Protocolos para el ensamblaje estándar de ADN de C-Brick usando Cpf1

En los siguientes vídeos se detalla un procedimiento para utilizar el estándar C-Brick para ensamblar piezas de ADN utilizando la proteína asociada a CRISPR, Cpf1. Este método puede promover el desarrollo del ensamblaje de ADN en el campo de la biología sintética. Por ejemplo, facilitando la construcción de circuitos genéticos complicados.

La principal ventaja de este método es que es independiente de la secuencia y permite el ensamblaje iterativo de construcciones de ADN. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando nos dimos cuenta de que Cpf1 estaba guiado por un solo siRNA y ADN catalítico que se acumulaban. Por lo tanto, la generación de DKN.

La demostración del procedimiento estará a cargo de Shi-Yuan Li, un estudiante graduado de mi laboratorio. Para reparar las plantillas de ARNcr, vuelva a suspender los oligonucleótidos individuales en agua libre de ARNasa hasta una concentración de 10 micromolares. A un tubo de PCR de 0,2 mililitros, agregue el oligonucleótido de cadena superior, el oligonucleótido de cadena inferior y el tampón de recocido 10x como se detalla en el documento adjunto.

Asegúrese de que el volumen total sea de 50 microlitros. Esta tabla muestra seis oligonucleótidos de cadena inferior diferentes, cada uno de los cuales debe emparejarse individualmente con la cadena superior, T7-F. Las letras minúsculas representan la secuencia que se va a transcribir en la secuencia guía del crRNA.

Coloque el tubo de PCR en un termociclador. Ejecute el programa de recocido con una desnitrificación inicial a 95 grados centígrados durante cinco minutos, y luego un enfriamiento de 95 a 20 grados centígrados con una disminución de un grado centígrado por minuto. Después del recocido, realice inmediatamente la transcripción combinando el producto recocido con agua libre de ARNasa, tampón de transcripción T-7, mezcla de NTP, inhibidor de ARNasa recombinante y ARNasa polimerasa T-7 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Incubar la reacción en un baño de agua a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, use un kit de limpieza y concentración de ARN para purificar el ARN transcrito. Utilice un espectrofotómetro UV-Vis para cuantificar el ARN.

A continuación, diluya el ARN hasta una concentración de 10 micromolares. Si las muestras no se utilizan inmediatamente, guárdelas a 80 grados centígrados. La construcción de piezas de ladrillo C se puede lograr mediante varios métodos.

En esta sección del video, se ensamblarán tres casetes de cromoproteínas, cjBlue, eforRed y amilGFP utilizando el método de ensamblaje sin costuras. Comience diseñando y ordenando los oligonucleótidos para la amplificación por PCR de los casetes de cromoproteínas. Cuando lleguen los oligonucleótidos, vuelva a suspenderlos en agua ultrapura hasta una concentración de 10 micromolares.

A continuación, para configurar las reacciones de PCR, coloque tubos de PCR de 0,2 mililitros en hielo. Agregue agua ultrapura, dos tampones XPCR, DNTP, cebadores directos e inversos, plantilla de cromoproteínas y ADN polimerasa de alta fidelidad. Coloque los tubos directamente en el termociclador y ejecute el programa.

Utilice las muestras inmediatamente, o congélelas y guárdelas a 20 grados centígrados. Después de la amplificación, purifique los productos de PCR con un kit. A continuación, para digerir el vector estándar C-Brick con BamH1, agregue agua ultrapura, plásmido, tampón 10x y BamH1 al tubo.

Incubar hasta dos horas a 37 grados centígrados en un baño de agua. Purifique el vector linealizado utilizando un kit de limpieza en gel. Después de la limpieza, combine el vector linealizado, el producto de PCR, el tampón de ensamblaje sin costuras 5x y la enzima de ensamblaje sin costuras de un kit de ensamblaje sin costuras en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Asegúrese de que el volumen total sea de 10 microlitros. Coloque esto en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Después de la incubación, use las muestras inmediatamente o congélelas en hielo y guárdelas a 20 grados centígrados.

A 90 microlitros de E. coli DH10B, agregue 10 microlitros del constructo. Realizar una transformación química. Luego, extienda las células transformadas en una placa LB e incube a 37 grados centígrados.

Al día siguiente, seleccione varios clones para cultivar en tubos LB líquidos de cinco mililitros e incube a 37 grados centígrados en un agitador a 220 rpm durante la noche. Extraiga el plásmido utilizando un kit de preparación de plásmidos. A continuación, identifique los clones correctos mediante la secuenciación de Sanger.

