Técnicas de laboratorio utilizadas para mantener y diferenciar los biotipos de Vibrio cholerae Aislados Clínicos y Ambientales

El objetivo general de esta técnica es proporcionar una colección de protocolos que sean sencillos de llevar a cabo y que puedan ayudar a cualquier investigador a caracterizar un determinado aislado clínico o ambiental de Vibrio cholerae. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la bacteriología, como las características genotípicas y fenotípicas específicas de cualquier aislado de Vibrio cholerae, especialmente aquellos de relevancia clínica. La principal ventaja de esta técnica es que permite a cualquier investigador utilizar esta colección de ensayos para caracterizar y distinguir de forma fiable los aislados de Vibrio cholerae clínicos o ambientales.

En conjunto, estos ensayos proporcionan un enfoque sistemático que se utilizará como alternativa o además de los costosos experimentos intensivos en mano de obra y la caracterización de aislados clínicos y ambientales de Vibrio cholerae. Aunque este método puede proporcionar información sobre la caracterización de los biotipos de Vibrio cholerae, también se puede aplicar para caracterizar las capacidades bioquímicas y metabólicas de otras bacterias entéricas. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades con la gestión del tiempo, ya que los tiempos de incubación necesarios para garantizar resultados óptimos difieren entre los ensayos bioquímicos.

Las demostraciones visuales de los protocolos de detección y apuñalamiento son fundamentales, ya que las salpicaduras a menudo pueden provocar contaminación cruzada y se requiere un espaciamiento máximo para evitar la fusión entre culturas. Comience el protocolo peletizando 1,8 mL de cultivo líquido durante la noche durante dos minutos mediante centrifugación a un mínimo de 8,600 xG en un tubo de microcentrífuga estéril de 2 mL. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de celda en 900 mcL de caldo fresco Luria-Bertani o LB por pipeteo.

A continuación, agregue 900 mcL de glicerol estéril al 60% de volumen a volumen al cultivo y mezcle por vórtice. Transfiera la mezcla a un tubo criogénico estéril de 2 mL y almacene el cultivo madre a 80 grados centígrados. Para utilizar el caldo, con un asa de inoculación estéril, retire una pequeña cantidad de caldo congelado y raye las bacterias para obtener colonias individuales en placas de agar LB.

Vuelva a colocar inmediatamente el caldo congelado a 80 grados centígrados después de su uso para evitar que los cultivos se descongelen por completo. Incube las placas con la tapa hacia abajo durante 12-16 horas a 37 grados centígrados. Obtener el plato previamente preparado.

Inocular 4 mL de caldo LB líquido en un tubo de cultivo estéril de 10 mL con una sola colonia tocando la superficie de la colonia única con un asa esterilizada y transfiriendo la colonia al caldo líquido. A continuación, incubar el cultivo con aireación en una incubadora agitadora a 225 rpm durante 12-16 horas a 37 grados centígrados. Prepare el cultivo durante la noche en caldo LB líquido.

Al día siguiente, pegue el cultivo y lave las células volviendo a suspender el pellet celular en 1,8 mL de solución salina tamponada con fosfato 1x o PBS. Repita el procedimiento de lavado tres veces. Siga el tercer lavado con una resuspensión final en 1,8 mL de 1x PBS.

A continuación, utilice una punta de pipeta para detectar 1 mcL de cultivo lavado en el medio correspondiente. Lave el pellet celular obtenido del cultivo durante la noche. Inocular placas de agar de motilidad insertando una puñalada inoculante en el cultivo líquido lavado y apuñalar verticalmente en el medio.

Asegúrese de que la puñalada inoculadora no se doble mientras apuñala el agar. Entre cada inoculación, esterilice la puñalada de alambre con un mechero Bunsen. Incube las placas con la tapa hacia arriba durante 14-24 horas a 37 grados centígrados.

Después de 14 horas, controle de cerca las placas de motilidad para evitar el crecimiento excesivo de cultivos. Inocular 4 mL de caldo de rojo de metilo Voges-Proskauer o MR-VP pipeteando 10 mcL de cultivo nocturno previamente preparado en 4 mL de caldo MR-VP en un tubo de cultivo estéril e incubar con aireación en una incubadora agitadora a 225 rpm durante 12-16 horas a 37 grados Celsius. A continuación, agregue 150 mcL de 5% de peso por volumen de alfa-naftol y 50 mcL de 40% de peso por volumen de hidróxido de potasio a 1 mL de alícuotas del cultivo nocturno MR-VP en tubos de cultivo estériles, respectivamente.

Luego, vórtice brevemente los tubos. Deje que los tubos permanezcan a temperatura ambiente hasta por cuatro horas hasta que se desarrolle el cambio de color. Las cepas de referencia del biotipo y las variantes representativas de El Tor se incluyeron en cribados genéticos basados en PCR y ensayos fenotípicos para distinguir entre los antecedentes del biotipo de los aislados clínicos y ambientales de V. cholerae.

El O395 clásico de tipo salvaje demostró secuencias clásicas ctxB y tcpA. Por el contrario, las cepas de El Tor de tipo salvaje N16961 y C6706 demostraron las secuencias ctxB y tcpA de El Tor. MQ1795 y BAA-2163 contienen la subunidad clásica del biotipo ctxB comparable a la 0395.

Sin embargo, ambas variantes de El Tor contenían el tcpA indicativo del trasfondo del biotipo de El Tor. Cuando se cultivó en placas de agar LB suplementadas con polimixina B, la cepa de biotipo clásico de tipo salvaje 0395 mostró sensibilidad a la polimixina B, mientras que la cepa de biotipo El Tor de tipo salvaje mostró resistencia. Las cepas representativas de la variante de El Tor demostraron una resistencia similar al antibiótico.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo distinguir entre los biotipos de Vibrio cholerae utilizando el sistema de identificación de ensayos múltiples descrito en este manuscrito. No olvide que trabajar con patógenos BSL-2 puede ser extremadamente peligroso y que el manejo y la eliminación adecuados de todos los materiales y productos de desecho deben aplicarse de acuerdo con las regulaciones institucionales, locales, estatales y federales. Además de los protocolos enumerados en este manuscrito, se puede lograr una mayor caracterización de los aislados de Vibrio cholerae mediante la investigación de otras propiedades fenotípicas como la formación de biopelículas y la autoaglutinación.