Name: Un sistema integrado para activar remotamente Transduction de la señal intracelular por fotoactivación de la cinasa mediada por nanopartículas de conversión ascendente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Aprende a fotoactivar cinasa A en células vivas mediante nanopartículas de conversión ascendente e irradiación infrarroja cercana. Este método reduce la fototoxicidad del UV y permite estudiar vías de señalización intracelular con mayor precisión.

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Agradecemos a la Nano Ciencia y tecnología programa de Academia Sinica y el Ministerio de ciencia y tecnología de Taiwán por los fondos (101-2113-M-001-001-MY2; 103-2113-M-001-028-MY2).

Nota: el protocolo describe una modificación de la instrumentación detallada de fotoactivación asistida de upconversion, un procedimiento sintético para generar enjaulado PKA-UCNP, microscopía electrónica de transmisión (TEM) de la UCNP recubierto de silicona y enjaulado PKA UCNP muestras, configuración de fotólisis UV y NIR, preparación celular, microinyección de PKA UCNP, un estudio de fotoactivación y la fibra de estrés tinción de células REF52.
 1. configuración de Fluorímetro para la medición de espectro de Upconversion <ol><li>instalar un objetivo X 4 junto al titular de la cubeta del espectrómetro de fluorescencia de modo que el láser se concentra en el centro de la cubeta.</li>
	<li>Colocar un diodo láser sintonizable de 980 nm 0.5 - 8 W 90° contra el objetivo. 
	PRECAUCIÓN: El operador debe tener conocimiento de seguridad láser y NIR láser gafas.</li>
	<li>Instalar un espejo completo de la reflectancia en la intersección de la trayectoria de la luz de la lente del objetivo y láser. Colocar una placa de metal anodizada negro para bloquear la ventana de la excitación de la espectroscopia y a proteger las partes interiores.</li>
	<li>Coloque la cubeta de sílice recubiertas solución UCNP (0.2 - 0.6 mg/mL) en el portacubetas para que un haz luminoso upconversion puede visualizarse y puede utilizarse para ajustar la mejor alineación de luz para la instalación de espejo.</li>
	<li>Cambiar la espectroscopia al modo de luminiscencia con ajuste de voltaje más bajo de PMT (ajuste para un ajuste más alto si la señal es demasiado débil). Ajuste el espejo a la mejor alineación, donde la viga está en el centro de la cubeta y el PMT recoge la señal más fuerte.</li>
	<li>Medir el espectro de conversión ascendente, después de la alineación, con la configuración deseada. Utilice un medidor de potencia térmica de la pila para construir una curva de calibración de potencia del láser contra la lectura corriente eléctrica en la alimentación del láser. Controlar constantemente el rendimiento del láser para asegurarse de que el rendimiento está dentro del rango calibrado.</li>
</ol> 2. Configuración del microscopio Nota: la siguiente configuración funciona para microscopios equipados con un camino óptico de dos niveles. Si el usuario tiene la intención de instalar un interruptor de la fuente de luz de excitación en el puerto trasero para que el láser NIR y la lámpara de haluro de compartir el mismo puerto, el colimador en el puerto trasero significativamente bloqueará el NIR, porque está diseñado para reducir el calentamiento de la muestra. El usuario debe hacer una elección difícil: mantener el colimador y sufren de upconversion muy baja eficacia, o quitar el colimador y sacrificar la intensidad de la excitación de la epifluorescencia.
 Nota: un diagrama de corte que muestra el esquema de la trayectoria de la luz para un spectrofluorometer modificado, la microscopia para luminiscencia upconversion y modo de fotólisis NIR y epifluorescencia y modo de fotólisis UV y la configuración experimental utilizado para este experimento se ilustra en la figura 2.
Guía <ol><li>Equip el microscopio de fluorescencia con una luz de halogenuros metálicos, dirigido en la parte trasera Puerto 
	Nota: en este camino de luz de nivel superior donde hay una torreta de cubo, una posición de cubo debe estar vacía para permitir NIR desde el reinado de luz de menor nivel</li>
	<li>Instalar un diodo de láser sintonizable de 0.5 a 8.0 W 980 nm en el puerto del lado derecho, con el colimador de puerto lateral abierto. 
	Nota: Esto aumenta el láser luz punto a alrededor de 500 μm de diámetro cuando se utiliza un objetivo de 10 X. Este colimador resulta en un punto ligero de la gama del micrómetro y hace impracticable la irradiación celular NIR. Este colimador es NIR transparente.</li>
	<li>Instale un espejo dicroico (corto-pase de 850 nm) y un filtro de la excitación (paso largo 950 nm) en el reinado de luz de menor nivel</li>
	<li>Use una solución UCNP para visualizar el punto de luz NIR. Ajuste la posición del láser el haz de luz NIR en el campo de visión para terminar la alineación del centro.</li>
</ol> 3. Preparación y caracterización de enjaulado PKA UCNP construcción de <ol><li>PKA recombinante incubar (9 μm) con 0,5 mM 2-nitrobenzylbromide (NBB) en jaulas de búfer (20 mM Tris-HCl, NaCl 100 mM y 10 mM de MgCl 2, pH 8,5) durante 1-2 h a 25 ° C. Quench el NBB exceso con 10 mM dthiothreitol (DTT) y luego dializarse contra 4-(2-hidroxietil) buffer ácido piperazina-1-(n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido (HEPES) (10 mM, pH 7.5) para eliminar el exceso reactivos y sales. 
