellen zentrifugieren (400 x g, 5 min) und den Überstand ansaugen. Resuspendieren Sie die Zellen in DMEM-F12 mit 10 % FBS und 1 % P/S und säen Sie sie auf eine 6-Well-Platte (1 x 10,5 Zellen/cm2, 2 ml Medium pro Well).</li>
	<li>Nach 1 Stunde wird das Medium mit den nicht anhaftenden Zellen in ein 50-ml-Röhrchen umgefüllt und die angehängten Zellen verworfen. Zählen Sie die Zellen in Suspension und plattieren Sie sie wieder in neue 6-Well-Platten (1 x 105 Zellen/cm2, 2 mL DMEM-F12 mit 10 % FBS und 1 % P/S pro Well).</li>
	<li>Hemmung der Zellproliferation mit Bromodeoxyuridin (BrdU). 
	Achtung: BrdU ist ein starkes Teratogen und steht im Verdacht, mutagen zu sein. Bitte stellen Sie sicher, dass eine angemessene Schulung durchgeführt wird, und lesen Sie vor der Verwendung das Sicherheitsdatenblatt.
	<ol>
		<li>Sobald sich die Zellen anheften, ersetzen Sie das Medium in der 6-Well-Platte durch DMEM-F12, das 10 % FBS, 1 % P/S (2 mL Medium pro Well) und 5 μM BrdU enthält. 16 h (37 °C, 5 % CO2) inkubieren.</li>
		<li>Entfernen Sie das BrdU-haltige Medium und ersetzen Sie es durch DMEM-F12 mit 10 % FBS und 1 % P/S (2 ml Medium pro Well).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bereiten Sie vorgefärbte MSCs vor.
	<ol>
		<li>Sobald die MSC-Kulturen in 10-cm-Schalen eine Konfluenz von 70-80 % erreicht haben, entfernen Sie das Kulturmedium und fügen Sie 3 ml Zelldissoziationslösung hinzu. Das Gericht bei 37 °C und 5 % CO2 5 min inkubieren.</li>
		<li>Die dissoziierten Zellen werden in ein 15-ml-Röhrchen umgefüllt und 5 Minuten lang bei 400 x g zentrifugiert.</li>
		<li>Aspirieren Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören, und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml DMEM-F12, das 10 % FBS und 1 % P/S enthält, zur Zählung mit einem automatisierten Zellzähler.</li>
		<li>Verdünnen Sie die Zellen auf eine Konzentration von 1 x 106 MSC/ml DMEM-F12 mit 10 % FBS und 1 % P/S.</li>
		<li>Inkubieren Sie die MSCs mit lebensfähigem, nicht übertragbarem Fluoreszenzfarbstoff (5 μM, 30 min, 37 °C, 5 % CO2) in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen für 1 h.</li>
		<li>Die Röhrchen werden 5 min lang bei 400 x g zentrifugiert. Der Überstand wird aspiriert und das Pellet in DMEM-F12 mit 10 % FBS und 1 % P/S für eine Zellkonzentration von 1 x 106 MSC/ml resuspendiert. Wiederholen Sie dies insgesamt 3 Mal.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Die MSC werden in einer Konzentration von 10 x 10 4 Zellen pro Vertiefung der 6-Well-Platte auf Kardiomyozyten (Schritt 2.5.2) übertragen.</li>
</ol>
3. Vorbereitung von Aggregat-Co-Kulturen
<ol>
	<li>Bereiten Sie eine einzellige Suspension von MSCs (2 x 104 Zellen/ml Medium, Passage # ≤ 6) in alpha-MEM vor, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % P/S (siehe Schritt 2.6). 
	HINWEIS: Siehe Abschnitt 1 des Protokolls für die Passage von Zellen. Alternativ können MSCs gemäß Schritt 2.6 vorgefärbt werden.</li>
	<li>Initiieren Sie die Aggregatbildung, indem Sie 25-μl-Tropfen der Zellsuspension (500 Zellen) auf die Innenfläche der Deckel von 10-cm-Gewebekulturschalen (bis zu 50 Tropfen pro Deckel) geben. Setzen Sie die Deckel auf die unteren Gegenstücke, die PBS-P/S enthalten. Inkubieren Sie bei 37 °C und 5 % CO2, 
	HINWEIS: Geben Sie 5-7 ml PBS-P/S in die Kulturschale unter den hängenden Tropfen, um eine Verdunstung der Tropfen zu vermeiden.</li>
	<li>Beobachten Sie die Aggregatbildung in den Tropfen nach 3 Tagen mit einem Stereomikroskop. Wenn mehr als 40 von 50 Tropfen gebildete Aggregate enthalten, die Tropfen mit einer 1-ml-Mikropipette von den Lidern auffangen und die Aggregate direkt auf primäre Kardiomyozyten-Monoschichten der Ratte übertragen (hergestellt in den Schritten 2.1-2.7; 10 Tropfen/Vertiefung). Vermeiden Sie heftiges Pipettieren, um die Integrität des Aggregats zu erhalten.</li>
	<li>Bewahren Sie aggregierte Co-Kulturen bis zu 2 Wochen in den Inkubatoren auf und wechseln Sie das gesamte Volumen des Mediums (2 ml DMEM-F12 mit 10 % FBS und 1 % P/S pro Vertiefung) alle 72 Stunden.
	<ol>
		<li>Beobachten Sie täglich Aggregate, die sich mit Hilfe der Hellfeldmikroskopie an den Feeder-Zellschichten anlagern. Erfassen Sie Vertragsaggregate, wenn sie beobachtet werden.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bereiten Sie Aggregate für die Analyse vor.
	<ol>
		<li>Entfernen Sie das Medium und fügen Sie 2 ml PBS pro Vertiefung einer 6-Well-Gewebekulturschale hinzu. Entfernen Sie das PBS und fügen Sie 2 ml Dissoziationslösung pro Vertiefung hinzu. 3 min bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 400 x g, um ein Zellpellet zu erhalten. Resuspendieren Sie in einem Medium, wie für die in den nachfolgenden Schritten beschriebenen Anwendungen (siehe Schritte 4.1, 5.1 und 6.1) und passieren Sie ein 70-μm-Zellsieb.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Durchflusszytometrie (FC) und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)
