Name: Medición de las densidades de gafas acuosas a temperaturas criogénicas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Aprende a medir densidades de fase vítrea en soluciones acuosas a temperaturas criogénicas. Este método permite analizar muestras biológicas pequeñas con enfriamiento rápido para estudios de criobiología.

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Este trabajo fue apoyado por la NSF bajo el premio MCB-1330685. DWM reconoce el apoyo parcial de la Universidad de Cornell Molecular Biophysics Training Grant (NIH T32GM0082567).

PRECAUCIÓN: Antes de usar, consulte todas las hojas de datos de seguridad de materiales relevantes (MSDS). Por favor, use todas las prácticas de seguridad apropiadas cuando use gases comprimidos, incluyendo reguladores y válvulas de manejo de gases calibrados apropiados y tubos de gas aprobados. El contacto con criogénicos líquidos puede causar congelación severa y necrosis. Use equipo de protección personal adecuado (visera, guantes, bata de laboratorio, pantalones largos, zapatos cerrados), todos los cuales deben ser impermeables al nitrógeno líquido. Permanezca de pie y asegure un camino de salida sin obstrucciones desde el aparato cuando use criogénicos líquidos. Tenga en cuenta los riesgos de asfixia cuando utilice gases comprimidos y criogénicos líquidos y trabaje en un área bien ventilada con suficiente aire de preparación (una campana extractora de humos o una habitación con un alto índice de renovación del aire). 1. Preparación de Soluciones Acuosas para Mediciones de Densidad NOTA: Dado que los pesos se miden más fácilmente con una alta precisión que el vol, Las concentraciones en solución se miden en unidades w / w. Todas las densidades y temperaturas de fusión o de ebullición asumen una presión atmosférica de ~ 100 kPa. Los siguientes pasos describen la preparación de una solución de glicerol al 35% p / p. El mismo procedimiento se puede utilizar para otras concentraciones y solutos. <ol><li> Para cada tipo de soluto y concentración de interés, estimar aproximadamente la masa de soluto requerida para obtener la concentración final deseada ( por ejemplo , entre 25% p / p y 100% p / p) para un volumen de solución total, V $ _ { tot } $ = 10 ml de volumen de disolución . Por ejemplo, para una solución de glicerol al 35% p / p ( ρ s = 1,26 g / ml), la masa de soluto, m s es: <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/55761/55761eq1.jpg" /> Donde x es la fracción de masa de soluto (0.35) y ρ w = 1 g / mL es la densidad de agua. </li><li> Coloque un tubo de centrífuga de 15 ml (u otro recipiente impermeable al agua calibrado en volumen) sobre la sarténDe una microbalanza analítica. Dispensar la masa deseada de soluto / crioprotector ( por ejemplo , 3,77 g de glicerol para una solución al 35% p / p) en el tubo y registrar la masa de soluto real. </li><li> Añadir agua desionizada de alta pureza (&gt; 18 MΩ) para llevar la masa total hasta 10,0 g </li><li> Vórtice el recipiente durante 30 s (para solutos líquidos) o 5 min (para solutos sólidos), hasta que la solución sea ópticamente homogénea. </li><li> Medir y registrar la masa final de la solución. Selle el contenedor con un tapón hermético y guárdelo a temperatura constante (293-298 K). </li></ol> 2. Preparación de la cámara de refrigeración de muestras <ol><li> Coloque el aparato experimental descrito a continuación en un recinto y drene el aire seco (&gt; 5% de humedad relativa (HR)) en el recinto. NOTA: El recinto puede ser un simple bastidor de metal con su parte superior y tres lados sellados con una lámina de plástico transparente y con acceso experimental a través de un cuarto lado cubierto con una lámina de plástico flexible. VestirLos escudos faciales y el revestimiento del cuerpo para minimizar la humedad introducida por el experimentador. La condensación de humedad y la formación de hielo pueden interferir con las mediciones de la densidad de temperatura criogénica de varias maneras, por lo que debe ser minimizada. </li><li> Coloque un disco de caucho de neopreno en la parte inferior de un frasco de Dewar de 4,5 L de vidrio, para proteger el frasco de Dewar de daños. </li><li> Inserte cuidadosamente una cámara de cobre de alta conductividad térmica (un cilindro hueco con un fondo sellado) en el frasco hasta que se apoye en el disco de goma. Ajuste los puntales que sobresalen hacia afuera de la cámara a las paredes de Dewar de modo que la cámara esté centrada y no tenga tendencia a la roca. NOTA: El frasco de Dewar contendrá nitrógeno líquido, y la cámara de cobre de volumen mucho menor contendrá una mezcla de N2 - Ar líquido. El