	Nota: El pH de la solución de jaulas se baja de 8.5 a 7.5 durante diálisis con pH HEPES 7,5 para la reacción de inmovilización posterior.</li>
	<li>Mix el lantánido Y(CH3CO2) sales 3 hydrate (99.9%, g 0,4527, 1.38 mmol), Yb (CH 3 CO 2) 3 hidrato (99.9%, g 0,2533, 0.60 mmol) y Tm (CH 3 CO 2) 3 hidrato (99.9%, g 0,0168, 0.02 mmol)-Octadeceno (30 mL) y ácido oleico (12 mL), la mezcla a 115 ° C durante 30 minutos y enfriar a 50 ° C. A continuación, disolver la mezcla de reacción en una solución metanólica (20 mL) con 0,2 g (5,0 mmol) de NaOH pellet y 0,2964 g (8 mmol) de fluoruro de amonio por sonicación durante 15 minutos subir la temperatura de reacción a 300 ° C para obtener la base UCNP (β-NaYF 4 : 1.0% Tm 3 + / 30% Yb 3 +) nanopartículas.</li>
	<li>Disolver las nanopartículas núcleo (25 mg) con CO-520 (0,5 mL) en ciclohexano (10 mL). Agregar amoníaco (wt 30% v/v, mL 0,08) y tetraethylorthosilicate (TEOS, 0,04 mL) y aplicar agitación constante durante 12 h a temperatura ambiente para obtener el β-NaYF recubierto de silicona 4: 1.0%Tm 3 + /30%Yb 3 + base nanopartículas.</li>
	<li>Incubar el PKA (6 nmol) o enjaulado PKA (6 nmol) con UCNP (1 mg) 15 en tampón HEPES (10 mM, pH 7,5) a 4 ° C por 3 h para inmovilizar la PKA en el revestimiento de sílice UCNP mediante interacciones electrostáticas.</li>
	<li>Filtra la mezcla utilizando filtro de PVDF (0.45 μm), centrifugar a 17.000 x g por 10 min a 4 ° C y redisperse el pellet en estabilizador de proteínas 0,1% que contienen HEPES (50 μL, 10 mM, pH 7.5) para obtener el complejo PKA UCNP purificado. Centrifugue a 17.000 x g por 10 min a 4 ° C y recoger el sobrenadante para un ensayo de Bradford en un tubo de 1,5 mL.</li>
	<li>Analizar la PKA ilimitada en sobrenadante salvado de paso 3.5 con un ensayo de Bradford para espalda-para calcular el nivel de sustitución de PKA en las partículas UCNP, que normalmente tienen un nivel de sustitución de ~ 4.5 nmol de PKA por mg de partículas. 
	Nota: El ensayo de Bradford revela un fuerte color azul en las pelotillas, que sugiere una inmovilización de proteínas nivelada y estable sin la desorción, mientras que la fracción sobrenadante del enjaulado PKA UCNP solución muestra un color similar a () buffer HEPES figura 4 c-4e).</li>
</ol> 4. Caracterización Nota: el ensayo de quinasa se utiliza para cuantificar la actividad específica de la cinasa del piruvato. En Resumen, la fosforilación del péptido, que se acopla a la piruvato quinasa y lactato deshidrogenasa, resulta en la oxidación de NADH. Formación de este último se controla midiendo la disminución de absorbancia del NADH a 340 nm.
<ol><li>Determine la actividad de la PKA y PKA UCNP en un volumen total de 60 μL de mezcla de ensayo que contiene ácido 4-morpholinepropanesulfonic (MOPS, 100 mM, pH 7.5), KCl (100 mM), fosfoenolpiruvato (PEP, 1 mM), trifosfato de adenosina (ATP, 1 mM), β - nicotinamida adenina dinucleótido reducido forma (NADH, 0,8 mM), cloruro de magnesio (MgCl 2, 1 mM), kémptido (0,4 mM) y una mezcla de deshidrogenasa de piruvato cinasa/lactato (30/40 unidades de PK/LDH).</li>
	<li>Medir la disminución de absorbancia del NADH en el tiempo después de la adición de solución PKA (2 μL) a la mezcla de ensayo. Calcular la pendiente de la línea para reflejar directamente la actividad de la quinasa se mide.</li>
	<li>Medir la actividad de PKA UCNP 15 y la actividad general, que debe combinarse bien con el producto de la multiplicación de la actividad de PKA-específicas nativa y la cantidad de superficie cubierta de PKA calculada.</li>
</ol> 5. Configuración de fotólisis Meas <ol><li>URE toda la energía de la luz fuentes usando un sensor termal de la pila y calcular densidades de potencia (PD = potencia (W) / área (cm 2)) 18 según la luz spot.</li>
	<li>Realizar los experimentos en vitro UV fotólisis en un sistema comercial con 365 nm LED (200 mW/cm 2) 15.</li>
	<li>UV para la fotoactivación en la platina del microscopio, iluminar la solución UCNP PKA con la excitación de luz filtrada por un cubo comercial 15. 
	Nota: La densidad de energía es ~ 15 mW/cm 2, sin objetivo concentrarse.</li>
	<li>Para en vitro fotoactivación NIR en la platina del microscopio, iluminar la solución de PKA UCNP utilizando láser 980 nm con la configuración de filtro/espejo upconversion personalizado instalado en el menor nivel de paso de luz, un espejo dicroico (850 nm corta pasa), y un filtro de la excitación (950 nm paso largo). 
	Nota: La densidad de potencia de salida es 5 W/cm 2 antes de 4 X objetivo enfocar. Se estima la densidad de energía ~ 68 W/cm 2 4 X objetivo enfoque.</li>
</ol> 6. Preparación de la muestra y microinyección de PKA UCNP complejos de la célula <ol><li>prefiltro las muestras a través de un filtro de 0.45 μm después de la inmovilización de PKA (paso 3.5).</li>
	<li>Incubar las células en 10% de suero bovino fetal (FBS) que contiene L-15 medio durante el período de microinyección para control del pH estable fuera de la incubadora. 