<ol>
	<li>Inkubieren Sie Zellsuspensionen (1 x 105 Zellen in 200 μl PBS mit 3 % FBS) mit Fluorophor-konjugierten (FITC oder APC) Primärantikörpern (d. h. CD49f, Cx43, TRA-1-85, HLA-A, HLA-G und SIRPA für FC oder TRA-1-85 für FACS; 1:40) bei 4 °C für 30 min und vor Licht geschützt.</li>
	<li>Zentrifugieren (400 x g, 5 min) und resuspendieren Sie die Zellen in 1 mL PBS mit 3 % FBS für FC oder PBS mit 0,5 % FBS für FACS. 
	HINWEIS: Der FC von MSCs wurde von Hong et al. optimiert.41.</li>
	<li>Halten Sie die Zellen im Dunkeln bei 4 °C, bis sie bereit sind, mit FC (mindestens 1 x 104 Ereignisse) oder FACS analysiert zu werden. Sortieren Sie die Zellen wie beschrieben41. Re-Plate von TRA-1-85 hoch-positiven sortierten Zellen in 6-Well-Platten (1 x 104 Zellen/Well, 2 mL DMEM-F12 mit 10 % FBS und 1 % P/S) innerhalb von 1 h. 
	HINWEIS: Für die Gating-Strategie des TRA-1-85 menschlichen Zelloberflächenantigens siehe die ergänzende Abbildung.</li>
</ol>
5. Immunzytochemie (ICC) und Mikroskopie
<ol>
	<li>Die aus den Co-Kulturen (Schritt 3.5.2) oder FACS (Abschnitt 4) gewonnenen Zellsuspensionen werden erneut auf Kammerobjektträger aufgebracht (1 x 104 Zellen/Well, 2 ml DMEM-F12 mit 10 % FBS und 1 % P/S pro Well). Lassen Sie die Zellen über Nacht in einem Gewebekultur-Inkubator anheften (siehe Abschnitt 1 für die Bedingungen).</li>
	<li>Fixieren Sie die Zellen mit 3 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie 3 Mal mit 3 ml PBS mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA; PBS-BSA) für 5 min pro Waschgang 
	Achtung: Tragen Sie beim Umgang mit PFA geeignete persönliche Schutzausrüstung.</li>
	<li>Permeabilisieren Sie die Zellen in 3 mL PBS-BSA mit 0,1% Triton X-100. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 10 Minuten für intrazelluläre Antigene (d. h. alpha-sarkomerisches Actinin (aSarc) und Cx43) oder 25 Minuten für intranukleäre Antigene (d. h. Mef2c und humanes nukleäres Antigen (HuNu)). 3 Mal mit 3 mL PBS-BSA für 5 min pro Waschgang waschen.</li>
	<li>Blockieren Sie die Proben gegen unspezifische Antikörperreaktionen mit 3 ml PBS, die 5 % normales Ziegenserum (NGS) und 1 % BSA enthalten, für 15 Minuten bei Raumtemperatur. 3 Mal mit 3 mL PBS-BSA für 5 min pro Waschgang waschen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen in den primären Antikörpern (d. h. Mef2c, aSarc, Cx43 und HuNu), verdünnt 1:200 in 3 ml PBS-BSA bei 4 °C über Nacht.</li>
	<li>3 x waschen mit 3 mL PBS-BSA für 5 min pro Waschgang und 30 min bei Raumtemperatur mit Sekundärantikörpern inkubieren. 3 Mal mit 3 mL PBS-BSA für 5 min pro Waschgang waschen.</li>
	<li>Lagern Sie die gefärbten Proben in 3 ml Einbettmedium.</li>
	<li>Nehmen Sie Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop auf. Verwenden Sie ein 10-faches Objektiv (NA = 0,3) und ein 20-faches Objektiv (NA = 0,45) für Aufnahmen mit geringerer Vergrößerung. Für die verwendeten Sekundärantikörper sind Fluoreszenzfilterwürfel und Wellenlängen für GFP (ex = 470/22 nm, em = 525/50 nm) und RFP (ex = 531/40 nm, em = 593/40 nm) zu verwenden (siehe Tabelle Materialien und Ausrüstung).</li>
	<li>Quantifizieren Sie Bilder mit Bildgebungssoftware (die empfohlene Software finden Sie in der Tabelle "Materialien und Ausrüstung"). Normalisieren Sie die Messwerte der Fluoreszenzintensität auf die Sekundärkontrollerfassungen.</li>
</ol>
6. RNA-Isolierung und quantitative RT-PCR
<ol>
	<li>Bereiten Sie RNA-Proben aus undifferenzierten MSC-Kulturen oder MSCs, die aus Co-Kulturen mit säulenbasierter RNA-Isolierung sortiert wurden, gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Bereiten Sie 1 x 104 bis 1 x 106 Zellen in 0,7 ml Zelllysepuffer (im Lieferumfang des RNA-Isolationskits enthalten) pro Probe vor.</li>
	<li>Bereiten Sie cDNA aus bis zu 2 μg RNA pro 100-μl-RT-Reaktion vor.</li>
	<li>Führen Sie die qPCR mit 10 ng cDNA pro Reaktion durch (40 Zyklen, 60 °C Glüh-/Verlängerungstemperatur).
	<ol>
		<li>Verwenden Sie Primer für humanes MY6H und cTnT in einer Konzentration von 500 nM und 1-100 ng cDNA pro Reaktion (siehe Material- und Ausrüstungstabelle). Verwenden Sie GAPDH, ACTB und HPRT als interne Normalisierer für die Haushaltsführung. Als Positivkontrolle werden kommerziell erhältliche human-induzierte pluripotente Stammzell-Kardiomyozyten verwendet. 
		HINWEIS: Drücken Sie die Faltungsänderung der Expression im Vergleich zu undifferenzierten MSC-abgeleiteten cDNA-Proben aus.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Dr. Clifford L. Librach ist Mitinhaber des Patents: Methoden der Isolation und der Verwendung von Zellen aus ersten Trimester Nabelschnur Gewebe, in Kanada und Australien gewährt.

