Name: Análisis de microglia y macrófagos derivados de monocitos del sistema nervioso central por citometría de flujo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Aprende a analizar subpoblaciones de microglia y macrófagos del sistema nervioso central mediante citometría de flujo en ratones adultos. Este protocolo permite identificar marcadores específicos y estudiar procesos neuroinflamatorios.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Agencia Nacional para la Investigación (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), Association France Alzheimer y Bpifrance. Nuestro laboratorio cuenta también con el apoyo del Inserm, el CNRS, la Universidad Pierre et Marie-Curie y el programa &quot;Investissements d&#39;avenir&quot; ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM). Quisiéramos agradecer la ayuda del centro de cultivo celular CELIS.

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Instituto ICM y por el Comité de Ética Animal de Darwin y están cubiertos por el protocolo 01407.02. 1. Preparación <ol><li> Preparar el cóctel de digestión en un tubo de 1,5 ml combinando lo siguiente para cada ratón: 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS); 123 mu l de enzima de digestión (ver tabla de materiales) a 13 wunsch / mL (solución madre), concentración final 1,6 wunsch / mL; Y 5 μl de DNasa I (ver tabla de materiales) a 100 mg / ml (solución madre), concentración final 0,5 mg / ml. </li></ol> 2. Perfusión y disección <ol><li> Euthanize los ratones con una dosis letal de pentobarbital (100 μ l a 400 mg / ml). </li><li> Coloque al animal en decúbito supino y humedezca el cuerpo con etanol al 70%. </li><li> Corte la piel ventral con unas tijeras finas justo debajo del proceso xifoide para exponer el cavit torácicoY. </li><li> Hacer una incisión en el diafragma y cortar los aspectos laterales de la caja torácica con tijeras finas en una dirección caudal a rostral para exponer el corazón (y evitar el corte de otros órganos). Identificar el ventrículo izquierdo (LV) y la aurícula derecha (RA). </li><li> Inserte un catéter de mariposa con una aguja de 25 G dentro del LV. Hacer una incisión en la RA con tijeras finas y al comienzo del flujo sanguíneo, iniciar la perfusión a 10 ml / min de flujo a través del LV con 20 ml de PBS para eliminar las células y la sangre de los vasos; La perfusión exitosa se observa por el blanqueamiento de los pulmones y el hígado a medida que la sangre se desplaza. </li><li> Decapitar al animal con tijeras medianas. Disecar la columna vertebral con tijera fina y separarla del cuerpo mediante la excisión de la musculatura de la pared abdominal en el lado ventral de la columna vertebral y cortando la columna vertebral en la base de la cola. </li><li> Inserte una jeringa de 10 ml que contenga PBS y una punta de pipeta montada de 200 μL en el lado lumbar deLa columna vertebral y enjuague la médula