	Nota: para confirmar la realización de la microinyección, conjuntamente inyectar el PKA-UCNP nativo enjaulado PKA-UCNP y PEGylated UCNP (7.5 mg/mL) 15 6 5-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) (10 μm) en células.</li>
	<li>Ajustar la concentración de las partículas de PKA UCNP tal que, después de la microinyección, la concentración citosólica es 1-3 μM PKA - un rango de concentración fisiológica de PKA en una celda, con la suposición de que el volumen de inyección es 1/10 del volumen celular .</li>
	<li>Realizar la microinyección en células (paso 6.2) usando un dispositivo microinyector acoplado con un micromanipulador hidráulico de un eje ( figura 3).</li>
	<li>Usar un calibrador de presión digital para controlar la presión ejercida por la microinyectora es en el rango de operación (~ 50-200 hPa) y sello de la válvula de dispensador en una cámara ejerciendo presión sobre personalizada para proporcionar presión de compensación para la microinyección. Tire hacia atrás la aguja utilizando un extractor.</li>
	<li>Mantener la presión de inyección entre 50 y 75 hPa, con un tiempo de inyección de 200-300 ms y la presión de compensación en 15 hPa para evitar el reflujo del medio de cultivo en aguja por acción capilar.</li>
	<li>Examinar los orificios de la punta de las agujas para asegurar que tienen un diámetro exterior entre 1,3 y 1,5 μm, que puede confirmarse al tomar imágenes con una lente objetivo de 40 x.</li>
	<li>Lavar las células con 2 mL de medio de L-15 que contiene 10% FBS después de la microinyección. Observar la proyección de imagen de fluorescencia celular desde 5 (6) - carboxytetramethyl - rodamina (TAMRA) para confirmar la realización de la microinyección.</li>
</ol> 7. Fotoactivación de enjaulado PKA UCNP usando UV o luz NIR en células viven fotoactivación <ol><li>de UV después de la microinyección de PKA UCNP, crecen las células REF52 en un plato de 3,5 μm, los coloca en la platina del microscopio e irradiar con luz ultravioleta filtrada por el cubo por 3 min sin objetivo concentrarse. 
	Nota: REF52 células fueron mantenidas en DMEM con 10% SBF a 37 ° C en un incubador de 5% CO 2 y las células fueron subcultivadas cuando la confluencia alcanza a un 90% cada 2-3 días.</li>
	<li>NIR para la fotoactivación después de la microinyección de PKA UCNP, iluminar las células en un láser de 980 nm de configuración de filtro/espejo de menor nivel, como se describe en el paso 5.4. 
	Nota: La potencia de la densidad es 5 W/cm 2 antes de 10 X objetivo centrado y se estima que 300 W/cm 2 después de 10 x objetivo centrado. Conversión ascendente es un proceso que requiere una densidad de fotones alta, especialmente cuando es necesario un cambio de anti-Stoke más grande. Por lo tanto, enfocarse es necesario durante la fotoactivación.</li>
	<li>Cuando es necesario un punto de luz más grande (650 μm x 520 μm), irradiar estas células con NIR enfocado por una lente objetivo de 10 x con un colimador para permitir a 15 minutos para un intervalo oscuro de 5 min después de la irradiación de cada de 5 min para evitar el calentamiento. 
	Nota: Cuando una alta resolución espacial (punto ligero subcelular) es necesario, utilizar el objetivo de 40 X con un agujero de alfiler instalado en el extremo de salida de la guía de luz para generar un punto de luz dimensión subcelular (5 μm x 4 μm). En este caso, 1 s de irradiación es suficiente para la fotoactivación NIR por el alto flujo de fotones.</li>
	<li>Fotólisis UV después o NIR, permiten a las células a recuperar en una 5% CO 2 incubadora a 37 ° C por 1 h en medio completo para generar respuestas celulares. Posteriormente, fijar en 1 mL de 4% paraformaldehido/fosfato-buffer salina (PBS) por 20 min antes de la tinción más. 
	PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es altamente tóxico; Evite el contacto con la piel, ojos o membranas mucosas. Evite respirar el polvo durante la preparación y medición.</li>
</ol> 8. Visualización de estrés fibra desintegración causada por fotoactivación de NIR <ol><li>después de la fijación, utilizar Alexa 594-phalloidin (Añadir 5 μl de la solución madre de 6.6 μm a 200 μL de PBS para tinción, incubar durante 25 min a temperatura ambiente) a la mancha y visualizar las fibras de estrés. Visualizar las imágenes de Alexa 594-phalloidin (Ex 581 nm/Em 609 nm) usando un sistema de filtro.</li>
	<li>Incubar las células por 5 min en 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) a temperatura ambiente. Después de teñir, lavar las muestras con PBS y tomar por separado imágenes fluorescentes de las fibras de estrés y núcleos.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Previamente, Hofmann y compañeros de trabajo encontraron que cambios morfológicos dramáticos fueron observados en células REF52 después de la microinyección de la PKA gratis19. En otro estudio, el grupo de Lawrence demostró que PKA enjaulado puede ser activado en vivo, lleva a cambios morfológicos y la desintegración de las fibras de estrés cuando es expuesto a UV fotólisis20de. Anteriores informes sobre explotación de UV de producir luz por fotoactivación demostra...