nitrógeno líquido proporciona un baño térmico que mantiene la cámara de cobre y su contenido a una temperatura constante de 77 K y reduce las pérdidas por ebullición y evaporación en la cámara. La Cámara&amp;#El pequeño diámetro suprime las ondas de superficie que pueden interferir con las mediciones de flotabilidad y ayuda a aislar el líquido dentro de la cámara de heladas y hielo formados en otras partes del aparato. </li><li> Introduzca la salida de un tubo de gas con gas N2 seco que fluya a ~ 2 l / min hasta el fondo de la cámara de cobre y purgue la cámara de aire húmedo. </li><li> Lentamente vierta nitrógeno líquido en el frasco de Dewar, fuera de la cámara de cobre, lo que permite el tiempo de ebullición de nitrógeno. NOTA: El nivel de llenado final, después de que haya terminado el ebullición, debe estar a aproximadamente 4 cm de la parte superior de la cámara de cobre. </li><li> Cubra la parte exterior del frasco Dewar con una tapa aislante de espuma anular. Retire el tubo de purga de gas N 2 seco de la cámara de cobre e inserte en una abertura correspondiente de la tapa. NOTA: La combinación de gas N2 de la ebullición en el frasco de Dewar y del flujo de purga expulsa cualquier aire húmedo y evita que se condense y cristaliza.N superficies frías. </li><li> Vierta lentamente nitrógeno líquido en la cámara de cobre. El nivel de llenado final, después de que haya terminado el ebullición, debe estar a aproximadamente 4 cm de la parte superior de la cámara de cobre. </li><li> Coloque una fina lámina de plástico transparente ópticamente sobre la abertura central o ventilación en la tapa y reduzca el caudal de gas N2 a ~ 0,2 L / min, dejando una ligera sobrepresión de gas N2 dentro de los espacios de gas por encima de los líquidos criogénicos. NOTA: Mientras los líquidos criogénicos estén presentes en Dewar y en la cámara, continúe ajustando el flujo de gas N 2 según sea necesario para mantener esta sobrepresión y evitar que la humedad entre en Dewar y forme hielo. </li></ol> 3. Determinación del volumen y densidad de la masa de prueba a T = 298 K y T = 77 K <ol><li> Determine la masa aparente de una masa de prueba de PTFE de ~ 1 g, ~ 0,4 mL ( Tabla de Materiales ) en aire a T = 298 K colocándola sobre el recipienteDe una microbalanza analítica calibrada. </li><li> Determinar el volumen V (298 K) de la masa de ensayo a T = 298 K usando un picnómetro de gas, o mediciones dimensionales con calibradores. Si se utilizan medidas dimensionales, la masa de ensayo debe tener una forma simple y precisa (sin curvaturas o esquinas redondeadas) y debe determinarse el volumen del orificio pasante (para la línea de suspensión). </li><li> Calcular la masa m de la masa de ensayo corrigiendo la masa aparente medida para la fuerza de flotación ejercida por el aire de acuerdo con lo siguiente: <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/55761/55761eq2.jpg" /> Donde ρ aire = 1,23 g / L (~ 0,1% de corrección). </li><li> Coloque la microbalanza sobre una plataforma estable aproximadamente 10 cm por encima del frasco de Dewar y verifique su calibración. Suspender la masa de prueba con una línea de monofilamento de 2 mil (50 μm), colgada del gancho en la parte inferior de la microbalanza (diseñada para suspender mediciones de masa) yGh un agujero en la masa de prueba. Determine la masa aparente en el aire, y compárela con la medición en el paso 3.3, corrigiendo según sea necesario para la masa de la línea. </li><li> Determinar el volumen V (77 K) de la masa de ensayo a T = 77 K midiendo su masa aparente en nitrógeno líquido puro, m AP en LN2 . Baje la masa de prueba en el nitrógeno líquido dentro de la cámara de cobre hasta que esté completamente sumergida. Cuando haya dejado de hervir, mida la masa aparente. NOTA: Si el nitrógeno líquido en la cámara de cobre es quiescente y las corrientes de aire entre la microbalanza y la superficie del líquido son mínimas, esta masa puede medirse con una precisión superior a ± 0,0002 g. </li><li> Estimar la fuerza de flotación en la parte sumergida de la línea, y verificar que es pequeña en comparación con los errores de medición. </li><li> Calcular el volumen y la densidad de la masa de ensayo a 77 K utilizando su masa conocida m y la masa aparente medida en LN2 a 77 K, mapp iN LN2, de acuerdo con lo siguiente: <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/55761/55761eq3.jpg" /> Donde ρ LN2 ( (77 K) = 0,807 g / mL. </li></ol> 4. Preparación de la mezcla líquida N2 - Ar inicial <ol><li> Flujo de gas Ar a un caudal de ~ 2 L / min a través de un tubo enrollado a su salida. Coloque el tubo en espiral en la parte superior de