espinal en el lado cervical. NOTA: La punta de la pipeta de 200 μL se corta con tijeras en su extremo más ancho (aproximadamente 1 cm) y se inserta firmemente en una jeringa de 10 ml previamente llena de PBS. </li><li> Retire la piel por encima del cráneo y use fórceps para exponer el cerebro. Insertar una hoja de tijera en la base del cráneo y cortar el cráneo después de la sutura sagital. Inserte una pinza pequeña en el corte y suavemente levante el cráneo. Diseccionar el cerebro de la cabeza del ratón y quitar el bulbo olfatorio y el cerebelo. </li><li> Recoger el cerebro y la médula espinal en un tubo de 1,5 ml que contiene 1,128 ml de PBS con cóctel de digestión (de la etapa 1.1). </li></ol> 3. Disociación de células <ol><li> Corte finamente el cerebro y la médula espinal en el tubo de 1,5 ml (paso 2.9) en 1-2 mm 3 piezas con tijeras pequeñas ( Figura 1 ). </li><li> Incubar el tubo de 1,5 ml que contiene los tejidos picados durante 30 min en una incubadoraA 37 ° C con 5% de CO 2 . NOTA: Prepare el gradiente de densidad en este paso. </li><li> Añadir 20 μL de EDTA 0,5 M (solución madre), concentración final 10 mM, al tubo de 1,5 ml para detener la reacción enzimática. </li><li> Hacer suavemente una suspensión de células pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 5 ml. </li><li> Pasar la suspensión celular a través de una malla de nylon (tamaño de poro de 70 μm) en un tubo de 50 ml usando el émbolo de una jeringa de 10 ml. </li><li> Lavar la malla de nylon con 20 ml de suero bovino fetal al 5% (FBS) -PBS. </li><li> Centrifugar durante 7 min (300 xg) a temperatura ambiente (18 ° C). Desechar el sobrenadante por aspiración y pasar al siguiente paso. Tenga mucho cuidado al retirar el sobrenadante; No perturbe el gránulo, que puede ser aspirado fácilmente por la pipeta de aspiración. </li></ol> 4. Gradiente de densidad <ol><li> Preparar una solución madre del medio de gradiente de densidad añadiendo la cantidad apropiada de 10x PBS al medio de gradiente de densidad. NOTA: Agregue una parte 10X PBS a nueve densidad de gradiente de densidad de piezas. </li><li> Diluir el medio de gradiente de densidad de reserva con 1x PBS para los diferentes porcentajes como se describe en la Tabla 1 . </li><li> Resuspender el gránulo (del paso 3.7) con 4 ml de medio de gradiente de densidad al 30% y transferir a un tubo de 15 ml. </li><li> Coloque una pipeta Pasteur en el fondo del tubo de 15 mL y lentamente subyacente 4 mL de medio de gradiente de densidad al 37%. </li><li> Añadir 4 ml de medio de gradiente de densidad al 70%, como se ha descrito anteriormente. </li><li> Centrifugar el gradiente durante 40 min (800 xg) a temperatura ambiente (18ºC). Asegúrese de que la centrífuga se detiene con un mínimo o ningún freno para que la interfase no se altere. NOTA: El tubo aparecerá estratificado. Las células acodadas en la interfase del gradiente de densidad del 70% al 