Proteínas químicamente modificadas que pueden ser fotoactivado (por ejemplo, proteínas PKA enjaulado) se han desarrollado como un campo emergente en Biología química a manipular no invasiva los procesos bioquímicos intercelulares1,2 ,3. Usando la luz como un estímulo ofrece excelente resolución espaciotemporal al activar estos enjaulado proteínas. Sin embargo, la luz UV puede causar no deseados cambios morfológicos, apoptosis y daño en el ADN a las células4,5. Por lo tanto, los acontecimientos recientes en el diseño de grupos de photocaging se centran en que fotorrotura sobre excitación de longitud de onda más largas o dos fotones para reducir fototoxicidad, así como para aumentar la penetración de tejido profundo6,7. Grupos de jaulas que responden a la longitud de onda más largo permitiendo elegir convenientes uncaging las longitudes de onda (es decir, canales) selectivamente activan bioeffectors cuando dos o más grupos de jaulas son presente7. Teniendo en cuenta estas características útiles, desarrollar nuevos grupos de photocaging de la luz roja es muy importante trabajo aguas arriba en fotoquímicas metodologías para estudios biológicos, que van desde los mecanismos de las reacciones para controlar las actividades celulares8de sondeo. Sin embargo, un grupo de jaulas de dos fotones es normalmente demasiado hidrofóbico debido a la estructura de anillo aromático fusionado, y un grupo de jaulas de luz visible es normalmente organometálicos con ligandos aromáticos. Esta propiedad hidrofóbica/aromático no es adecuada cuando la bioeffector es una proteína o enzima, ya que desnaturaliza el sitio de activación de la enzima/proteína y causa pérdida de la función, aunque la conjugación y fotólisis todavía trabajan en el nivel químico2 ,9.
UCNPs son eficaces transductores que convierten la luz de excitación NIR a los rayos UV. Esta propiedad única y fascinante de UCNPs ha ofrecido resoluciones realistas para enfrentar los retos asociados con fotoactivación y desencadena la liberación controlada de moléculas pequeñas, incluyendo ácido fólico10, derivados del cisplatino11 , ADN/siRNA12copolímero vesículas13y partículas huecos14. Sin embargo, a lo mejor de nuestro conocimiento, la fotoactivación UCNP asistida de enzimas o proteínas no ha sido probado hasta ahora. Porque no hay ningún caso exitoso de usar luz roja o NIR a fotoactivos enzima, nos impulsó a realizar la activación activa NIR de una construcción de la proteína/enzima compuesta por complejos de enzima enjaulado químicamente modificado con una cubierta de sílice, dopados con lantánidos UCNP15. En este estudio, el UCNP fue conjugado con una quinasa de transducción de señal rápidamente reaccionando en forma de PKA enjaulado. PKA controla la síntesis de glicógeno y citoesqueleto Reglamento que responde a los estímulos externos vía regulación del fosfato (campo) de adenosina cíclica en el citosol16. Se estudió la viabilidad de la activación de la enzima de formas temporales y espaciales en un experimento de celular después de la irradiación NIR. Esta plataforma asistida UCNP fotoactivación es una nueva metodología para Fotoactivar enzima usando NIR y evita la respuesta de transducción de señal no deseada de las células causadas por convencionales UV irradiación2,4.
Es muy difícil que translocan grande bioeffectors (p. ej., proteínas) a través de la membrana de la célula para controlar la actividad celular. Aunque la proteína inmovilizada de partícula puede ser más fácil que translocan a través de endocitosis en el citosol, endocitosis pueden dañarse o degradarse vía endosomal atrapamiento y la consiguiente degradación lisosomal2,4. Aunque la proteína enjaulada es todavía funcional después de translocación de membrana, las cantidades translocadas pueden no ser suficiente para desencadenar la respuesta celular2,17. En contraste, microinyección es un acercamiento directo y cuantitativo para ofrecer grandes bioeffectors al citoplasma de la célula. Además, bioeffector inmovilizado UCNP requiere producir luz para activarse. Por lo tanto, la instrumentación óptica adicional requiere modificación para medir, visualizar y utilizar la luz de upconversion. En este trabajo, la entrega de un complejo de PKA UCNP enjaulado en una celda utilizando microinyección y las siguientes modificaciones esenciales, microscopia y espectroscopia de NIR fotoactivación se describen en detalle.