Die kardialen Differenzierung von Stammzellen wird mit mehreren unterschiedlichen Strategien genutzt, um Cardiomyocyte-wie Zellen aus MSC Quellen erzeugen seit über 2 Jahrzehnten entwickelt. Viele dieser Strategien sind jedoch ineffizient und die Bedingungen sind oft nicht repräsentativ für die Umwelt transplantierten Zellen Begegnung in Vivo.
Im Gegensatz zu bestehenden Verfahren nutzt das Protokoll hier vorgestellten eine Kombination von primären kardiale Feeder Schichten und MSC Ag...

Herzinsuffizienz (CHF) bleibt als eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität weltweit. CHF tritt häufig nach den massiven Verlust von Kardiomyozyten und die Entwicklung der zellfreien Narbengewebe als pathologische Ergebnis ein Myokardinfarkt (MI)1. Während das Herz ein teilweise selbst erneuernde Organ ist, verringert sich residente Stamm- und Vorläuferzellen Zelle Pool verantwortlich für die Regeneration des Gewebes deutlich Ausführung in Hülle und Fülle und Funktion bei gealterten Patienten oft nicht ausreichend für optimale Erholung nach einer Verletzung zu. So gibt es großes Interesse an der Entwicklung von experimentellen Behandlungen, bei denen die Transplantation von gesunden Spenderzellen in den Geschädigten Myokard. Es ist zwingend notwendig, dass die Spenderzellen nicht nur die Struktur des Gewebes wiederherzustellen, sondern auch die funktionelle Wiederherstellung der betroffenen Myokard.
Die native Herz beschäftigt Herz Gewebe-Resident und endogenen Knochenmark stammen Stammzellen zur posttraumatischen reparieren2,3,4. Regenerative Zellen-Host und Spender abgeleitet gleichermaßen muss haben die Fähigkeit, die entsprechenden Phänotyp und Funktion in der Mikroumgebung umgestaltet Myokard, sowie die Fähigkeit, effizient und sicher die verlorenen Zellen ersetzen zu erhalten. In Vitro Differenzierung Methoden sind weitgehend benutzt, um eine hocheffiziente, stammzellbasierte Cardiomyocyte Produktion5,6zu erreichen. Expressionsprofil kardiale Linie Marker wird verwendet, um den Prozess der Stammzell-Differenzierung in der kardialen Linie7Richtung zu definieren. Frühe Differenzierung Marker wie NKX2.5, Myozyten Enhancer Faktor 2 C (Mef2c) und GATA48,9, kann einen Hinweis über die Einleitung des Cardiomyogenic Prozesses. Reife Cardiomyocyte Marker häufig verwendet, um Differenzierung Wirksamkeit zu beurteilen sind Signal regulatorischen Protein α (SIRPA)10, kardiale Troponin T (cTnT)11, schwere Kette kardialen Myosin (MYH6)8,12,13und Connexin 43 (Cx43)14,15,16. Die Methoden, die Verwendung von embryonalen Stammzellen (WSR) und pluripotenten Stammzellen (EAP) wurden sorgfältig optimiert und diskutiert über die Details der induktive Faktoren, Sauerstoff und Nährstoff Steigungen und der genaue Zeitpunkt der Aktion5,6,7,17,18. Dennoch präsentieren ESC und PSC-basierten Technologien noch mehrere Sicherheit und ethische Bedenken zusammen mit suboptimalen elektrophysiologische und immunologischen Funktionen19,20. Gastgeber, die oft mit diesen Zellen transplantiert erleben Immunorejection und erfordern ständige Immunsuppression. Dies ist vor allem auf großen Histocompatibility Komplexes (MHC) Moleküle in dem Host und dem Spender und der daraus resultierenden T-Zell Antwort21Fehlanpassungen. Während einzelne MHC Klasse I matching ist eine mögliche Lösung, eine zugänglichere klinische Praxis würde benötigen eine Zelle, die allgemein die Immunabwehr, die Sorge der Ablehnung zu überwinden ist.
Als alternative Zelle Quelle für den Einsatz in der klinischen Anwendung, MSCs und insbesondere BMSCs, wurden für den Einsatz in Geweberegeneration seit ihrer Erstbeschreibung im Jahr 199522untersucht. MSCs werden geglaubt, um Wohnsitz regenerativen Zellen, die in nahezu jedem vaskularisierte Gewebe23gesucht werden kann. Bei der Isolierung von der gewünschten Quelle MSCs können leicht erweitert werden, in der Kultur, haben umfangreiche parakrine Kapazität und oft besitzen Immunabwehr oder immunmodulatorische Eigenschaften24,25. Ihre Sicherheit und Wirksamkeit wurden bereits in mehreren präklinischen Studien, insbesondere zur kardialen Regeneration3,26gezeigt.
Viele MSC Differenzierungsstrategien nutzen pharmakologische Wirkstoffe, wie z. B. 5-Azacytidine22 und DMSO27, und Wachstum oder morphogenetische Faktoren wie BMPs5,7,28,29 oder Angiotensin-II30, mit Variablen Wirkungsgrad. Diese Strategien basieren jedoch nicht auf die Hindernisse, die eine naiven regenerative Zelle nach Homing oder an der Stelle der Verletzung auftreten dürfte in-vivo. Mehr physiologisch relevante Strategien zwar schwieriger zu definieren und zu manipulieren, basieren auf der Prämisse, dass MSC Differenzierung durch Signale aus dem Gewebe Mikroumgebung selbst induziert werden kann. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Exposition gegenüber der Herzmuskelzellen Lysates31 oder Linksventrikuläres Myokard32,33, oder direkt Kontakt mit primären Kardiomyozyten in-vitro-15,34, den Ausdruck der kardialen Marker im MSCs erhöhen kann. Andere zeigten spontane Cardiomyogenesis nach Behandlung von kardialen Verletzungen mit MSCs35,36,37,38, zwar einerseits die Verschmelzung von BMSCs und Herzzellen39,40 der im Entstehen begriffenen Myokard generiert. Nach unserem Kenntnisstand haben funktionelle, spontan Auftraggeber Herzzellen von menschlichen MSCs (hMSCs) von einer beliebigen Quelle Gewebe noch nicht gemeldet.
Der aktuelle Konsens ist, dass alle MSCs aus perivaskuläre Zellen23entstehen. Young-MSCs mit Pericyte Eigenschaften können aus der perivaskuläre Region der menschlichen Nabelschnur Gewebe41,42,43isoliert werden. Im Vergleich zu BMSCs besitzen HUCPVCs erhöhte Differenzierungspotenzial und einige andere regenerative Vorteile, sowohl in-vitro-41,44 und in Vivo45,46,47. Insbesondere habe die Quelle als mütterlich fötalen Schnittstelle, HUCPVCs deutlich geringer im Vergleich zu Erwachsenen Quellen von MSCs Immunogenität. Unsere Forschung konzentriert sich auf die Charakterisierung und prä-klinischen Anwendungen von FTM HUCPVCs, die jüngste Quelle der MSCs untersucht, die wir zuvor gezeigt haben, proliferative und höhere Multilineage gestiegen Differenzierung Kapazitäten, namentlich auf der Cardiomyogenic Linie41.
Hier präsentieren wir eine Protokoll, die Aggregatbildung und primäre kardiale Zellschichten Feeder verbindet wie induktive Kräfte, die komplette Cardiomyogenic Differenzierung von MSCs. Aggregate zu erreichen eine 3D Umgebung bieten die besseren Bedingungen in Vivo im Vergleich zu 2D anhaftende Kulturen Modelle. Verwendung von kardialen Feeder Schichten bietet eine Umgebung, die repräsentativ für die ultimative Transplantation-Website für die MSCs ist. Wir zeigen, dass jüngere Quellen von MSCs isoliert vor oder nach der Geburt die Nabelschnur eine höhere Kapazität, Form Aggregate und den kardialen Phänotyp im Vergleich zu Erwachsenen BMSCs haben, unter Beibehaltung ihrer immun-Privileg zu erreichen. Neben der steilen Höhe des kardialen Linie Marker-Gene und die induzierte Expression von intrazellulären (d. h. cTnT und MYH6) und Zelle-Oberfläche Proteine (z.B. SIRPA und Cx43) speziell für Kardiomyozyten, wir zeigen, dass die Differenzierung Potenzial von FTM HUCPVCs kann, mit dieser Methode genutzt werden und sie spontan Infizierung Cardiomyocyte-ähnlichen Zellen hervorrufen können.