los puntales superiores que estabilizan la posición de la cámara de cobre, justo por encima del nivel de nitrógeno líquido y por debajo de la superficie superior del Dewar. El gas frío N2 y el gas Ar se acumularán por encima de los líquidos criogénicos, y la conducción térmica, la convección y la radiación enfriarán la tubería y el gas Ar dentro. </li><li> Después de dejar que el tubo enrollado se enfríe durante 5 minutos, coloque la salida del tubo en la cámara de cobre, al menos 10 cm por debajo de la superficie del nitrógeno líquido. Luego cubra el Dewar con la tapa anular y la hoja transparente. </li><li> Ajuste el caudal Ar hasta que las burbujas Ar subanDesde la salida del tubo hasta la superficie superior del nitrógeno líquido. A continuación, reduzca el caudal hasta que las burbujas se formen en la salida, pero se disuelven o licúan justo antes de romper la superficie del nitrógeno líquido. NOTA: A medida que aumenta la concentración de Ar en la cámara de cobre, ajuste periódicamente el caudal de Ar según sea necesario para mantener la formación de burbujas. Si el caudal de Ar es demasiado bajo, el Ar puede congelarse dentro del tubo y bloquear el flujo. </li><li> Agregue nitrógeno líquido según sea necesario para mantener su nivel en el Dewar circundante. Retire el hielo que se acumula en las superficies frías. </li><li> Periódicamente, mezcle el líquido insertando una delgada lámina de cobre ( por ejemplo , 35 micras) de lámina de cobre unida a una barra aislante delgada dentro de la cámara de cobre y moviéndola lentamente hacia arriba y hacia abajo como un pistón. Esto reducirá gradientes de concentración y la tendencia de que Ar se cristaliza fuera de la solución. </li></ol> 5. Medición y ajuste de la densidad de la mezcla inicial de N2 - ArTure <ol><li> Calcular la densidad objetivo de la mezcla de N2 - Ar estimando la densidad de T = 77 K de la muestra a medir, por ejemplo , mediciones a concentraciones mayores del componente no acuoso de la muestra. </li><li> Conecte la masa de prueba con la línea de monofilamento al gancho en la parte inferior de la cubeta de medición de la microbalanza, mida su masa aparente en el aire y confirme la concordancia con la medición en el paso 3.1. </li><li> Mezclar la solución de N2 - Ar para eliminar los gradientes de concentración y densidad como en el paso 4.5. </li><li> Pre-enfriar la masa de prueba a T = 77 K bajándola en el nitrógeno líquido fuera de la cámara de cobre. Elevar la masa de ensayo a la capa fría de gas nitrógeno por encima del nitrógeno líquido, esperar a que el nitrógeno líquido residual se evapore de la masa de ensayo y luego bajar la masa de ensayo fría y seca en la mezcla de N2 - Ar hasta que esté completamente sumergida y Dentro de 2 cm de la superficie del líquido. </li><li&gt; Después de que todas las ondas de ebullición y de superficie hayan desaparecido, mida la masa aparente de la masa de prueba. Calcular la densidad de la solución usando su masa verdadera m y T = 77 K volumen V (77K) del paso 3.7 de acuerdo con lo siguiente: <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/55761/55761eq4.jpg" /></li><li> Aumentar la densidad de la solución mediante el flujo de Ar adicional hasta obtener la densidad inicial deseada. Las gotas de muestra que se hunden pueden perderse fácilmente, por lo que la densidad inicial debe ser por lo menos un poco más alta que la densidad de muestra esperada. La muestra flotará entonces, haciéndola más fácil seguirla, y entonces la densidad de la mezcla de N2 - Ar sólo tendrá que ajustarse hacia abajo añadiendo N2 líquido. </li><li> Retire el tubo Ar de preenfriamiento y déjelo calentar y secar antes de usarlo. </li></ol> 6. Gotas de enfriamiento de la solución de muestra <ol><li> Inmediatamente antes de la dispensación y enfriamiento de gota, repita el paso 1.5 a miX el líquido criogénico de nitrógeno / argón. Tenga cuidado de no introducir burbujas. </li><li> Retire la tapa hermética del tubo de muestra. Usando una jeringa limpia de 1 mL, extraiga hasta 1 mL de solución y vuelva a colocar la tapa. Coloque una aguja de 27 a 33 G en la jeringa y, a continuación, empuje una pequeña cantidad de muestra a través de la aguja para expulsar el aire y los residuos de la dispensación anterior. </li><li> Se pueden usar dos métodos para proyectar gotas de muestra en la mezcla de N2 - Ar. <ol><li> Para muestras con grandes concentraciones de componentes no acuosos (&gt; 45% p / p) que pueden vitrificarse con tasas de enfriamiento moderadas, presione ligeramente la jeringa para desplazar un diámetro pequeño (250 μm a 1 mm), ~ 10 nL a 1 μl de gota Que cuelga de la punta