<table><tbody><tr><td><reactivo >fuerte</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)aminometano</td><td>Sigma</td><td>154563</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidratado</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma</td><td>12636</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de itrio&nbsp; hidrato</td><td>Sigma</td><td>326046</td><td>Y(C2H3CO2)3 &middot; xH2O</td></tr><tr><td>Acetato de tulio (III) hidrato</td><td>Alfa Aesar</td><td>14582</td><td>Tm(CH3CO2)3 y middot; xH2O</td></tr><tr><td>Acetato de iterbio (III) tetrahidrato</td><td>Sigma</td><td>326011</td><td>Yb(C2H3O2)3 &middot; 4H2O</td></tr><tr><td>1-Octadecene</td><td>Sigma</td><td>O806</td><td></td></tr><tr><td>Ácido oleico</td><td>Sigma</td><td>364525</td><td></td></tr><tr><td>Metanol&nbsp;</td><td>macron</td><td>304168</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma</td><td>30620</td><td></td></tr><tr><td>Fluoruro de amonio</td><td>J.T.Baker</td><td>69804</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL&nbsp; CO-520</td><td>Sigma</td><td>238643</td><td></td></tr><tr><td>Ciclohexano</td><td>J.T.Baker</td><td>920601</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de amonio (28% - 30%)</td><td>J.T.Baker</td><td>972101</td><td></td></tr><tr><td>Ortosilicato de tetraetilo</td> de amoníaco (TEOS)<td>Sigma</td><td>8658</td><td></td></tr><tr><td>DL-Ditiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>N-hidroximaleimida (NHM)</td><td>Sigma</td><td>226351</td><td>PKA reactivo bloqueante de actividad</td></tr><tr><td>Prionex solución estabilizadora de proteínas a partir de colágeno de cerdo</td><td>Sigma</td><td>81662</td><td>Solución estabilizadora</td></tr><tr><td>de proteínas 2-bromuro de nitrobencilo (NBB)</td><td>Sigma</td><td>107794</td><td>PKA reactivo para jaulas</td></tr><tr><td>8-(4-clorofeniltio)adenosina 3&prime;,5&prime;-monofosfato cíclico sal sódica</td><td>Sigma</td><td>C3912</td><td>8-CPT-cAMP</td></tr><tr><td>Piruvato quinasa/deshidrogenasa láctica enzimas de músculo de conejo</td><td>Sigma</td><td>P0294</td><td>PK/LDH</td></tr><tr><td>Adenosina 5'-trifosfato disódico</td><td>Sigma</td><td>A2387</td><td>ATP</td></tr><tr><td>&beta;-NADH reducido de dipotasio</td><td>Sigma</td><td>N4505</td><td></td></tr><tr><td>Fosfoenolpiruvato</td><td>Sigma</td><td>P7127</td><td>PEP</td></tr><tr><td>Reactivo de ensayo de proteínas Coomassie, 950 mL</td> Reactivo de ensayo <td>Thermo Scientific</td><td>23200</td><td>Bradford</td></tr><tr><td>Proteína quinasa dependiente de AMPc</td><td>Promega</td><td>V5161</td><td>Control de la actividad PKA</td></tr><tr><td>PET15b-PKACAT plásmido</td><td>Addgene</td><td>#14921</td><td></td></tr><tr><td>PKaede-MC1 plásmido</td><td>CoralHue</td><td>AM-V0012</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7.4</td><td>Thermo Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glucosa alta, piruvato</td><td>Gibco</td><td>12800-017</td><td>Cell medio de cultivo</td></tr><tr><td>Leibovitz L-15 Medio</td><td>Biological Industries</td><td>01-115-1A</td><td>Medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Industrias Biológicas 04-001-1A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>ACROS</td><td>416785000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>Colorante de tinción de núcleo</td></tr><tr><td>Alexa 594-phalloidina</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td>Colorante de tinción de F-actina</td></tr><tr><td>5(6)-Carboxitetrametilrodamina&nbsp;</td><td>Novabiochem</td><td>8.51030.9999</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Coomassie (Bradford) Kit de ensayo de proteínas</td><td>Thermo Scientific</td><td>23200</td><td></td></tr><tr><td>CelluSep T4 Tubos/Clasificación nominal del filtro MWCO 12,000 - 14,000 Da Membrane</td><td>Filtration Products, Inc.</td><td>1430-33</td><td>Membrana de diálisis</td></tr><tr><td>Millex-HV Unidad de filtro de jeringa, 0,45 y micro; m, PVDF, 13 mm, EMD esterilizado por rayos gamma</td><td>Milipore</td><td>SLHVX13NL</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</fuerte>Dispersión dinámica de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>la luz/Zetapotential Zetasizer nano-ZS</td><td>Malvern</td><td>M104</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de transmisión</td><td>JEOL</td><td>JEM-1400</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro de fluorescencia</td><td>Agilent Technologies 10075200</td><td></td><td>Cary Eclipse &nbsp;</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro UV-Vis</td><td>Agilent Technologies 10068900</td><td></td><td>Cary 50&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia</td><td>Olympus</td><td>IX-71</td><td></td></tr><tr><td>950 nm filtro de paso largo&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>FEL0950</td><td></td></tr><tr><td>espejo dicroico de 850 nm paso corto</td><td>Chroma</td><td>NC265609</td><td></td></tr><tr><td>RT3 color Sistema CCD</td><td>SPOT</td><td>RT2520</td><td></td></tr><tr><td>Iluminación de fluorescencia</td><td>PRIOR</td><td>Lumen 200</td><td></td></tr><tr><td>980 nm Láser de diodo infrarrojo</td><td>CNI</td><td>MDL-N-980-8W</td><td></td></tr><tr><td>UV LED Fuente de luz puntual</td><td>UVATA</td><td>UVATA-UPS412</td><td>Con un LED UPH-056-365 nm a 200 mW/cm2</td></tr><tr><td>Sensor térmico de pila</td><td>OPHIR</td><td>12A-V1-ROHS</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Parker Hannifin</td><td>052-0500-900</td><td>Sistemas de dispensación de microinyección intracelular</td></tr><tr><td>PC-10 Tirador de aguja</td><td>Manómetro Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Manómetro digital</td><td>Lutron</td><td>PM-9100</td><td></td></tr><tr><td>Un eje Micromanipulador hidráulico de aceite</td><td>Narishige</td><td>MMO-220A</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Fresco 17 Centrífuga, refrigerada</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002421</td><td></td></tr></tbody></table>