<table><tbody><tr><td>0,25 % Trypsin/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>Für die Zelldissoziation</td></tr><tr><td>Alpha-MEM</td><td>Gibco</td><td>12571071</td><td>Für HUCPVC- und BMSC-Kulturmedien.</td></tr><tr><td>PE-konjugierter Anti-Human/Maus-CD49f-Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>313612</td><td>Integrin-Marker für FC</td></tr><tr><td>APC-konjugierten humanen Cx43/GJA1-Antikörper</td><td>R& D Systems</td><td>FAB7737A</td><td>Connexin 43 Marker für FC</td></tr><tr><td>FITC-konjugierten HLA-A2-Antikörper</td><td>Genway Biotech Inc.</td><td>GWB-66FBD2</td><td>Immunogenitätsmarker für FC</td></tr><tr><td>FITC-konjugierten anti-HLA-G [MEM-G/9]-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab7904</td><td>Immunogenitätsmarker für FC</td></tr><tr><td>FITC-konjugierten Maus-Anti-humanen SIRPA/CD172a-Antikörper</td><td>AbD Serotec/Bio-Rad</td><td>MCA2518F</td><td>Herzmarker für FC</td></tr><tr><td>APC-konjugierten humanen TRA-1-85/CD147-Antikörper</td><td>R& D Systems</td><td>FAB3195A</td><td>humaner Zellmarker für FC- und</td>FACS-FITC-konjugierte</tr><tr><td>humane TRA-1-85/CD147-Antikörper</td><td>R& D Systems</td><td>FAB3195F</td><td>humaner Zellmarker für FC und FACS</td></tr><tr><td>Anti-Connexin 43/GJA1 Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab11370</td><td>Cx43. Für ICC</td></tr><tr><td>Goat Anti-Kaninchen-IgG (H+L) kreuzresorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 555</td><td>Life Technologies</td><td>A-21428</td><td>Für ICC</td></tr><tr><td>Anti-sarkomerisches Alpha-Actinin [EA-53] Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab9465</td><td>aSARC. Für ICC</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Maus-IgM-Schwerketten-Kreuzabsorber-Sekundärantikörper, Alexa Fluor 555</td><td>Life Technologies</td><td>A-21426</td><td>Für ICC</td></tr><tr><td>Mef2C (D80C1) XP Kaninchen-Antikörper</td><td>New England BioLabs Ltd.</td><td>5030S</td><td>Für ICC</td></tr><tr><td>Donkey Anti-Kaninchen IgG (H+L) Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A-21206</td><td>Für ICC</td></tr><tr><td>Anti-Nuclei (HuNu) (Klon 235-1) Antikörper</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB1281</td><td>Für ICC</td></tr><tr><td>MZ9.5 Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td>Für bildgebende Aggregate.</td></tr><tr><td>1,5 ml Zentrifugen-Mikroröhrchen</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>Zum Färben von MSCs mit Fluoreszenzfarbstoff.</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Open-Source-Bildverarbeitungssoftware.</td></tr><tr><td>Aria II&nbsp;</td><td></td><td></td><td>BD UHN SickKids FC Einrichtung. Für die Zellsortierung.</td></tr><tr><td>mesechymale Stromazellen des Knochenmarks,</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td>, <td>BMSCs,</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td>, <td>Sigma-Aldrich</td><td>, A7030-100G</td><td>, BSA. Zur Vorbereitung von Lösungen für ICC</td></tr><tr><td>BrdU</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB3424</td><td>Achtung: BrdU ist ein starkes Teratogen und steht im Verdacht, mutagen zu sein. Bitte achten Sie auf eine ordnungsgemäße Schulung und lesen Sie vor der Verwendung das Sicherheitsdatenblatt.</td></tr><tr><td>Canto II</td><td>BD</td><td></td><td>UHN SickKids FC Einrichtung. Für die Durchflusszytometrie.</td></tr><tr><td>cDNA EcoDry Premix</td><td>Clontech/Takara</td><td>639570</td><td>Zur Vorbereitung von cDNA für die qPCR</td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA Dye</td><td>Life Technologies</td><td>C7025</td><td>Fluoreszierende Bildgebung von Zellzytoplasma</td></tr><tr><td>Countess automatisierter Zellzähler</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>C10227</td><td>Für die Zellzählung</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6421</td><td>Für primäres Kardiomyozyten-Kulturmedium für Ratten.</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>D-PBS, ohne Ca2+, Mg2+</td></tr><tr><td>EVOS</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Hauseigenes Fluoreszenzmikroskop</td></tr><tr><td>FACSCalibur</td><td>BD</td><td></td><td>Inhouse. Für die Durchflusszytometrie.</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (Hyclone)</td><td>GE Healthcare</td><td>SH3039603</td><td>FBS. Bestandteil des Zellkulturmediums.