de la aguja por la tensión superficial. Golpee suavemente la aguja para separarla y proyectar la gota hacia la mezcla líquida de N2 - Ar. </li><li> Para las muestras que requieren un enfriamiento más rápido para la vitrificación, coloque la salida de un tubo de gas conectado a un generat de vacíoO (suministrado por aire comprimido de laboratorio) en el espacio de gas por encima de la mezcla de N2 - Ar líquido, y succione suavemente la capa de gas frío que se forma. Esto aumenta las tasas de enfriamiento de las pequeñas muestras [ 11] . <ol><li> Con cuidado, toque la punta de la aguja en una tira de polímero transparente de 25-75 μm de grosor para dispensar un pequeño volumen (&lt;10 nL, correspondiente a un diámetro de gota &lt;200 μm) de muestra. NOTA: Para obtener las gotas más pequeñas, casi las más esféricas y más fácilmente eliminadas, empapar la tira en una solución de recubrimiento hidrófobo durante 10 min y dejar secar antes de dispensar la muestra. </li><li> Agarrar la tira con una varilla de plástico o de madera unida, y sumergir manualmente la varilla más la tira en la mezcla líquida de N2 - Ar. </li><li> Una vez que la gota se ha solidificado y la ebullición ha cesado, agarre el borde de la tira opuesto a la varilla usando pinzas. Flexión de la tira, manteniéndola sumergida en el líquido N 2 -Ar, hasta que la gota de muestra se desprenda y flote al surfas. </li></ol></li></ol></li></ol> 7. Evaluación del estado de la muestra <ol><li> Utilizando un microscopio binocular de larga distancia de trabajo (5-10 cm) e iluminación brillante y fresca de un iluminador LED o de fibra óptica, examine cuidadosamente la gota mientras la mantiene sumergida en el líquido N 2 -Ar. Las gotas vitrificadas deben aparecer claras 12 , 13 . Rechace las gotas que son nebulosas o nubladas (que probablemente contengan más de una fase) y / o que muestren imperfecciones ópticas incluyendo grietas (que pueden estar asociadas con huecos que cambian la densidad media). NOTA: Pintura de la superficie interior de la cámara de cobre para proporcionar un fondo negro puede facilitar la identificación de las imperfecciones de la muestra. </li></ol> 8. Determinación de la Densidad de la Muestra <ol><li> La gota dispensada inicialmente flotará, se hundirá o (rara vez) flotará neutralmente en la mezcla de N2 - Ar.A veces, las gotas flotantes pueden mantenerse por tensión superficial, pequeñas burbujas o partículas de hielo adheridas. Inspeccione toda la superficie de la gota con el microscopio. Desplace la gota hacia abajo de la superficie del líquido usando un pequeño plástico o barra de madera precooled (2-3 mm de diámetro, 10 cm de largo) y observe su respuesta. </li><li> Si la gota se hunde, aumente la densidad del líquido N2 - Ar utilizando el procedimiento del paso 4 hasta que la gota se vuelva flotante o flota. </li><li> Si la gota flota, disminuya la densidad del líquido N2 - Ar añadiendo nitrógeno líquido usando un criovial de 1,8 ml. A densidades de mezcla iniciales grandes (1,2-1,3 g / mL), la adición de N 2 en incrementos de 1 mL da cambios de densidad apreciables, pero esto se debe aumentar hacia 5 mL a densidades bajas (0,8-0,9 g / mL). Mezcle suavemente el N 2 -Ar (para no perder la pista de la gota de muestra) usando la lámina de cobre perforada delgada hacia arriba y hacia abajo en la cámara de cobre. </li><li> Después de cada adición de N2, Utilice una varilla preenfriada pequeña para desplazar suavemente la gota flotante hacia abajo en el líquido y observe su velocidad a medida que vuelve a la superficie. </li><li> Cuando la densidad de la solución ha sido ajustada de modo que la gota pareciera ser flotante neutral o ascienda muy lentamente (&lt;50 μm / s garantizará una precisión de densidad de ~ 0,1% o mejor para gotas con volúmenes de hasta 50 μl) Ar como se describe en el paso 5. A continuación, añadir líquido adicional N 2 hasta que la gota primero comienza a hundirse lentamente, y medir de nuevo la densidad de la mezcla N 2 -Ar. Estas dos medidas proporcionarán límites en la densidad de caída. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El presente aparato y métodos, desarrollados principalmente por estudiantes de grado con acceso limitado a herramientas y maquinaria para la construcción de instrumentos, proporciona sin embargo mediciones de densidad muy precisas para gotas líquidas individuales tan pequeñas como 50 pL. En el intervalo de concentración cercano y superior al 50% p / p, donde las tasas de enfriamiento pequeñas son suficientes para obtener muestras vitrificadas, las densidades coinciden con las obtenidas en mediciones anteriores en muestr...