37% son las células inmunes mononucleadas (subpoblaciones de microglia y macrófagos); Los niveles superiores son restos celulares y mielina, respectivamente ( Figura 2 ). </li><lI&gt; Con una pipeta de transferencia, retire suavemente la capa de mielina. </li><li> Recoger 3-4 mL de la interfase de gradiente de densidad 70-37% que contiene las células de las subpoblaciones de macrófagos en un tubo limpio de 15 mL. </li><li> Lavar las células 3x con PBS, volumen total de 15 mL. Asegúrese de que el medio de gradiente de densidad que contiene las células se diluye al menos tres veces con PBS y se centrifuga durante 7 min (500 xg, 4 ° C) con el freno encendido. </li><li> Resuspender el sedimento de células con 1 mL de PBS para el marcaje celular o para otros ensayos funcionales. </li></ol> 5. Etiquetado de células para citometría de flujo <ol><li> Transferir las células (paso 4.10) en un tubo de citometría de flujo. </li><li> Añadir 1 μl de reactivo de tinción de células muertas fijables a cada muestra de células obtenida en el paso 4.10. Incubar durante 30 minutos en hielo, protegido de la luz. </li><li> Lavar las células una vez con 2 ml de PBS y centrifugar durante 5 min (300 xg, 4 ° C). </li><li> Retirar el sobrenadante, y resuspender el sedimento celular con400 mu l de PBS 1% de BSA, 0,1% de azida. </li><li> Añadir 1 μg de anticuerpos CD16 / CD32 a 100 μl de las células para bloquear los receptores Fc. Incubar 10-15 min en hielo, protegido de la luz. </li><li> Preparar la mezcla de anticuerpos primarios en PBS 1% de BSA, 0,1% de azida o PBS 1% de BSA, 0,1% de azida, 0,25% de saponina, para la permeabilización celular para la tinción intracelular. </li><li> Añadir 100 μL de anticuerpos primarios mezclar (2x) e incubar durante 30 minutos en hielo, protegido de la luz. NOTA: Todos los anticuerpos deben ser titulados antes de realizar el experimento para asegurar resultados óptimos. </li><li> Lavar las células con 2 ml de PBS y centrifugar durante 5 min (300 xg, 4 ° C). Repita este paso tres veces. </li><li> Añadir 100 μl de un anticuerpo secundario si los anticuerpos primarios no están directamente conjugados con un fluoróforo, e incubar durante 30 minutos en hielo, protegido de la luz. </li><li> Lavar las células con 2 ml de PBS y centrifugar durante 5 min a 300 xg a 4 ° C). Repita este paso tres veces. </li><li> Arregla elCon 100 μl de PFA al 1% durante 15 minutos a temperatura ambiente, protegido de la luz. NOTA: Precaución: El PFA es tóxico. Utilizar en una campana extractora y usar equipo de protección personal. </li><li> Lavar las células con 2 ml de PBS y centrifugar durante 5 min a 300 xg a 4 ° C. Repita este paso tres veces. </li><li> Resuspender el sedimento de células con 200 μ l de PBS y proceder a la citometría de flujo de adquisición y análisis. Siga la estrategia de apertura en la Figura 3 . </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar

Se ha demostrado que la microglia y el MDM tienen funciones y fenotipos diferentes en el SNC, por lo que la identificación y el análisis de estas subpoblaciones de macrófagos son esenciales para comprender mejor las enfermedades neurológicas 9 , 18 , 25 . El análisis de citometría de flujo utilizando dos marcadores (CD11b y CD45) permite distinguir entre cada subpoblación ( Figura 3C ). Esta estrat...

Los microglios son los macrófagos residentes en el tejido parenquimatoso del sistema nervioso central (SNC). Ellos juegan dos funciones funcionales clave: la defensa inmune y el mantenimiento de la homeostasis del SNC. En contraste con el MDM, que se renuevan continuamente de las células madre hematopoyéticas en la médula ósea, las células microgliales se diferencian de las células progenitoras hematopoyéticas primitivas originadas en el saco vitelino (YS) que colonizaron el cerebro durante el desarrollo embrionario 1 , 2 , 3 . En los roedores, el factor de transcripción Myb desempeña un papel crucial en el desarrollo de todos los monocitos y macrófagos derivados de la médula ósea, pero para la microglia derivada de YS, este factor es dispensable y la diferenciación sigue dependiendo del factor de transcripción PU.1 4 . En el SNC sano, microglia son células dinámicas que constantemente muestrean su ambiente, scaY detección de patógenos invasores o daño tisular 5 . La detección de tales señales inicia un camino para resolver la lesión. La microglia cambia rápidamente de una morfología ramificada a una ameboidea, seguida de fagocitosis y liberación de diversos mediadores, tales como citoquinas pro- o antiinflamatorias. Así, dependiendo de su microambiente, microglia activado puede adquirir un espectro de diferentes estados de cebado [ 6] . La microglia afecta profundamente el desarrollo y progresión de muchos trastornos neurológicos. En los modelos de roedores de la enfermedad de Alzheimer (EA) 7 , la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) 8 , la esclerosis múltiple (EM) 9 o la enfermedad de Parkinson (PD) 10 , se demuestra que la microglia desempeña un doble papel, induciendo neurotoxicidad perjudicial o actuando De una manera neuroprotectora, que depende deN la enfermedad específica, la etapa de la enfermedad y si la enfermedad estaba influenciada por el compartimento inmunológico sistémico 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . La mayoría de las lesiones del SNC observadas en las enfermedades citadas anteriormente contienen una población heterogénea de células mieloides, incluyendo no sólo microglia parenquimatosa, sino también macrófagos perivasculares y meníngeos, así como MDM infiltrante al SNC. Estos tipos de células pueden contribuir de forma diferencial a los mecanismos fisiopatológicos relacionados con la lesión y la reparación 7 , 12 , 13 , 14 , 15 . El desafío actual para los investigadores que estudian estos modelos de enfermedad es establecer si los monocitos periféricos y los macrófagos se infiltran en el SNC y, en caso afirmativo, distAngustia la microglia residente de estas células. De hecho, las células microgliales son muy plásticas; Cuando se activan, las microglias vuelven a expresar los marcadores que suelen expresarse por monocitos periféricos y macrófagos. La cuestión, por lo tanto, se basa en la identificación de marcadores que pueden distinguir la microglia residente de los monocitos infiltrados y macrófagos. La discriminación de estas poblaciones sobre rodajas de cerebro por aplicaciones inmunohistológicas es limitada debido a la falta de anticuerpos específicos. Sin embargo, el análisis de citometría de flujo es una técnica eficiente para evaluar la expresión de varios marcadores y para distinguir las poblaciones celulares (por ejemplo, linfocitos, macrófagos MDM CD11b + CD45 alto y microglia CD11b + CD45 med ), así como las subpoblaciones celulares 16 , 17 , 18 . Este protocolo describe los procedimientos para aislar elCélulas mononucleares del SNC de ratón en modelos de enfermedad neurológica utilizando una disociación enzimática optimizada de tejido y una centrifugación de gradiente de densidad; Así como un método para diferenciar las poblaciones de microglia y MDM en el SNC mediante citometría de flujo. Otra aproximación es eliminar la mielina y purificar las células usando perlas magnéticas conjugadas con anticuerpos específicos 19 , 20 , 21 . La eliminación de mielina utilizando perlas magnéticas anti-mielina es más caro y afecta a la viabilidad y el rendimiento de las células aisladas [ 22] . Esta etapa y la siguiente separación inmunomagnética de la microglia, limitan los estudios adicionales de las poblaciones específicas de células inmunes 21 , 22 . Estos procedimientos proporcionan una manera fácil de estudiar las subpoblaciones de macrófagos en el desarrollo de la enfermedad, yPara determinar los efectos de los fármacos o modificaciones genéticas en fenotipos de macrófagos y estados de activación.