</td></tr><tr><td>IDT Prime Time qPCR-Sonden</td><td>Integrated Data Technologies</td><td>FAM-Fluorophor</td><td>http://www.idtdna.com/pages/products/gene-expression/primetime-qpcr-assays-and-primers</td></tr><tr><td>Lab Vision PermaFluor Wässriges Eindeckmedium</td><td>ThermoScientific</td><td>TA-030-FM</td><td>Zur Lagerung von Zellen für die ICC</td></tr><tr><td>LSR II&nbsp;</td><td></td><td></td><td>BD UHN SickKids FC Einrichtung. Für die Durchflusszytometrie.</td></tr><tr><td>MoFlo Astrios</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>UHN SickKids FC Einrichtung. Für die Zellsortierung.</td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>5425S</td><td>NGS. Wird in der Blockierungslösung für ICC</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Chamber Coverglass verwendet, 8 Vertiefungen</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>155409</td><td>Zur Vorbereitung von Proben für ICC</td></tr><tr><td>OmniPur Triton X-100 Tensid</td><td>EMD Millipore</td><td>9410-OP</td><td>Als Bestandteil einer permeabilisierenden Lösung bei der Vorbereitung von Zellen für ICC</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, 16%ige Lösung, EM Grade</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15710</td><td>Zur Fixierung von Zellen für ICC.</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Bestandteil des Zellkulturmediums.</td></tr><tr><td>Primer</td><td>Sigma</td><td>Custom Standard DNA-Oligos, entsalzt, 0,2 &mu; mol</td><td>CTnT_F: GGC AGC GGA AGA GGA TGC TGA A; CTnT_R: GAG GCA CCA AGT TGG GCA TGA ACG A; MYH6 F: GCA AAG TAC TGG ATG ACA CGC T; MYH6 R: GTC ATT GCT GAA ACC GAG AAT G</td></tr><tr><td>Quorum Spinning Disk Konfokal</td><td>Zeiss</td><td></td><td>SickKids Imaging Facility</td></tr><tr><td>ReproCardio Aus hiPS-Zellen gewonnene Kardiomyozyten</td><td>ReproCell</td><td>RCD001N</td><td>Positivkontrolle für qPCR</td></tr><tr><td>RNeasy Mini-Kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>Zur Isolierung von RNA für die qPCR</td></tr><tr><td>Rotor-Gene SYBR Green PCR Kit</td><td>Qiagen</td><td>204074</td><td>Für qPCR mit Mastermix</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>A1049101</td><td>Für MSC, Monozyten-Cokulturmedium.</td></tr><tr><td>TaqMan qPCR-Primer-Assays</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4444556</td><td>Für qPCR</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td>Färbung von Zellen auf Lebensfähigkeit und Zählung</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>272500108</td><td>Für die Zelldissoziation</td></tr><tr><td>Volocity</td><td>Perkin-Elmer</td><td>Volocity 6.3</td><td>Bildgebungssoftware</td></tr><tr><td>0,2 &mu; m Porenfilter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>566-0020</td><td>Zur Sterilisation von Gewebekulturmedien</td></tr><tr><td>HERAcell 150i CO2 Inkubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51026410</td><td>Zur Inkubation von Zellen</td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>PBS. 1X, Ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Almedic</td><td>7727- A10-704</td><td>Zum Reichen von Rattenherzen. Kann jede ähnliche Pinzette verwenden.</td></tr><tr><td>Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14059-11</td><td>Zum Zerkleinern von Rattenherzen. Gebogene Schere empfohlen.</td></tr><tr><td>50-ml-Röhrchen</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>Für die Entnahme bei der Kardiomyozyten-Entnahme und allgemeinen Gewebekulturverfahren</td></tr><tr><td>15-ml-Röhrchen</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>Für allgemeine Gewebekulturverfahren</td></tr><tr><td>6-Well-Platten</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>CA73520-906</td><td>Für Gewebekulturen</td></tr><tr><td>10 cm Gewebekulturschalen</td><td>Corning</td><td>25382-428</td><td>Für die Aggregatbildung</td></tr><tr><td>Axiovert 40C Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Für die Hellfeld-Bildgebung in unserer Gewebekultur und dem Rest des Protokolls</td></tr><tr><td>70 & mu; m Zell-Sieb</td><td>Fisherbrand</td><td>22363548</td><td>Zur Sicherstellung einer Einzelzellsuspension vor der Durchflusszytometrie oder Sortierung</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>EMD Millipore</td><td>9410-1L</td><td>Wird in der Permeabilisierungslösung für ICC</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H1399</td><td>Fleck verwendet, der bei der Visualisierung der Cx43-Lokalisierung verwendet</td></tr></tbody></table> wird