Sepa que la construcción de caminos C-Brick también se puede lograr mediante la aplicación reactiva de PCI, o mediante la restricción en la digestión inmediata del medio de ADN ligasa T4 para la ligadura. A continuación, para digerir el vector C-Brick con Cpf1, combine agua libre de ARNasa, tampón 10x Cpf1, el plásmido, el inhibidor de RNasa recombinante y Cpf1 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Para insertar un fragmento de ADN extraño en los sitios T1 y T2, agregue un microlitro de crRNA T2 e incube el tubo en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 30 minutos.

Luego, manteniendo el tubo en el baño de agua, agregue un microlitro de crRNA T1, un microlitro de Cpf1 e incube durante otros 30 minutos. El crRNA T2 se agrega primero, porque los dos sitios de reconocimiento están más cerca del ADN vectorial. La unión de Cpf1 en el sitio T1 puede influir en el lecho del sitio T2.

Además, si el sitio T2 estuviera reemplazando al sitio T2, el sitio T2 se interrumpiría si el crRNA T1 se agregara primero. Agregue un microlitro de fosfatasa alcalina termosensible e incube el tubo en un baño de agua a 37 grados centígrados durante una hora más. Realice la electroforesis en gel de agarosa y purifique el vector utilizando un kit de sistema de limpieza de gel.

Utilice las muestras inmediatamente, o congélelas y guárdelas a 20 grados centígrados. Para digerir el fragmento de ADN de interés con Cpf1, combine agua libre de ARNasa, tampón Cpf1 10x, plásmido, inhibidor de ARNasa recombinante y Cpf1 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Para insertar un fragmento de ADN extraño en los sitios T1 y T2, agregue un microlitro de crRNA T1 y un microlitro de crRNA T3 al tubo e incube en un baño de agua a 37 grados centígrados durante dos horas.

Después de la incubación, realice una electroforesis en gel de agarosa y purifique el fragmento con un kit de limpieza en gel. Utilice las muestras inmediatamente, o congélelas y guárdelas a 20 grados centígrados. A continuación, para ligar el fragmento de ADN extraño en el vector C-Brick, combine el vector linealizado y el fragmento de ADN en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Agregue 10x tampón de ADN ligasa T4 y ligasa de ADN T4. Luego, incubar durante dos horas a 22 grados centígrados. Utilice las muestras inmediatamente, o congélelas y guárdelas a 20 grados centígrados.

Añadir 10 microlitros de los productos de ligadura a las células competentes de E. coli DH10B y realizar una transformación química. Luego, esparce la E. coli transformada en placas LB e incuba a 37 grados centígrados. Al día siguiente, agregue varios clones a tubos LB líquidos de 5 mililitros e incube durante la noche en un agitador a 220 rpm y 37 grados centígrados.

Extraiga el plásmido utilizando un kit de preparación de plásmidos. A continuación, identifique los clones correctos mediante la secuenciación de Sanger. Realice una nueva ronda de ensamblaje de ladrillo C.

Usando la muestra, los llamados clones de crack se pueden usar como un nuevo vector C-Brick o una pieza de ADN para un posterior ensamblaje iterativo de C-Brick. Se ensamblaron tres casetes de cromoproteínas, cjBlue, eforRed y amilGFP, como se describe en este video. Se expresaron tres cromoproteínas en E. coli cultivada en una placa.

Las bacterias de control negativo, sin cromoproteínas, se muestran en la cuarta placa. Posteriormente, se ensamblaron dos casetes de expresión de color con el estándar C-Brick para crear más colores. Se expresaron tres cromoproteínas y tres cromoproteínas duales ensambladas en E. coli cultivada en medio LB líquido.

Del uno al seis, los constructos expresados son eforRed, uno, amilGFP, dos, cjBlue, tres, amilGFP más eforRed, cuatro, eforRed más cjBlue, cinco, y amilGFP más cjBlue, seis. Las coloridas bacterias en una sola placa, o en un solo tubo de microcentrífuga, se cultivaron a partir de un clon verificado de una sola secuencia. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una semana, si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que todos los materiales deben estar libres de ARNasa, para la preparación de siRNA y la eliminación de Cpf1. Todavía recomiendo que esta táctica haya ayudado como una forma para que los investigadores en el campo de la biología sintética construyan un escaparate genético de las vías metabólicas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo ensamblar una ruta de ADN utilizando el estándar C-Brick.