<table><tbody><tr><td>Ratones de 5 meses</td><td>Janvier</td><td>C57BL/6J</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TL Grado de investigación</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5401020001</td><td>Enzima de digestión</td></tr><tr><td>Desoxirribonucleasa I del páncreas bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0891-01</td><td>Medio de gradiente de densidad</td></tr><tr><td>Filtro de células tamaño 70 y micro; m Nylon</td><td>Corning</td><td>731751</td><td></td></tr><tr><td>Venofix 25 g</td><td>BRAUN</td><td>4056370</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de pistón 10 mL</td><td>Terumo</td><td>SS+10ES1</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur 230 mm</td><td>Dustcher</td><td>20420</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 123.328</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 15 mL</td><td>TPP</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 50 mL</td><td>TPP</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de fondo redondo de poliestireno de 5 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (1x) sin Ca2+/Mg2+</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (10x) sin Ca2+/Mg2+</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14200-067</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino Solución de albúmina 30%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7284</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído 32%</td><td>Solución Microscopía Electrónica</td> Ciencias <td>15714-S</td><td>Precaución -</td></tr><tr><td>Saponina</td> tóxica <td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Azida sódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>PerCPCy5.5 Rata anti-ratón CD11b (clon M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>45-0112</td><td></td></tr><tr><td>Rata IgG2b K Control de isotipo PerCP-Cianina5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-4031</td><td></td></tr><tr><td>BV421 Rata anti-ratón CD45 (clon 30-F11)</td><td>BD Biosciences</td><td>563890</td><td></td></tr><tr><td>BV421 Rata IgG2b, &kappa; Control de isotipos RUO</td><td>BD Biosciences</td><td>562603</td><td></td></tr><tr><td>Conejo anti-ratón TMEM119 (clone28 - 3)</td><td>Abcam</td><td>ab209064</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 Burro anti-conejo IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A31573</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ratón CD16/CD32 Purificado</td><td>eBioscience</td><td>14-0161</td><td>Ratón Fc Block</td></tr><tr><td>Kits de manchas de células muertas fijables</td><td>Invitrogen</td><td>L34969</td><td></td></tr><tr><td>Ratón CCR2 Anticuerpo conjugado APC</td><td>R& D</td><td>FAB5538A</td><td></td></tr><tr><td>Rata IgG2B APC conjugado con isotipo</td><td>Control R& D</td><td>IC013A</td><td></td></tr><tr><td>Ratón CX3CR1 Anticuerpo conjugado con PE</td><td>R& D</td><td>FAB5825P</td><td></td></tr><tr><td>IgG de cabra Anticuerpo conjugado con PE</td><td>R& D</td><td>IC108P</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>Analizador de células</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSVERSE</td><td></td></tr><tr><td>Software de análisis de datos</td><td>FlowJo LLC</td><td>FlowJo</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras finas</td><td>F.S.T</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de patrón estándar</td><td>F.S.T</td><td>11000-13</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras Mayo</td><td>F.S.T</td><td>14010-15</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #5</td><td>F.S.T</td><td>11251-20</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis de microglia y macrófagos derivados de monocitos del sistema nervioso central por citometría de flujo

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Numerosos estudios han demostrado el papel de las células inmunitarias, en particular los macrófagos, en las patologías del sistema nervioso central (SNC). Existen dos poblaciones principales de macrófagos en el SNC: (i) la microglia, que son los macrófagos residentes del SNC y se derivan de progenitores del saco vitelino durante la embriogénesis, y (ii) los macrófagos derivados de monocitos (MDM), que pueden infiltrarse El SNC durante la enfermedad y se derivan de progenitores de médula ósea. Los roles de cada subpoblación de macrófagos difieren dependiendo de la patología que se estudia. Además, no hay consenso sobre los marcadores histológicos o los criterios distintivos utilizados para estas subpoblaciones de macrófagos. Sin embargo, el análisis de los perfiles de expresión de los marcadores CD11b y CD45 mediante citometría de flujo nos permite distinguir la microglia (CD11b + CD45 med ) del MDM (CD11b + CD45 alto ). En este protocolo, mostramos que la centrifugación de gradiente de densidadY el análisis de citometría de flujo se puede utilizar para caracterizar estas subpoblaciones de macrófagos del SNC, y para estudiar varios marcadores de interés expresados ​​por estas células como hemos publicado recientemente. Por lo tanto, esta técnica puede ampliar nuestra comprensión de la función de los macrófagos en ratones modelos de enfermedades neurológicas y también se puede utilizar para evaluar los efectos de los medicamentos sobre estas células.

Después de la centrifugación de gradiente de densidad y tinción de anticuerpos, las células se adquirieron en un citómetro de flujo y se analizaron usando una estrategia de bloqueo morfológico como sigue. Se definió una primera puerta en la zona de dispersión hacia delante (FSC-A) de trama de puntos frente a la altura dispersada hacia delante (FSC-H) para discriminar células individuales de dobletes ( figura 3A ). Las células individuales fueron ent...

Este protocolo proporciona un análisis de las subpoblaciones de macrófagos en el sistema nervioso central del ratón adulto mediante citometría de flujo y es útil para el estudio de múltiples marcadores expresados ​​por estas células.