in-vitro- differenzierung humaner mesenchymaler stammzellen in funktionellen cardiomyocyte-ähnlichen zellen

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Myokardinfarkt und der anschließenden ischämischen Kaskade führen zu den umfangreichen Verlust von Kardiomyozyten, führt zu Herzinsuffizienz, die führende Todesursache weltweit. Mesenchymaler Stammzellen (MSCs) sind eine vielversprechende Option für zellbasierte Therapien, aktuelle, invasive Techniken zu ersetzen. MSCs mesenchymalen Abstammungen, kardiale Zelltypen, einschließlich differenzieren können, aber vollständige Differenzierung in funktionellen Zellen noch nicht erreicht. Bisherige Methoden der Differenzierung beruhten auf pharmakologische Wirkstoffe oder Wachstumsfaktoren. Mehr physiologisch relevante Strategien ermöglichen jedoch auch MSCs Cardiomyogenic Transformation unterziehen. Hier präsentieren wir Ihnen eine Differenzierung-Methode mit MSC Aggregate auf Cardiomyocyte Feeder Schichten, um Cardiomyocyte-wie auftraggebende Zellen zu produzieren.
Menschlichen Nabelschnur perivaskuläre Zellen (HUCPVCs) haben gezeigt, dass eine größere Differenzierung als potenzielle haben häufig untersucht MSC-Typen, z. B. Knochenmark MSCs (BMSCs). Als ontogenetisch jüngere Quelle untersuchten wir das Cardiomyogenic Potential des Ersttrimester-(FTM) HUCPVCs im Vergleich zu älteren Quellen. FTM HUCPVCs sind eine neuartige, reiche Quelle von MSCs, die ihre in Utero Immunabwehr Eigenschaften beim kultivierten behalten in Vitro. Mit dieser Differenzierung Protokoll, FTM und Begriff erreicht HUCPVCs deutlich erhöhte Cardiomyogenic Differenzierung im Vergleich zu BMSCs, wie durch die erhöhte Expression von Cardiomyocyte Marker (d. h. Myozyten Enhancer Faktor 2 C, kardiale Troponin T schwere Kette kardialen Myosin, Signal regulatorischen Protein α und Connexin 43) angegeben. Sie behielten auch deutlich geringer Immunogenität, wie durch ihren niedrigeren HLA-A Ausdruck und höheren Ausdruck von HLA-G. Aggregat-basierte Differenzierung anwenden, zeigte FTM HUCPVCs erhöhte Aggregatbildung Potenzial und generierten contracting Zellen Cluster innerhalb 1 Woche nach Kokultur auf kardiale Feeder Schichten, immer die erste MSC-Art, dies zu tun.
Unsere Ergebnisse zeigen, dass diese Differenzierungsstrategie effektiv das Cardiomyogenic Potential des jungen MSCs wie FTM HUCPVCs nutzen kann und deutet darauf hin, dass in-vitro- Pre-Differenzierung könnte eine mögliche Strategie, um ihre regenerativen Wirksamkeit in Vivozu erhöhen.

HUCPVCs weisen ein höheres Potenzial für die Bildung von Aggregaten und höhere Expressionen von CD49f im Vergleich zu BMSCs auf:
Um die Differenzierung von hMSCs (d. h. FTM HUCPVCs, term HUCPVCs und BMSCs) zu induzieren, wurden Einzelzell-Suspensionen undifferenzierter MSCs bzw. MSC-haltige Hängtropfen (Tabelle 1) auf primäre Kardiomyozyten-Monolayer von Ratten übertragen, um direkte Ko...

Hier präsentieren wir eine Methode, um effizient die kardialen Differenzierung junge Quellen humaner mesenchymaler Stammzellen um funktionelle, Auftraggeber, Cardiomyocyte-wie Zellen erzeugen Potenzial in-vitro-.

In-vitro- Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen in funktionellen Cardiomyocyte-ähnlichen Zellen