un sistema integrado para activar remotamente transduction de la señal intracelular por fotoactivación de la cinasa mediada por nanopartículas de conversión ascendente

An Integrated System to Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction by Upconversion Nanoparticle-mediated Kinase Photoactivation

Upconversion nanopartículas (UCNP)-mediada de la fotoactivación es un nuevo enfoque a distancia control bioeffectors con mucho menos fototoxicidad y con una penetración más profunda del tejido. Sin embargo, la instrumentación existente en el mercado no es fácilmente compatible con la aplicacion de upconversion. Por lo tanto, modificar el instrumento disponible en el mercado es esencial para esta investigación. En este artículo ilustramos primero las modificaciones de un Fluorímetro convencional y microscopio de fluorescencia para hacerlos compatibles para los experimentos de upconversion del fotón. A continuación se describe la síntesis de un infrarrojo cercano (NIR)-desencadenó la jaula de la proteína kinase A subunidad catalítica (PKA) inmovilizada en un complejo UCNP. Parámetros para la microinyección y NIR fotoactivación procedimientos también se divulgan. Después de la PKA-UCNP enjaulado es microinyectado en células de fibroblastos REF52, la irradiación NIR, que es significativamente superior a la irradiación UV convencional, eficientemente activa la vía de transducción de señal PKA en las células vivas. Además, experimentos de control positivos y negativos confirma que la vía inducida por la PKA llevando a la desintegración de las fibras de estrés se activa específicamente por la irradiación NIR. Así, el uso de proteína modificada UCNP proporciona un enfoque innovador para remotamente controlar experimentos celulares luz modulada, en la que debe evitarse la exposición directa a los rayos UV.

El diseño de la construcción de la enzima-UCNP enjaulado se ilustra en la figura 1. La enzima PKA se reaccionó primero con 2-Nitrobencilo bromuro para generar un PKA inactiva enjaulado, y luego fue electrostático inmovilizada en la superficie de UCNP. UCNPs emitir la luz convertida y en consecuencia photolytically hienden los grupos Nitrobencilo o Cys 199 y Cys 343, generando la PKA activada. Imágenes TEM y el análisis de Bradford confirman que el PKA y el PK...

En este protocolo, jaula de la proteína quinasa A (PKA), un bioeffector de transducción de señal celular, fue inmovilizada en una superficie de nanopartículas, microinyectado en el citosol y activado por producir UV luz de radiación de infrarrojo cercano (NIR), induciendo desintegración de la fibra de estrés aguas abajo en el citosol.

Un sistema integrado para activar remotamente Transduction de la señal intracelular por fotoactivación de la cinasa mediada por nanopartículas de conversión ascendente

Upconversion nanoparticle (UCNP)-mediated photoactivation is a new approach to remotely control bioeffectors with much less phototoxicity and with deeper ...

