Análisis de las interacciones proteína-proteína y co-localización entre los componentes de la separación, estrecha, y adhiere a las uniones en las glándulas mamarias murinas

El objetivo general de este método es determinar si dos o más proteínas de unión intercelular se colocalizan dentro de las células y evaluar más a fondo su interacción física a través de la coinmunoprecipitación. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la biología del campo de las glándulas mamarias, incluidas las funciones que desempeñan las uniones en el desarrollo normal y enfermedades como el cáncer de mama. La principal ventaja de esta técnica es que puede proporcionar información significativa sobre la interacción proteína-proteína in vivo a un costo relativamente bajo.

Para realizar la tinción fluorescente coininmunológica, saque los portaobjetos microscópicos apropiados del congelador. Fije inmediatamente las secciones sumergiéndolas en formaldehído al cuatro por ciento durante 15 minutos a temperatura ambiente. Luego, sumerja los portaobjetos en solución salina tamponada con fosfato a temperatura ambiente.

Deje las diapositivas allí hasta que continúe con el siguiente paso. Rodea cada sección del portaobjetos con una barrera hidrofóbica disponible en el mercado o un bolígrafo de laboratorio repelente al agua. Agregue inmediatamente gotas de PBS al tejido y coloque el portaobjetos en una cámara de histología humana durante el resto del procedimiento.

Bloquee cada sección de tejido con 100 a 200 microlitros de solución salina tamponada con tris y suero somial bovino al tres por ciento, 0,1 % de polisorbato-20, durante 30 minutos a temperatura ambiente. Mientras las muestras se bloquean, prepare las soluciones de anticuerpos primarios y secundarios diluyendo los anticuerpos en TBS 0.1% de polisorbato-20. Después de retirar la solución bloqueante por aspiración, incubar las secciones en 100 a 200 microlitros del anticuerpo primario diluido durante 60 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, retire la solución de anticuerpos primarios por aspiración y lave las secciones con 250 a 500 microlitros de polisorbato TBS al 0,1%-20 durante cinco minutos. Retire la solución de lavado por aspiración antes de repetir el lavado dos veces. Aspirar la solución de lavado e incubar las secciones con 100 a 200 microlitros del anticuerpo secundario conjugado Fluoro-4 apropiado durante 60 minutos a temperatura ambiente.

Después de retirar la solución de anticuerpos secundarios por aspiración, lavar las secciones con 250 a 500 microlitros de TBS 0,1% de polisorbato-20 durante cinco minutos. Retire la solución de lavado y repita dos veces. Repita estos pasos utilizando la combinación adecuada de cuerpos primarios y secundarios para cualquier proteína subsiguiente de interés.

Después de la eliminación del lavado final, realice la tinción de los núcleos incubando la sección con 100 a 200 microlitros de un miligramo por milímetro DAPI y TBS 0.1% de polisorbato-20 durante cinco minutos a temperatura ambiente. Aspire la solución DAPI y monte los portaobjetos utilizando un medio de montaje soluble en agua, no fluorescente, y cubra los deslizamientos. Coloque los portaobjetos planos en un refrigerador a cuatro grados centígrados durante al menos ocho horas.

Proceda a la obtención de imágenes microscópicas de fluorescencia como se describe en el protocolo de texto. Recoja de 500 a 1000 microgramos del lisado y dilúyalo en PBS hasta obtener un volumen final de 200 microlitros en cada tubo de 1,5 mililitros. Agregue el anticuerpo contra el antígeno de interés al primer tubo de lisado y manténgalo en hielo.

Incubar los tubos durante la noche a cuatro grados centígrados en un mezclador de tubos y rodillos a baja velocidad. Al día siguiente, agregue 50 microlitros de perlas magnéticas a los nuevos tubos de 1,5 mililitros para el prelavado. Coloque los tubos que contienen las cuentas en el soporte magnético y deje que las cuentas migren hacia el imán.

Retire el tampón de almacenamiento de las perlas con una pipeta de 200 microlitros. Lave las perlas agregando 500 microlitros de PBS 0.1% polisorbato-20 y agite los tubos vigorosamente durante 10 segundos. A continuación, vuelva a colocar los tubos en el soporte magnético y permita que las perlas migren hacia el imán.

Retire el exceso de tampón de lavado pipeteando con una pipeta de 200 microlitros. Agregue el complejo de reacción de anticuerpos lisados a las perlas e incube durante 90 minutos a temperatura ambiente en el mezclador de rodillos. Después de la incubación, coloque los tubos en el soporte magnético y permita que las perlas migren hacia el imán.

Con una pipeta de 200 microlitros, aspire y deseche el lisado y coloque los tubos en hielo. Lave las perlas dos veces agregando 500 microlitros de PBS, colocando los tubos en el soporte magnético y eliminando el líquido como antes. Durante los pasos de lavado, evite el vórtice y mantenga las muestras en hielo.