Las propiedades físicas del agua y de las mezclas acuosas en sus diversas fases son de interés fundamental y son importantes para la comprensión in vivo e in vitro de los sistemas biológicos. En la criobiología contemporánea y la crioconservación biológica, las fases vítreas o amorfas de las mezclas acuosas de crioprotectores son de particular interés 1 , 2 . La nucleación y el crecimiento de los cristales de hielo pueden interrumpir las células y los tejidos, y promover la desnaturalización y agregación de proteínas, por lo que los protocolos de crioconservación que vitrifican el disolvente se han vuelto cada vez más populares. En la cristalografía biomolecular, la cristalización del disolvente en los canales entre las biomoléculas interrumpe las rejillas de cristal y degrada las propiedades de difracción. La vitrificación se consigue a través de una combinación de enfriamiento rápido, deshidratación y adición de solutos crioprotectores tales como glicerol, etilenglicol, polietilenglicoles (PEGs),Alcoholes y sales. La vitrificación limita la cristalización y el crecimiento del hielo, pero no elimina todos los daños relacionados con la refrigeración. Por ejemplo, la mosaicidad cristalina (una medida de la distribución de las orientaciones de los planos de cristal) aumenta rutinariamente en un factor de 10 a 100 cuando los cristales de proteína se enfrían en un estado vitrificado 3 , y las tasas de supervivencia de espermatozoides vitrificados y ovocitos varían ampliamente . Un mecanismo de daño es la contracción diferencial del disolvente y del material circundante durante el enfriamiento 3 , 4 , 5 . El disolvente de equilibrio y las concentraciones de soluto dentro de un cristal, célula o tejido son dependientes de la temperatura, y el disolvente más el soluto y el material circundante pueden contraerse en diferentes cantidades. El enfriamiento rápido puede prevenir la redistribución del solvente y del soluto antes de la vitrificación, y<html> Puede conducir a tensiones grandes, inhomogéneas y no equilibradas que causan daño a la muestra. Por lo tanto, los enfoques racionales para reducir el daño inducido por refrigeración podrían beneficiarse del conocimiento de las densidades dependientes de la temperatura de las mezclas acuosas líquidas y vitrificadas. A concentraciones de soluto superiores al 50% en peso de soluto a peso de solución (p / p), la mayoría de las mezclas de crioprotectores acuosos pueden vitrificarse con tasas de enfriamiento modestas de 10 K / s o menos, permitiendo la producción y medidas de densidad usando muestras vítreas grandes 6 . La densidad puede entonces determinarse usando el principio de Arquímedes, midiendo el peso aparente de la muestra cuando se suspende en un criógeno líquido como nitrógeno. Sin embargo, a medida que disminuye la concentración de soluto, las velocidades de enfriamiento requeridas para la vitrificación aumentan rápidamente: Las velocidades de enfriamiento para mezclas acuosas de glicerol aumentan de &lt;10 K / s a ​​50% en peso de soluto en g al volumen de solución en ml (p / v) K / sa 25% p / vAsno = &quot;xref&quot;&gt; 7. La transferencia de calor se limita a la capa límite, de modo que lograr mayores tasas de enfriamiento requiere muestras cada vez más pequeñas 8 . Las mediciones de la densidad de agua vítrea pura y hielo se han conseguido depositando gotas de diámetro micrométrico (volumen de femtolitro) en vacío sobre una superficie enfriada criogénicamente para construir una muestra macroscópica (masa gramatical). La densidad de esta muestra se determinó mediante crioflotación en una mezcla de nitrógeno líquido-argón, en la que se ajustó la densidad del líquido criogénico hasta que la muestra se volvió neutralmente flotante 9 . Sin embargo, la generación de grandes muestras de un gran número de pequeñas gotas de una manera que minimiza los volúmenes de vacío - una importante fuente de error en las mediciones anteriores de la densidad de la fase vítrea - no es trivial. Para las mezclas acuosas, la evaporación diferencial de los componentes de la solución durante la aerosolización y la deposición en vacío puede conducir aIncertidumbres sustanciales en las concentraciones depositadas. Hemos desarrollado un método, basado en cryoflotation, que permite la determinación precisa de la densidad de mezclas acuosas utilizando gotas individuales tan pequeñas como 50 pL 10 . Estas gotas pueden enfriarse rápidamente mientras se mantienen sus concentraciones originales, y su estado de temperatura criogénica (vitrificado o cristalino) se puede evaluar usando un ensayo visual simple que se correlaciona con mediciones de difracción de rayos X. Este método es ampliamente aplicable a mezclas acuosas y no acuosas, y puede extenderse a una variedad de muestras biológicas que incluyen células ( vg , tallos y huevos), muestras de tejido y cristales de proteína que tienen densidades a baja temperatura entre 0,8 y 1,4 g / Ml.