El objetivo de este experimento es demostrar la viabilidad de fotoactivar una enzima mediante irradiación con luz infrarroja cercana. La proteína quinasa A encapsulada se inmoviliza sobre la superficie de nanopartículas de conversión ascendente microinyectadas en células, y se observa la respuesta inducida por la quinasa en células vivas tras la irradiación con luz infrarroja cercana. La fotoactivación tradicional requiere luz ultravioleta fototóxica y, inevitablemente, induce simultáneamente reacciones químicas indeseables y respuestas similares; sin embargo, en nuestra alternativa más segura, como la irradiación con luz infrarroja cercana, no se pueden desencadenar reacciones debido a su baja energía.La nanopartícula de conversión ascendente puede convertir eficazmente el fotón cercano al infrarrojo de baja energía, compatible con sistemas biológicos, en un fotón ultravioleta de alta energía para desencadenar una reacción química cerca de la superficie de la partícula sin necesidad de irradiación ultravioleta directa. Dado que las quinasas desempeñan un papel clave en la oncogénesis, esta técnica puede ayudarnos a examinar mayor información sobre la transducción de señales con un ruido interferente mucho menor proveniente de la fototoxicidad ultravioleta y sus reacciones secundarias. Por lo general, las personas nuevas en este campo enfrentarán dificultades al modificar los instrumentos y el montaje óptico para aplicaciones de conversión ascendente.Para comenzar, instale un objetivo de 4x junto al portacubetas del fluoroespectrómetro, de modo que el láser pueda enfocarse en el centro del cubeta. Coloque un diodo láser ajustable de 980 nanómetros a 90 grados respecto al objetivo. Instale un espejo de reflectancia total y la intersección del trayecto de la luz entre el objetivo y el láser.No olvide colocar una placa de metal anodizado para bloquear la ventana de excitación del espectrómetro y proteger las partes internas. Luego, coloque una cubeta con una solución de nanopartículas de conversión ascendente recubiertas de sílice en el soporte. Se puede visualizar un haz brillante de conversión ascendente cuando se enciende el láser.Cambie la espectroscopía al modo de luminiscencia, utilizando el voltaje más bajo del PMT durante los alineamientos. Ajuste los espejos y las etapas del láser para que el haz pase por el centro de la cubeta, de modo que el PMT capte la señal más intensa. Después de instalar un espejo dicróico y un filtro de excitación, instale un diodo láser de 980 nanómetros en la trayectoria de luz de la capa inferior.Agregue un colimador entre el láser y el espejo para ayudar a difundir y ampliar el área de irradiación de infrarrojo cercano en el plano focal. Luego, utilice una solución de nanopartículas de conversión ascendente para visualizar el haz de infrarrojo cercano. Ajuste la posición de la etapa del láser para centrar el haz de luz de infrarrojo cercano y finalizar el alineamiento.Realice la síntesis de PKA enjaulada y desmobilice la PKA enjaulada/UCNP, para generar PKA enjaulada/UCNP según se describe en el protocolo del texto. Para medir la actividad de ambos constructos antes de la fotólisis con UV, mida la disminución en la absorbancia de NADH en la mezcla de ensayo a lo largo del tiempo tras la adición de dos microlitros de solución de PKA a la mezcla de ensayo. Repita la medición para PKA/UCNP.A continuación, realice la fotólisis UV a 200 milivatios por centímetro cuadrado de PKA enjaulada y PKA enjaulada/UCNP, en un baño de hielo, para asegurarse de que la PKA pueda activarse. La actividad de la PKA se determina mediante un ensayo acoplado con enzimas piruvato quinasa y lactato deshidrogenasa. Con la disminución de los absorbentes de NADH, se mide el cambio en el tiempo tras la adición de la solución de PKA.Incube las células en medio L15 que contenga 10% de suero bovino fetal durante el período de microinyección para un control estable del pH fuera del incubador. Configure el extractor de agujas para obtener una punta con forma de cono y un diámetro de aproximadamente 1,5 micrones para la apertura posterior de la punta. Para abrir la punta, coloque la aguja en el microinyector, mueva la punta de la aguja hasta que haga contacto con el borde de un portaobjetos y luego realice un leve golpe sobre la platina del microscopio.Esta fuerza de vibración es suficiente para romper ligeramente la punta y agrandar la abertura. Examine la abertura de la aguja para asegurarse de que tenga un diámetro externo entre 1,3 y 1,5 micrones, lo cual puede confirmarse mediante imágenes microscópicas utilizando un objetivo de 40x. A continuación, ajuste la presión de inyección entre 50 y 75 hectopascales con un intervalo de presurización de 200 a 300 milisegundos, y establezca la presión de compensación constante entre 15 y 30 hectopascales para prevenir el retroceso del medio hacia la aguja.Cargue el complejo PKA fotoactivable/UCNP con el colorante TAMRA en la posición posterior de la aguja. A continuación, coloque la aguja cargada en un micromanipulador hidráulico de un eje, con un ángulo comprendido entre 30 y 45 grados. Revise la aguja con el microscopio para asegurarse de que no se generen burbujas tras la carga de la muestra.Después de sumergir la aguja en el medio, cambie al modo de fluorescencia para confirmar una liberación repentina del colorante cuando se aplica presión de inyección y una liberación lenta del colorante cuando se mantiene constantemente una presión de compensación. Luego, cambie al modo de campo brillante con contraste de fase para comenzar la microinyección celular. La onda de choque en la membrana puede observarse en inyecciones exitosas.Lave las células dos veces y revise las células inyectadas en busca de fluorescencia TAMRA co-inyectada para localizar las células microinyectadas con éxito. Las células con admisión de UCNP pero sin señal de colorante co-inyectado indican que la membrana celular se rompió durante la inyección y deben excluirse de experimentos posteriores. Irradie las células con un diodo láser de 980 nanómetros en la trayectoria de luz inferior, enfocado mediante un objetivo de 10x, durante 15 minutos.Permita un intervalo oscuro de cinco minutos tras cada cinco minutos de irradiación para evitar el calentamiento. Si se necesita un tiempo de activación más corto, como segundos o incluso subsegundos, simplemente cambie a un objetivo de 40x para obtener una mayor densidad de fotones enfocados. Tras la fotólisis y la recuperación celular, fije las células en un mililitro de paraformaldehído al 4 % en PBS durante 20 minutos, antes de continuar con la tinción con alexa 594.Finalmente, visualice la desintegración de los filamentos de estrés inducida por el NIR. Después de la irradiación con NIR, las células microinyectadas con PKA fotoencapsulada/UCNP, indicadas por flechas blancas, muestran emisión de conversión ascendente. La desintegración de los filamentos de estrés causada por la exitosa fotoactivación de PKA mediante NIR expone más actina F y, en consecuencia, da como resultado una tinción verde intensa cerca de las UCNP.Un control negativo en el que las células son microinyectadas pero permanecen en la oscuridad muestra que no hay desintegración de las fibras de estrés. El nivel de exposición de la actina F después de la fotoactivación con luz infrarroja cercana (NIR) puede teñirse con alexa 594 y cuantificarse posteriormente mediante Image J. Se trazaron curvas de intensidad de la tinción de actina F a lo largo de la flecha roja, proporcionando información cuantitativa sobre la desintegración de las fibras de estrés que puede correlacionarse con la actividad de PKA inducida por NIR. Una vez familiarizado con la microinyección, esta técnica puede realizarse en un solo día, incluyendo la preparación y el control de calidad de PKA encageada/UCNP.Con nuestras instrucciones sobre las modificaciones del instrumento y los experimentos, la reacción deseada puede desencadenarse mediante luz infrarroja cercana, con una resolución espacial y temporal alta, de forma similar a los métodos de titulación con luz UV tradicional, pero sin la fototoxicidad, y sin ser contagiosa. Después de ver este video, se espera que tenga una buena comprensión de cómo introducir un complejo enzima-nanopartícula en una célula mediante microinyección y activar la enzima con luz infrarroja cercana compatible con el timbre. Esta técnica allanó el camino para los investigadores en el campo de la biología química, que necesitan utilizar luz para desencadenar reacciones enzimáticas deseadas en células vivas con resolución espacial y temporal cuando la célula no tolera la fototoxicidad del UV.Tras seguir este procedimiento, se pueden asociar otros bioactivadores a la nanopartícula de conversión ascendente, para responder a preguntas adicionales que requieran fotoactivación espaciotemporal. Si el bioactivador funciona extracelularmente, ni siquiera se necesita microinyección. La plataforma de fotoactivación por infrarrojo cercano también puede proporcionar una mayor profundidad de penetración en el tejido y, por lo tanto, puede aplicarse en animales pequeños para desencadenar reacciones deseadas en el momento y lugar indicados.

