Un sistema integrado para activar remotamente Transduction de la señal intracelular por fotoactivación de la cinasa mediada por nanopartículas de conversión ascendente

El objetivo de este experimento es demostrar la viabilidad de la fotoactivación de la enzima mediante irradiación de infrarrojo cercano. La proteína quinasa A se inmoviliza en esta superficie de nanopartículas de conversión ascendente microinyectadas en células y se observa la respuesta inducida por la quinasa en células vivas después de la irradiación en el infrarrojo cercano. La fotoactivación tradicional requiere luz ultravioleta fototóxica e, inevitablemente, co-inducirá una reacción química indeseable y una respuesta similar, sin embargo, en nuestras opciones amigables, como la irradiación infrarroja cercana no puede desencadenar una reacción debido a su baja energía.

La nanopartícula de conversión ascendente puede convertir eficazmente el fotón IR cercano de baja energía bioamigable en un fotón UV de alta energía para desencadenar una reacción química cerca de la superficie de la partícula sin irradiación UV directa. La quinasa juega un papel clave en la oncogénesis, esta técnica puede ayudarnos a examinar más información de transducción de señales con un ruido de interferencia mucho menor de la fototoxicidad UV y su reacción secundaria. En general, las personas nuevas en este campo encontrarán dificultades para modificar los instrumentos y la configuración óptica para la aplicación de conversión ascendente.

Para comenzar, instale una lente de objetivo 4x junto al soporte de la cubeta del fluoroespectrómetro, de modo que el láser se pueda enfocar en el centro de la cubeta. Coloque un diodo láser ajustable de 980 nanómetros a 90 grados contra la lente del objetivo. Instale un espejo de reflectancia completa y la intersección de la trayectoria de luz de la lente del objetivo y el láser.

No olvide colocar una placa de metal anodizado para bloquear la ventana de excitación del espectrómetro para proteger las partes interiores. A continuación, coloque una cubeta de solución de nanopartículas de conversión ascendente recubierta de sílice en el soporte. Se puede visualizar un haz de conversión ascendente brillante cuando se enciende el láser.

Cambie la espectroscopia al modo de luminiscencia, con el voltaje PMT más bajo durante las alineaciones. Ajuste las etapas del espejo y del láser para que el haz pase por el centro de la cubeta para que el PMT capte la señal más fuerte. Después de instalar un espejo dicroico y un filtro de excitación, instale un diodo láser de 980 nanómetros en la trayectoria de luz del nivel inferior.

Agregue un colimador entre el láser y el espejo para ayudar a difundir y ampliar el área de irradiación NIR en el plano focal. A continuación, utilice una solución de nanopartículas de conversión ascendente para visualizar el haz infrarrojo cercano. Ajuste la posición de la platina láser para centrar el haz de luz infrarroja cercana y finalizar la alineación.

Realice la síntesis de PKA enjaulada y desmovilice la PKA/UCNP enjaulada, para generar PKA/UCNP enjaulada como se describe en el protocolo de texto. Para medir la actividad de ambos constructos antes de la fotólisis UV, mida la disminución de los absorbentes de NADH en la mezcla de ensayo a lo largo del tiempo después de la adición de dos microlitros de solución de PKA a la mezcla de ensayo. Repita la medición para PKA/UCNP.

A continuación, realice la fotólisis UV a 200 milivatios por centímetro cuadrado de PKA enjaulada y PKA/UCNP enjaulada, en un baño de agua helada, para asegurarse de que se pueda activar la PKA. La actividad de PKA se determina mediante un ensayo acoplado a la enzima piruvato quinasa lactato deshidrogenasa. Con una disminución de los absorbentes de NADH, se mide a lo largo del tiempo después de la adición de la solución de PKA.

Incubar las células en suero bovino fetal al 10% que contenga medio L15 durante el período de microinyección para un control estable del pH fuera de la incubadora. Configure el extractor de agujas para una punta en forma de cono con un diámetro de alrededor de 1,5 micras para una apertura posterior de la punta. Para abrir la punta, instale la aguja en el microinyector, mueva la punta de la aguja en contacto con el borde de un portaobjetos y siga con una perilla suave en la platina del microscopio.