Análisis de microglia y macrófagos derivados de monocitos del sistema nervioso central por citometría de flujo

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

El objetivo general de este experimento es evaluar los diversos marcadores expresados por subpoblaciones de macrófagos dentro del sistema nervioso central o SNC. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neuroinmunología, como la identificación de macrófagos duperry mientras intentamos comprender el funcionamiento del SNC en estados de vértigo, y cuáles son los fenotipos de los macrófagos en el SNC. Las principales ventajas de esta técnica son el aislamiento de un gran número de subpoblaciones de macrófagos altamente purificadas, así como la caracterización de los marcadores celulares de las subpoblaciones de macrófagos.Comience utilizando tijeras finas para cortar la piel ventral justo por debajo del proceso xifoides con el fin de exponer la cavidad torácica. Haga una incisión en el diafragma y corte las partes laterales de la caja torácica de caudal a rostral para exponer el corazón. Después de identificar el ventrículo izquierdo y la aurícula derecha, inserte un catéter tipo mariposa con aguja de calibre 25 en el ventrículo izquierdo.Realice una incisión en la aurícula derecha y comience a perfundir 20 mililitros de PBS a través del catéter a una velocidad de diez mililitros por minuto tan pronto como comience a fluir la sangre. Una perfusión exitosa se indicará por el blanqueamiento de los pulmones y del hígado a medida que la sangre sea desplazada. A continuación, use tijeras finas para disecar la columna vertebral.Resecar la musculatura de la pared abdominal en el lado ventral de la columna espinal y cortar la columna vertebral en la base de la cola para extraer la espina dorsal mientras se cosecha. Inserte una jeringa de diez mililitros de PBS equipada con una punta de pipeta modificada de 200 microlitros en el lado lumbar de la columna espinal. Luego, lave la médula espinal por el lado cervical.Retire la piel sobre el cráneo e inserte una punta de las tijeras en la base del cráneo. Corte el cráneo siguiendo la sutura sagital. Luego, inserte una pinza pequeña en el corte y retire suavemente la parte superior del cráneo.Extraiga el cerebro de la cabeza del ratón y retire el bulbo olfatorio y el cerebelo. A continuación, coloque el cerebro y la médula espinal en un tubo de un punto cinco mililitros que contenga un punto uno dos ocho mililitros de la mezcla de digestión. Para disociar las células, use tijeras pequeñas para cortar finamente el cerebro y la médula espinal en trozos de uno a dos milímetros cúbicos y coloque los trozos a 37 grados Celsius y cinco por ciento de dióxido de carbono durante 30 minutos.Al final de la incubación, detenga la digestión con 20 microlitros de EDTA 0,5 molar, seguido de una trituración suave con una pipeta de cinco mililitros. Filtre la suspensión celular resultante a través de un tamiz de malla de 70 micrones en un tubo cónico de 50 mililitros utilizando el émbolo de una jeringa de diez mililitros para macerar suavemente cualquier tejido restante de cerebro o médula espinal. Enjuague el tamiz con 20 mililitros de PBS con FBS al 5 %.Y recoger las células filtradas mediante centrifugación. Luego, aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el precipitado. Para la separación por gradiente de densidad de las células, se suspende el precipitado con cuatro mililitros de medio de gradiente de densidad al 30 por ciento, y se transfieren las células a un tubo cónico de 15 mililitros.Coloque cuidadosamente cuatro mililitros de medio de gradiente de densidad al 37 %, seguidos de cuatro mililitros de medio de gradiente de densidad al 70 %, debajo del medio de gradiente de densidad al 37 %. Transfiera el tubo a una centrífuga de banco para separar las células. Las células microgliales y los macrófagos se encontrarán en la interfase entre las capas de gradiente de densidad al 70 % y al 37 %.El tubo aparecerá estratificado. Después de