<table><tbody><tr><td>tubo centrífugo</td><td>Falcon</td><td>6029236</td><td>tubo centrífugo cónico de 15 mL</td></tr><tr><td>glicerol, >99.5%</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>G9012-100 mL</td><td></td>de</tr><tr><td>etilenglicol, >99,8%</td><td>Sigma</td><td>324558-100 mL</td><td></td></tr><tr><td>microbalanza analítica</td><td>Mettler</td><td>AE240</td><td>Balanza analítica, resolución de 0,01 mg, tiene gancho en la parte inferior para pesar por debajo de la balanza&nbsp;</td></tr><tr><td>vortexer</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td>Vortex-Genie 2</td></tr><tr><td>Armazón de caja de aparatos</td><td>Unistrut&nbsp;</td><td>Estructura metálica de 1-5/8" 48</td><td>" de ancho x 24" de profundidad x 40" de alto&nbsp;</td></tr><tr><td>Recinto del aparato, barrera</td><td></td><td></td> de aire, <td>cualquier lámina de plástico transparente,</td></tr><tr><td>disco de goma de neopreno, matraz</td><td></td><td></td> dewar de <td>4" de diámetro y 1/8" de espesor</td></tr><tr>Matraz<td>dewar</td><td>Scilogix</td><td>Dilvac SS333</td><td>de 4,5 litros con caja de acero y tapa de abrazadera</td></tr>, <tr><td>cámara</td><td></td><td></td> <td>de cobreEsta pieza fabricada se compone de un tubo de cobre de 1.43" de diámetro y 0.017" de espesor de pared con una base de cobre cilíndrica sólida soldada para sellar un extremo. La base de cobre mide 0,87" de alto y la altura total de la cámara es de 7".</td></tr><tr><td>gas nitrógeno</td><td>Airgas</td><td>NI HP300</td><td>99.998% puro gas N2</td></tr> gas <tr><td>argón</td><td>Airgas</td><td>AR HP300</td><td>99.998% puro Ar</td></tr><tr><td>rotámetro</td><td>de gas Omega</td><td>FL3692ST</td><td>2.52 L/min caudal máximo</td></tr><tr><td>tapa aislante de</td><td></td><td></td> espuma Esta <td>pieza está fabricada con espuma de polietileno reticulado de 4 lb/ft3 (suministrada por Technifab, 1355 Chester Industrial Parkway, Avon, OH), y tiene un diámetro exterior de 2,42" y un diámetro interior de 1,52", y un espesor de 0,79". &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr>Masa <td></td><td></td><td>de prueba de PTFE</td><td>Esta pieza fabricada es un cilindro de 0.246" de diámetro y 0.580" de alto con un orificio de 0.060" de diámetro que corre perpendicular e intersecta el eje del cilindro ~0.10" desde un extremo.</td></tr><tr><td>Plataforma de microbalanza</td><td>Estructura metálica Unistrut</td><td>de 1-5/8" Marco</td><td>rectangular de 11" de ancho x 24" de largo x 24" de alto con una lámina de aluminio superior que contiene un orificio para el monofilamento y la masa de prueba colgante Línea</td></tr><tr>de<td>monofilamento de 2 milésimas de pulgada (50 mmm)</td><td>Berkley</td><td>NF1502-CM Línea de</td><td>pesca Nanofil</td></tr><tr><td>Tubo de bobina de preenfriamiento de argón</td><td>VWR</td><td>60985-512</td><td>Tubo</td></tr> <tr><td>de PVC de 1/8" de diámetro interno x 1/4" de diámetro exteriorMezclador de lámina de cobre perforada</td> de 1.4" de diámetro, &nbsp; Disco de cobre de 35 micras de espesor, cortado de lámina de cobre de 1 onza/pie2 y perforado con agujeros con un punzón u otra herramienta de punta afilada.<td></td><td></td><td> Inserte una varilla rígida térmicamente aislante (plástico o madera) de 1-2 mm de diámetro en el centro y fíjela con epoxi según sea necesario.</td></tr><tr><td>jeringa</td><td>BD</td><td>309628</td><td>1 mL Luer-Lok generador de vacío con punta de jeringa</td></tr><tr><td></td><td>Gast</td><td>VG-015-00-00</td><td>Venturi de aire comprimido generador de vacío de una etapa</td></tr> spray de <tr><td>recubrimiento hidrofóbico</td><td>RainX</td><td>620036</td><td>plástico repelente al agua</td></tr><tr><td>microscopio estereoscópico de larga distancia focal</td><td>Bausch and Lomb Bausch and Lomb Stereozoom 6</td><td></td><td>0.67-4 x con oculares de 20X, distancia de trabajo de 10 cm& nbsp;</td></tr><tr><td>Iluminador de anillo LED</td><td>Amscope</td><td>LED144S</td><td></td></tr><tr><td>Iluminador puntual LED</td><td>Newhouse Lighting</td><td>NHCLP-LED</td><td>3W Lámpara de abrazadera LED de cuello de cisne</td></tr><tr><td>1,8 ml vial criogénico</td><td>Nunc</td><td>V7634-500EA</td><td>Cualquier criovial de 1,8 o 2 mL es adecuado</td></tr></tbody></table>