Lave las perlas una vez con PBS 0,1%polisorbato-20 sin vórtice y deseche el último tampón de lavado con una punta de pipeta de 200 microlitros. Para eluir, agregue 20 microlitros de glicina ácida 0,2 molar a los tubos y agítelos durante siete minutos en el mezclador de rodillos. Después de centrifugar a alta velocidad durante unos segundos, recoja el sobrenadante en un tubo fresco y helado.

Repita los pasos de lavado y elución para cada tubo. A continuación, añada 10 microlitros de tampón 4x a la muestra eluida de 40 microlitros. Agregue inmediatamente un Tris molar a las muestras eluidas, una gota a la vez, hasta que su color se vuelva azul, y luego proceda a los siguientes tubos.

Hervir las muestras eluidas a 70 a 90 grados centígrados durante 10 minutos. Cargue los lisados preparados y las muestras precipitadas una al lado de la otra en un gel de acrilamida SDS-PAGE. Haga funcionar el gel en un tampón de funcionamiento a 100 voltios durante aproximadamente 95 minutos, o hasta que el borde de las proteínas migratorias llegue al fondo del gel.

Posteriormente, transfiera los geles a una membrana de nitrocelulosa o PVDF utilizando un protocolo estándar. Luego, bloquee la membrana durante una hora en un balancín a baja velocidad en TTBS de leche en polvo al cinco por ciento. Para identificar si la precipitación fue exitosa, sondeó la membrana usando el primer anticuerpo contra la proteína precipitada.

Diluirlo en leche en polvo TTBS al cinco por ciento a la concentración recomendada por el fabricante. Incubar la membrana durante la noche a cuatro grados centígrados en una plataforma oscilante con agitación lenta. Al día siguiente, lavar la membrana tres veces durante cinco minutos cada una con TTBS en una plataforma mecedora con alta agitación.

A continuación, incubar la membrana en el anticuerpo secundario adecuado conjugado con peroxidasa de rábano picante, diluido en TTBS, durante una hora a temperatura ambiente sobre una plataforma oscilante con agitación lenta. Realice de tres a seis lavados, cada uno durante cinco minutos, con TTBS en una plataforma oscilante con alta agitación. Analice la señal del anticuerpo secundario incubando la membrana con una solución de luminol disponible en el mercado y siga las instrucciones del fabricante.

Detecte la señal mediante un sistema de imágenes de quimioluminiscencia. Para identificar las proteínas que interactúan, repita estos pasos utilizando los anticuerpos adecuados en la misma transferencia. Para determinar si los componentes de la unión gap, la unión de adherencia y la unión estrecha pueden interactuar juntos en la glándula mamaria, se realizaron ensayos de coinmunofluorescencia.

El ensayo de coinmunofluorescencia muestra que la beta-catenina, una proteína integral de la unión adherente, y la conexina 26, una proteína de la unión gap, se colocalizan en la membrana celular de las glándulas mamarias de ratones en el séptimo día de lactancia, como se refleja en el color amarillo. Los núcleos celulares se visualizan con tinción DAPI azul. Las criosecciones de las glándulas mamarias en el día 18 del embarazo se cortaron y se tiñeron con inmunofluorescencia para Claudin 7, una proteína de unión estrecha que se muestra en verde, E-Cadherin, una proteína de unión adherente que se muestra en rojo, y Connexin 26, una proteína de unión gap que se muestra en azul coral.

Los núcleos se tiñeron con DAPI azul. La colocalización de E-Cadherin y Claudin 7 se muestra de color amarillo a naranja claro, mientras que la colocalización de Connexin 26 con E-Cadherin y Claudin 7 dio lugar a tinciones puntuadas en blanco. Para averiguar qué proteínas de unión se entremezclan y se unen físicamente en la membrana celular, se realizó la coinmunoprecipitación utilizando tejidos de glándulas mamarias de ratones lactantes.

Los resultados mostraron que Connexin 43, un componente de la unión gap, interactúa con E-Cadherin y Claudin 7, pero no con Claudin 3. Estos resultados fueron confirmados por la inmunoprecipitación recíproca. Cuando la E-Cadherina fue inmunoprecipitada, interactuó con Connexin 43 y Claudin 7.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos días para la coinmunofluorescencia de cuatro a ocho portaobjetos, y las láminas se pueden obtener al día siguiente si se realiza correctamente. Al intentar el procedimiento de coinmunofluorescencia, es importante recordar elegir diferentes anticuerpos conjugados con flúor 4 generados en diferentes espacios con longitudes de onda no superpuestas y seleccionar las perlas magnéticas de proteína A o G adecuadas compatibles con los anticuerpos utilizados para la coinmunoprecipitación. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología celular exploraran la interacción de las uniones intercelulares en las glándulas mamarias murinas.

No olvide que trabajar es extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones al realizar este procedimiento.