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Investigación

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Bioingeniería

Microscopía multifotónica permite el control de fotones de baja energía con una penetración profunda óptica y fototoxicidad reducido. Se describe el uso de esta tecnología para el etiquetado de células vivas en embriones de pez cebra. Este protocolo se puede adaptar fácilmente para la foto-inducción de varias moléculas que responden a la luz.

De dos fotones basado en fotoactivación en vivo embriones de pez cebra

Este video describe BiFC-PALM, una combinación de microscopía de localización fotoactivada y complementación de fluorescencia bimolecular, para evaluar las interacciones proteína-proteína. BiFC implica la fusión de dos fragmentos de proteínas fluorescentes con dos proteínas de interés que interactúan. Cuando las dos proteínas interactúan, los fragmentos se acercan, lo que permite que las dos partes se unan y reconstituyan una proteína fluorescente funcional. La fluorescencia de un solo...

Microscopía de localización fotoactivada acoplada a la complementación de fluorescencia bimolecular

Demostramos el uso de la microscopía de localización por fotoactivación de fluorescencia (FPALM) para obtener imágenes simultáneas de múltiples tipos de moléculas marcadas con fluorescencia dentro de las células. Las técnicas descritas producen la localización de miles a cientos de miles de proteínas individuales marcadas con fluorescentes, con una precisión de decenas de nanómetros dentro de células individuales.

Imágenes Multicolor Simultáneas de Estructuras Biológicas con Microscopía de Localización de Fotoactivación de Fluorescencia

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Un método &#39;Plug and Play&#39; para crear nanoconjuntos dispersables en agua que contiene un polímero anfífilo, colorantes orgánicos y conversión ascendente Nanopartículas

Este protocolo describe una estrategia optogenética para modular la actividad de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK) durante la diferenciación celular y el desarrollo embrionario de Xenopus . Este método permite la activación reversible de la vía de señalización MAPK en el cultivo de células de mamíferos y en organismos vivos multicelulares, como los embriones Xenopus , con alta resolución espacial y temporal.

Modulación reversible mediada por luz de la vía de la proteína quinasa activada por mitógeno durante la diferenciación celular y<em&gt; Xenopus</em&gt; Desarrollo embrionario

Este protocolo describe un método basado en la proyección de imagen para activar los linfocitos T con photoactivatable péptido-MHC, que precisa control espacio-temporal de la activación de células T.

Control espacial y Temporal de la activación de células T con un agonista de la Photoactivatable

Aquí, presentamos un protocolo para analizar la transferencia de célula a célula de información oscilatoria por control optogenetic y control de la expresión génica en vivo. Este enfoque proporciona una plataforma única para probar una significación funcional de los programas de dinámica gene expresión en sistemas multicelulares.

Un método de Optogenetic para controlar y analizar patrones de expresión génica en las interacciones célula a célula

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Visualización de la proteína quinasa Una actividad en ratones de trabajo fijos en la cabeza utilizando la microscopía de imágenes de por vida con fluorescencia de dos fotones in Vivo

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Un sistema integrado para activar remotamente Transduction de la señal intracelular por fotoactivación de la cinasa mediada por nanopartículas de conversión ascendente (Video) | JoVE Journal

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