medición de las densidades de gafas acuosas a temperaturas criogénicas

Measuring the Densities of Aqueous Glasses at Cryogenic Temperatures

Demostramos un método para determinar las densidades de temperatura criogénicas de la fase vítrea de mezclas acuosas, y otras muestras que requieren un enfriamiento rápido, para preparar la fase de temperatura criogénica deseada. Las gotas de tamaño de microlitro a picolitro se enfrían por proyección en una mezcla de nitrógeno-argón líquido (N2 - Ar). La fase de temperatura criogénica de la gota se evalúa utilizando un ensayo visual que se correlaciona con mediciones de difracción de rayos X. La densidad de la mezcla N _ { 2} - Ar líquida se ajusta mediante la adición de N _ { 2 } o Ar hasta que la gota se vuelve neutralmente flotante. La densidad de esta mezcla y por lo tanto de la gota se determina usando una masa de prueba y el principio de Arquímedes. Con un cuidado adecuado en la preparación de gotas, la gestión del gas por encima de la mezcla líquida de criógenos para minimizar el hielo y la mezcla regular de la mezcla criogénica para evitar la estratificación de la densidad y la separación de fases, densidades &lt;0.5% de gotas tan pequeñas como 50 pLFácilmente determinado. Las mediciones de las mezclas de crioprotectores acuosos proporcionan información sobre la acción crioprotectora y proporcionan datos cuantitativos para facilitar la adaptación de la contracción térmica en la crioconservación biológica.

Las mediciones de densidad a T = 77 K para las gotas vitrificadas de glicerol acuoso y etilenglicol frente a la concentración de crioprotector se muestran en la Figura 1A y Figura 1B respectivamente y el cambio correspondiente en el volumen específico entre T = 298K y 77K, calculado usando previamente Determinado T = 298 K densidades, se muestra en la <strong class="xf...

Se describe un protocolo para determinar las densidades de fase vítrea de gotas de tamaño micro a pico-litro de mezclas acuosas a temperaturas criogénicas.

Medición de las densidades de gafas acuosas a temperaturas criogénicas

We demonstrate a method for determining the vitreous phase cryogenic temperature densities of aqueous mixtures, and other samples that require rapid ...

El objetivo general de este experimento es determinar las densidades en estado vítreo o vítreo de soluciones acuosas a temperaturas criogénicas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la criobiología y la criocristalografía, como, ¿cuánto se contraen o expanden las mezclas acuosas crioprotectadas al enfriarse hasta un estado vítreo a temperaturas criogénicas? La principal ventaja de esta técnica es que tanto la densidad como la fase de la muestra a temperatura criogénica pueden determinarse utilizando muestras pequeñas que pueden enfriarse rápidamente.Aunque este método fue desarrollado para soluciones crioprotectoras, también puede utilizarse para determinar las densidades a temperaturas criogénicas de tejidos, agregados celulares y otras muestras biológicas. Tuve la idea de este método por primera vez cuando aprendí de Thomas Lutin cómo preparar un líquido criogénico con una densidad ajustable en el rango entre 0,9 y 1,3 gramos por mililitro. Para comenzar este procedimiento, coloque un disco de hule de neopreno en el fondo de un matraz dewar de vidrio de 4,5 litros, para proteger el matraz dewar de daños.Inserte cuidadosamente una cámara de cobre d

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Research

Investigación

JoVE Journal

Engineering

Ingeniería

En este video, demostramos un método de criovitrificación ultrarrápido para preservar muestras biológicas. El método implica el uso de una combinación de crioprotectores para proteger el tejido biológico del daño por congelación al prevenir la formación de cristales de hielo intracelular.