retirar cuidadosamente la capa superior de mielina, transfiera de tres a cuatro mililitros de la capa intermedia de macrófagos microgliales a un nuevo tubo de 15 mililitros. Luego, lave las células inmunitarias mediante tres centrifugaciones en 15 mililitros de PBS, resuspendiendo el precipitado en un mililitro de PBS tras el lavado final.Para evaluar la expresión de marcadores de subpoblaciones de macrófagos, transfiera las células a un tubo de análisis de citometría de flujo de cinco mililitros, seguido por la adición de un microlitro de reactivo fijable para la tinción de células muertas. Después de 30 minutos en hielo y protegido de la luz, lave las muestras con dos mililitros de PBS y re-suspenda el sedimento en 400 microlitros de tampón fax por tubo de análisis experimental. Divida las células en el número adecuado de tubos de análisis de citometría de flujo de cinco mililitros.Luego, bloquee la unión no específica a los receptores Fc con un microgramo de la mezcla de anticuerpos bloqueantes CD16 CD32 por 100 microlitros de células, incubando durante 10 a 15 minutos en hielo y protegido de la luz. A continuación, marque las células con 100 microlitros de los anticuerpos primarios adecuados, incubando durante 30 minutos en hielo y protegido de la luz. Al final de la incubación, lave las células cuatro veces con dos mililitros de PBS.Luego, agregue 100 microlitros de los anticuerpos secundarios apropiados durante 30 minutos en hielo, protegido de la luz, seguido de cuatro lavados con PBS como se acaba de demostrar. Después del último lavado, re-suspenda suavemente los pellets en 100 microlitros de paraformaldehído al uno por ciento durante 15 minutos a temperatura ambiente, protegido de la luz. A continuación, lave las células cuatro veces con PBS.Re-suspender los pellet finales en 200 microlitros de PBS fresco y analizar las células mediante citometría de flujo. Las microglías derivadas del cerebro y de la médula espinal y los macrófagos derivados de monocitos se identifican según su expresión de CD11B y CD45. La expresión de CX3CR1 y Tmem119 por las células microgliales CD11B positivas y CD45 de intensidad media permite distinguir aún más esta población celular de los macrófagos derivados de monocitos CD11C positivos y CD45 alta, que no expresan ninguno de estos marcadores, pero sí expresan CCR2.Después de la separación mediante gradiente de densidad, entre el 85 y el 95 por ciento de las células aún son viables. En ausencia del aislamiento mediante gradiente de densidad, las subpoblaciones de macrófagos no son identificables en un gráfico de dispersión lateral hacia adelante, debido a la presencia de células no macrófagas y restos de mielina. Dado que el epítopo reconocido por el anticuerpo anti-Tmem119 es intracelular, se requiere permeabilización para la marcación de este importante marcador celular de microglía.Tenga en cuenta que la permeabilización induce la contracción celular, lo que hace que las subpoblaciones de macrófagos aparezcan más pequeñas mediante el análisis de dispersión hacia adelante frente a dispersión lateral. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en cinco horas si se realiza adecuadamente. Mientras intentaba este procedimiento, es importante recordar preparar el gradiente de densidad con mucha precaución.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la rt-PCR cuantitativa, para responder preguntas adicionales sobre las vías de señalización de subpoblaciones de macrófagos. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran la activación de subpoblaciones de macrófagos en modelos de ratón de enfermedades neurológicas. Después de ver este video, usted debería realizar pruebas o seguir esta tradición analizando subpoblaciones de macrófagos mediante citometría de flujo.No olvide que trabajar con paraformaldehído puede ser extremadamente peligroso, y que siempre se deben tomar precauciones, como utilizar una campana extractora, al realizar este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