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Verfahrens besteht darin, die kardiomyogene Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen herbeizuführen und zu beobachten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der mesenchymalen Stammzellen zu beantworten, beispielsweise welche Maßnahmen durch Umweltsignale ausgelöst werden können, um funktionelle Kardiomyozyten zu erzeugen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie auf die Bildung von Aggregaten und fetalen Herzebenen setzt, anstatt pharmakologische Wirkstoffe oder genetisches Material einzusetzen.Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Therapie kardiovaskulärer Erkrankungen, da sie das kardiomyogene Potenzial mesenchymaler Stammzellen verdeutlicht. Diese Prozedur wird gemeinsam mit mir durchgeführt von Fräulein Farwah Iqbal, einer Doktorandin unseres Labors, sowie Max Librach und Nadav Gasner, die beide Auszubildende in unserem Labor sind. Nachdem die Teile des Rattenwelpen gemäß dem schriftlichen Protokoll isoliert wurden, schneiden Sie die Ventriculi der Länge nach halbieren und überführen sie in eine 10 cm-Dish mit 10 Milliliter PBS, lagern sie auf Eis und lassen das Blut auswaschen.Danach mit einer gebogenen Schere die Ventrikelwände in kleine Stücke mit einem Durchmesser von zwei bis drei Millimetern schneiden. Mit einer serologischen Pipette die Herzstücke von 10 bis 12 Tieren in ein 50-Milliliter-Gefäß überführen und absetzen lassen. So viel wie möglich an PBS P/S entfernen, ohne dabei Herzstücke zu entfernen.Gegeben Sie anschließend 10 Millimeter frisches PBS P/S hinzu. Um die Kardiomyozyten zu isolieren, ersetzen Sie nach dem Absinken der Herzstücke das PBS P/S durch 0,15 %iges Trypsin in PBS und inkubieren das Gewebe bei 37 Grad Celsius unter Schütteln für 10 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand.Danach die Trypsin-Digestion insgesamt noch dreimal wiederholen, wobei die Überstände jedoch in 50-Milliliter-Sammelröhrchen abgegossen werden, die 10 Milliliter 100 % FBS enthalten. Anschließend die Röhrchen mit den Zellen zentrifugieren und den Überstand abpipettieren. Danach die Zellen mit DMEM-F12, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % P/S, resuspendieren und auf eine 6-Loch-Platte ausplattieren.Nachdem die Zellen angeheftet haben, ersetzen Sie das Medium durch zwei Milliliter frisches Medium. Um vorgefärbte MSCs vorzubereiten, entfernen Sie das Medium von MSC-Kulturen, die in 10-Zentimeter-Platten eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreicht haben, und geben Sie drei Milliliter Zell-Dissociationslösung hinzu. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid für fünf Minuten.Überführen Sie die dissoziierten Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie bei 400 x G für fünf Minuten. Aspirieren Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören, und resuspendieren Sie die Zellen. Anschließend zählen Sie die Zellen mit einem automatischen Zellzähler.Verdünnen Sie die Zellen auf eine Konzentration von 1 × 10⁶ MSCs pro Milliliter in DMEM-F12, das 10 % FBS und 1 % P/S enthält. Geben Sie dann in 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen lebensfähigen, nicht übertragbaren fluoreszierenden Farbstoff hinzu und inkubieren Sie die MSCs für eine halbe Stunde. Nachdem die Röhrchen bei 400 × g für fünf Minuten zentrifugiert wurden, aspirations Sie den Überstand und resuspendieren das Pellet in einer Konzentration von 1 × 10⁶ MSCs pro Milliliter.Anschließend überführen Sie die MSCs in einer Konzentration von 10 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung einer 6-Vertiefungs-Platte auf die Kardiomyozyten. Um Aggregat-Kokulturen herzustellen, bereiten Sie eine Einzelzell-Suspension von MSCs in alpha MEM vor, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % P/S. Initiiert die Aggregatbildung, indem Sie 25 µl Zellsuspension als Tropfen auf die Innenseite der Deckel von 10 cm Zellkulturschalen geben.Setzen Sie die Deckel auf die entsprechenden Bodenteile, die PBS P/S enthalten. Inkubieren Sie die Schalen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Beobachten Sie unter einem Stereomikroskop nach drei Tagen die Aggregatbildung in den Tropfen.Wenn über 80 % der Tropfen gebildete Aggregate enthielten, sammeln Sie die Tropfen mit einer Ein-Milliliter-Mikropipette von den Deckeln und überführen die Aggregate direkt auf primäre monolayerartige Rattenkardiomyozyten. Inkubieren Sie die Aggregat-Kokulturen bis zu zwei Wochen lang, wobei Sie alle 72 Stunden das gesamte Mediumvolumen wechseln.Verwenden Sie täglich die Hellfeldmikroskopie, um das Anheften von Aggregaten an fetale Zellschichten zu beobachten. Notieren Sie kontrahierende Aggregate, sobald diese beobachtet werden. Die aktiven Aggregate kontrahieren synchron; wir vermuten eine Leitung zwischen ihnen über die gesamte fetale Schicht, die keine eigene physikalische Aktivität aufweist.Entfernen Sie das Medium und geben Sie zwei Milliliter PBS pro Vertiefung in die sechs-Vertiefungs-Platte. Anschließend entfernen Sie den PBS und geben zwei Milliliter Dissoziationslösung pro Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die Platten 3 Minuten lang bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid.Wie hier gezeigt, wiesen HMSCs von drei verschiedenen Typen in direkten Kokulturen eine ähnliche Häufigkeit und Erscheinung auf. Zwei bis drei Tage nach dem Übertragen der Hängetropfen auf Herzzellen in Aggregatkokulturen erschienen FTMs und terminale huck PBCs in größeren Aggregaten im Vergleich zu denen, die von BMSCs stammten. In diesem Experiment zeigte die Durchflusszytometrie-Analyse der CD49F-Expression in undifferenzierten MSCs, dass 96 % der FTM huck PBCs, 89 % der huck PBCs und 53 % der BMSCs positiv für das Zelloberflächenprotein CD49F waren.Die Durchflusszytometrie an TRA gewonnenen 85 Zellen zeigte die Hochregulation des mit Kardiomyozyten assoziierten Markers SIRPA in FTM-Huck-PBCs und Term-Huck-PBCs, jedoch nicht in BMSCs aus direkten Kardiomyozyten-Kokulturen. Wie hier zu sehen, war die Hochregulation von cx43 in FTM-Huck-PBCs im direkten Vergleich zu Term-Huck-PBCs oder BMSCs in direkten Kokulturen signifikant höher. Die fluoreszenzmikroskopische Analyse ergab, dass sowohl differenzierende FTM- als auch Term-Huck-PBCs cx43 hochregulierten.Bei term huck PBCs war der Anteil im Vergleich zu FTMs höher. Die Fluoreszenzmikroskopie zeigte jedoch, dass cx43-positive Pünktchen in der Zellmembran von FTM huck PBCs lokalisiert waren, während sie bei den term-Zellen vorwiegend im Zytoplasma zu finden waren. Schließlich wurde, wie hier zu sehen, eine Fluoreszenzmikroskopie mit hoher Vergrößerung an sortierten menschlichen Zellen durchgeführt, nachdem diese koinkubiert worden waren, und die hohe Häufigkeit von cx43 in der Plasmamembran wurde bestätigt.Wenn man die Schlüsselschritte dieses Verfahrens einmal beherrscht, kann man sie jeweils innerhalb einer Stunde durchführen, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, aseptische Vorsichtsmaßnahmen einzuhalten. Es werden primäre tierische Gewebe verwendet, die bei unsachgemäßer Handhabung Verunreinigungen einführen können.Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden, wie beispielsweise die weitergehende Kultivierung kontrahierender Aggregate, angewendet werden, um zusätzliche Fragestellungen zu untersuchen, etwa die Lebensdauer dieser Strukturen. Nach ihrer Entwicklung ermöglicht diese Technik Forschern auf dem Gebiet der mesenchymalen Stammzellen (MSCs), das Differenzierungspotential jüngerer Quellen mesenchymaler Stammzellen, wie zum Beispiel extraembryonaler Gewebe, zu erforschen. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man MSC-Aggregate herstellt und sie auf eine Weise mit direkten primären fetalen Gewebeschichten kombiniert, die eine geeignete Induktion zur kardiomyogenen Differenzierung ermöglicht.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit BRDU äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie die ordnungsgemäße Entsorgung zytotoxischer Abfälle sollten stets beachtet werden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Video zeigt, wie in vitro-Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus, um Embryoidkörpern mit dem hängenden Tropfen-Methode durchzuführen.