Criopreservación basada en vitrificación: una técnica de enfriamiento ultrarrápido para preservar muestras biológicas a temperaturas muy bajas para su almacenamiento a largo plazo

El ensayo plantar en frío (CPA) mide la respuesta al frío entre 30 °C y 5 °C, y también puede medir la adaptación al frío. Este protocolo describe cómo usar el CPA para medir la hipersensibilidad al frío, la analgesia y la adaptación en ratones.

Un método simple y barato para la Determinación de la sensibilidad al frío y Adaptación en ratones

A continuación, presentamos un protocolo para la refrigeración de los experimentos de tasas dependientes elipsometría, que pueden determinar la temperatura de transición vítrea (Tg), la dinámica de la media, la fragilidad y el coeficiente de dilatación del líquido super-enfriado y vidrio para una variedad de materiales vítreos.

Enfriamiento Puntúa Medidas Elipsometría Dependientes para determinar la dinámica de Thin Films vidriosos

Se describe un simple aparato Dewar/criostato de nitrógeno líquido compuesto por un pequeño Dewar óptico de sílice fundida, un termopar y un espectrógrafo de dispositivo de carga acoplada (CCD). Los experimentos para los que está diseñado este Dewar/criostato requieren una carga, congelación y alineación rápidas de la muestra, temperaturas de muestra precisas y estables, y un tamaño/portabilidad pequeños.

Un simple Dewar / Criostato para las muestras térmicamente a temperaturas de equilibrar conocidos para mediciones de luminiscencia criogénicos precisos

Aquí, presentamos un protocolo para describir investigaciones ex situ y en situ las transformaciones estructurales en los vidrios metálicos. Empleamos métodos analíticos basados en nuclear que inspección la interacción hiperfina. Demostrar la aplicabilidad de la espectrometría Mössbauer y dispersión delantera nuclear de Radiación Sincrotrón durante experimentos basados en la temperatura.

Métodos Ex Situ e In Situ las investigaciones de las transformaciones estructurales: el caso de la cristalización de vidrios metálicos

Este protocolo presenta un procedimiento detallado para preparar criomuestras biológicas para experimentos de espectroscopia de absorción de rayos X basados en sincrotrón. Describimos todos los pasos necesarios para optimizar la preparación y criopreservación de muestras con ejemplos del protocolo con células de cáncer y fitoplancton. Este método proporciona un estándar universal de criopreparación de muestras.

Preparación de muestras biológicas para la especiación a temperatura criogénica mediante espectroscopia de absorción de rayos X de alta resolución

El presente protocolo describe la cristalización de cristales de hielo microscópicos e hidratos de clatrato en dispositivos microfluídicos, lo que permite el intercambio de líquidos alrededor de los cristales formados. Esto proporciona posibilidades sin precedentes para examinar el proceso de cristalización y los mecanismos de unión de los inhibidores.

Un enfoque microfluídico para el estudio de la cristalización de hidratos de hielo y clatrato

Los nanocompuestos de CdSe-SnSe se producen mediante la consolidación de partículas de SnSe de ingeniería superficial. Se emplea una síntesis acuosa simple para producir partículas de SnSe. El recubrimiento de partículas de SnSe con complejos moleculares de CdSe permite controlar el tamaño de grano y aumentar el número de defectos presentes en el nanocompuesto, disminuyendo así la conductividad térmica.

CdSe-SnSe policristalino procesado en solución, diseñado en superficie, que exhibe baja conductividad térmica

El objetivo general de este método es determinar la estructura electrónica de baja energía de los sólidos a bajas temperaturas utilizando Ángulo de resolverse la espectroscopia de fotoemisión con radiación sincrotrón.

De ángulo resuelto espectroscopia de fotoemisión a bajas temperaturas

La calefacción celda de yunque de diamante láser combinado con técnicas de micro-difracción sincrotrón permite a los investigadores a explorar la naturaleza y propiedades de las nuevas fases de la materia a la presión y la temperatura (PT) condiciones extremas. Muestras heterogéneas pueden...

Síntesis y microdifracción a presiones y temperaturas extremas

Aprende a medir densidades de fase vítrea en soluciones acuosas a temperaturas criogénicas. Este método permite analizar muestras biológicas pequeñas con enfriamiento rápido para estudios de criobiología.

Medición de las densidades de gafas acuosas a temperaturas criogénicas

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