Esta fuerza de vibración es suficiente para romper ligeramente la punta y agrandar la abertura. Examine la abertura de la aguja para asegurarse de que tenga un diámetro externo de 1,3 a 1,5 micras, lo que puede confirmarse mediante imágenes de microscopio con una lente de objetivo de 40x. A continuación, ajuste la presión de inyección de 50 a 75 hectopascales con un intervalo presurizado de 200 a 300 milisegundos y ajuste la presión de compensación constante de 15 a 30 hectopascales para evitar el reflujo del medio en la aguja.

Cargue el complejo PKA/UCNP enjaulado con tinte TAMRA en la posición posterior de la aguja. A continuación, la aguja cargada se coloca en un micromanipulador hidráulico de un eje, con un ángulo de 30 grados a 45 grados. Revise la aguja con un microscopio para asegurarse de que no se genere ninguna burbuja después de cargar la muestra.

Después de sumergir la aguja en el medio, cambie al modo de fluorescencia, para confirmar una liberación de ráfaga de tinte cuando se aplica presión de inyección y una liberación lenta de tinte cuando se aplica presión de compensación constantemente. A continuación, cambie al modo de campo claro contrastado en fase para iniciar la microinyección celular. La onda de choque de la membrana se puede observar en inyecciones exitosas.

Lave las células dos veces y compruebe si las células inyectadas han coinyectado fluorescencia TAMRA para localizar con éxito las células microinyectadas. La célula con admisión de UCNP pero sin una señal de colorante coinyectado, indica que la membrana celular se rompió durante la inyección y debe excluirse de otros experimentos. Irradie las células con un diodo láser de 980 nanómetros en la trayectoria de luz del nivel inferior enfocada por una lente de objetivo de 10x durante 15 minutos.

Deje un intervalo de oscuridad de cinco minutos después de cada cinco minutos de irradiación para evitar el calentamiento. Si se necesita un tiempo de activación más corto, como segundos o incluso subsegundos, simplemente cambie a una lente de objetivo de 40x para una mayor densidad de fotones de enfoque. Después de la fotólisis y la recuperación celular, fije las células en un mililitro o 4% de paraformaldehído en PBS durante 20 minutos, antes de seguir con alexa 594 dentro de la tinción.

Por último, visualice la desintegración de las fibras de tensión inducida por NIR. Después de la irradiación NIR, las células microinyectadas con PKA/UCNP enjaulado, como se indica con flechas blancas, muestran una emisión de conversión ascendente. La desintegración de las fibras de tensión causada por una fotoactivación exitosa de PKA NIR, expone más f actina y, en consecuencia, da como resultado una fuerte tinción verde cerca de UCNP.

Un control negativo donde las células se microinyectan pero permanecen en la oscuridad, no muestran desintegración de las fibras de estrés. El nivel de exposición a la f actina después de la fotoactivación de NIR se puede teñir con alexa 594 seguido y cuantificado por la imagen J. Se trazaron curvas de intensidad de la tinción de f actina a lo largo de la flecha roja, proporcionando información cuantitativa de la desintegración de las fibras de estrés que se puede correlacionar con la actividad de PKA inducida por NIR. Una vez familiarizado con la microinyección, esta técnica se puede realizar en un día, incluida la preparación y el control de calidad de la PKA/UCNP enjaulada.

Con nuestras instrucciones para las modificaciones de nuestros instrumentos y los experimentos, la reacción deseada puede ser desencadenada por el infrarrojo cercano, con una resolución temporal altamente espacial como la radiación UV tradicional para los métodos de valoración, pero sin la fototoxicidad, no es contagiosa. Después de ver este video, espero que tenga una buena comprensión de cómo administrar un complejo de nanopartículas enzimáticas en una célula mediante microinyección y fotoactivar la enzima, utilizando luz infrarroja cercana compatible con campana. Esta técnica allanó el camino para los investigadores en el campo de la biología química, que necesitan utilizar la luz para desencadenar la reacción enzimática deseada en las células vivas para la resolución espacio-temporal cuando la célula no puede tolerar la fototoxicidad UV.

Siguiendo este procedimiento, se pueden asociar otros bio afectadores a la nanopartícula de conversión ascendente, para responder a preguntas adicionales que necesitan fotoactivación espacio-temporal. Si el bioafector funciona extracelularmente, ni siquiera es necesaria la microinyección. La plataforma de fotoactivación de infrarrojo cercano también puede proporcionar una mayor profundidad de penetración en el tejido y, por lo tanto, se puede aplicar en animales pequeños para desencadenar las reacciones deseadas en el momento y el lugar dados.