In-vitro-Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus (mES) Zellen unter Verwendung des Hanging-Drop-Methode

Wir haben ein Protokoll zur Induktion von Kardioblasten direkt von pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen unter bestimmten Bedingungen mit kleinen Molekülen, die Ableitung von einem großen Angebot an humanen kardialen Vorläuferzellen und funktionelle Kardiomyozyten für Herz-Kreislauf-Reparatur ermöglicht gepflegt eingerichtet.

Effiziente Ableitung von Human Cardiac Vorstufen und Kardiomyozyten aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

Pluripotenten Stammzellen, entweder embryonale oder induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen), eine wertvolle Quelle der menschlichen differenzierten Zellen, einschließlich Herzmuskelzellen. Hier werden wir auf die kardiale Induktion der iPS-Zellen zu konzentrieren, die zeigen, wie man sie benutzt, um funktionelle menschliche Herzmuskelzellen durch eine Embryoidkörpern-basiertes Protokoll zu erhalten.

Generation of Human Cardiomyocytes: Eine Differenzierung Protokoll von Feeder-freien menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Der Artikel beschreibt die detaillierte Methode zur menschlichen pluripotenten Stammzellen differenzieren zu Herzmuskelzellen wirksam durch selektives Modulieren des Wnt-Signalwegs, gefolgt von Durchflusszytometrie-Analyse von Referenzmarkierungen, um die Homogenität und Identität der Population abzuschätzen.

High Efficiency Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen zu Kardiomyozyten und Charakterisierung mittels Durchflusszytometrie

In diesem Protokoll wird die Ableitung von kardialen Vorläuferzellen sowohl aus maus als auch aus menschlichen embryonalen Stammzellen veranschaulicht. Eine wichtige Strategie in diesem Protokoll besteht darin, kardiale Vorläuferzellen mit Durchflusszytometrie unter Verwendung von Fluoreszenzreportern anzureichern, die in die embryonalen Stammzelllinien eingebaut werden.

Ableitung von Herzvorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen

Hier beschreiben wir ein robustes Protokoll für die Ableitung menschlicher Kardiomyozyten, das die modulierte kardiale Differenzierung kleiner Moleküle und die durch Glukoseentzug vermittelte Kardiomyozytenreinigung kombiniert und die Produktion von gereinigten Kardiomyozyten für die Zwecke der Modellierung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen und des Wirkstoffscreenings ermöglicht.

Ableitung von Highly Purified Kardiomyozyten aus Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen mit Small Molecule modulierte Differenzierung und anschließende Glucose Starvation

Dieses Manuskript beschreibt die Erstellung von definiertem manipuliertem Herzgewebe unter Verwendung von Oberflächenmarker-Expression und Zellsortierung. Die definierten Gewebe können dann in einem Multigewebe-Bioreaktor verwendet werden, um Mechanismen der kardialen Zelltherapie zu untersuchen, um ein funktionsfähiges, aber dennoch kontrolliertes Modellsystem des menschlichen Herzens bereitzustellen.

Bau von Defined Menschen Engineered Herzgewebe zur Untersuchung Mechanismen der Herzzelltherapie

Die Erzeugung von Kardiomyozyten aus pluripotenten Stammzellen in vitro ermöglicht den Zugang zu großen Mengen an Herzgewebe in vitro für die Grundlagenforschung und klinische Anwendungen.  Dieses Protokoll verwendet den atrialisierenden Faktor Grem2, um sowohl die Anzahl der erhaltenen Kardiomyozyten zu erhöhen als auch Kardiomyozyten mit einem atrialen Phänotyp zu erzeugen.

Die Differenzierung der Atrial Kardiomyozyten aus pluripotenten Stammzellen Mit dem BMP-Antagonisten Grem2

Die elektrophysiologische Charakterisierung von Kardiomyozyten, die aus menschlichen Pluripotenten Stammzellen (hPSC-CMs) stammen, ist entscheidend für die Modellierung von Herzkrankheiten und für die Bestimmung von Arzneimittelwirkungen. Dieses Protokoll liefert die notwendigen Informationen, um hPSC-CMs auf Multi-Elektroden-Arrays zu dissoziieren und zu plattieren, ihr Feldpotential zu messen und ein Verfahren zur Analyse von QT- und RR-Intervallen zu verwenden.

Elektrophysiologische Analyse von humanen Pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten Kardiomyozyten (hPSC-CMs) unter Verwendung von Multi-Elektroden-Arrays (MEAs)

Hier beschreiben und validieren wir eine Methode, um konsequent robuste humaninduzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten zu erzeugen und ihre Funktion zu charakterisieren. Diese Techniken können bei der Entwicklung mechanistischer Einblicke in Signalwege helfen, eine Plattform für groß angelegte Arzneimittelscreenings bieten und Herzkrankheiten zuverlässig modellieren.

Generierung von ventrikulären HiPSC-abgeleiteten Cardiomyozyten und hochwertigen Zellpräparaten für die Calciumhandling-Charakterisierung

Hier stellen wir ein Protokoll zur robusten Erzeugung und Erweiterung menschlicher Kardiomyozyten aus mononukleären Zellen des patienteneigenen peripheren Blutes vor.

Erzeugung und Expansion menschlicher Kardiomyozyten aus mononukleären Zellen des patientenperipheren Blutes

Erfahren Sie die kardiomyogene Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen durch Umweltsignale und Aggregatbildung. Diese Methode nutzt fetale Herzzellschichten statt pharmakologischer oder genetischer Ansätze.

In-vitro- Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen in funktionellen Cardiomyocyte-ähnlichen Zellen

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