La microglía se macrófagos residentes que proporcionan la primera línea de defensa y de vigilancia inmune del sistema nervioso central. Los microARN son moléculas reguladoras que juegan un papel importante en muchos procesos fisiológicos, incluida la activación y diferenciación de los macrófagos. En este artículo se describe el método para la medición de los microRNAs en la microglía.

La detección de microARNs en la microglía por PCR en tiempo real en el SNC normal y durante la neuroinflamación

Este video muestra la citometría de flujo para medir la absorción microglial de biopartículas fluorescentes después de la administración intravítrea en un ojo de ratón. La citometría de flujo detecta células vivas que expresan CD11b y distingue las células de microglía fagocítica que exhiben fluorescencia verde de otras células mieloides, incluidos los monocitos que expresan Ly6C y los neutrófilos que expresan Ly6G.

Medición de la absorción microglial de partículas fluorescentes administradas intravítreamente mediante citometría de flujo

fagocitosis microglial es crítica para el mantenimiento de la homeostasis del tejido e inadecuada función fagocítica se ha implicado en la patología. Sin embargo, la evaluación de la función de la microglia in vivo es un desafío técnico. Hemos desarrollado una técnica sencilla pero robusto para el seguimiento y cuantificar el potencial fagocítica de microglia en un entorno fisiológico con precisión.

La evaluación de la función retiniana Microglial fagocítica<em&gt; En Vivo</em&gt; El uso de un ensayo basado en citometría de flujo

Análisis cuantitativo de contenido de la celda dentro del nervio ciático murino es difícil debido a la escasez del tejido. Este protocolo describe un método para la digestión del tejido y la preparación que proporciona suficientes células para el análisis de citometría de flujo de poblaciones de células inmunitarias de los nervios de los ratones.

Análisis de las células inmunes en solo de los nervios ciático y de ganglio de raíz Dorsal de un ratón mediante citometría de flujo

Se presenta un protocolo para el aislamiento de primaria microglia del cerebro murino. Esta técnica ayuda a promover la comprensión actual de condiciones neurológicas. Centrifugación de gradiente de densidad y separación magnética se combinan para producir suficiente rendimiento de una muestra muy pura. Además, describiremos los pasos para la caracterización de la microglia.

Caracterización y aislamiento de Microglia primarios de ratón por centrifugación de gradiente de densidad

Este protocolo proporciona un método para digerir los ojos enteros en una sola suspensión celular con el propósito de análisis citométrico de flujo multiparamétrico con el fin de identificar poblaciones fagocíticas mononucleares oculares específicas, incluyendo monocitos, microglia, macrófagos y células dendríticas.

Digestión de ojos enteros del ratón para el análisis citométrico de flujo multiparamétrico de fagocitos mononucleares

Aquí presentamos dos protocolos para cuantificar el envolvimiento microglial de sinapsis positivas para vGLUT1 y sinaptosomas crudos marcados con pHRodo Red mediante citometría de flujo.

Cuantificación de la envolvimiento microglial de material sináptico mediante citometría de flujo

La identificación de la microglía (MG) y los macrófagos infiltrantes periféricos (Mø) en la médula espinal lesionada es difícil. En este protocolo, se utilizó la citometría de flujo (FCM) para identificar MG similares a M1, MG similares a M2, Mø similares a M1 y Mø similares a M2, respectivamente. Esta tecnología también se puede aplicar a otras enfermedades del sistema nervioso central para comprender el papel de MG y Mø.

Identificación de microglía y macrófagos infiltrantes periféricos en la médula espinal lesionada mediante citometría de flujo

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar la función de las células inmunitarias después de un accidente cerebrovascular isquémico utilizando el análisis de citometría de flujo en un modelo de mini-accidente cerebrovascular. Este método permite un examen detallado de las interacciones neuroinmunes y puede adaptarse para el estudio de otras enfermedades neurodegenerativas, mejorando nuestra comprensión de las respuestas inmunes en la patología del ictus.

Aislamiento y evaluación por citometría de flujo de las interacciones neuroinmunes en un modelo murino de mini-ictus

Este protocolo combina la citometría de flujo y la secuenciación de ARN unicelular para aislar y caracterizar los estados de las células microgliales en el cerebelo de los cerebros de ratones postnatales tempranos. Utiliza la disociación enzimática, la centrifugación de Percoll y la inmunotinción para revelar la heterogeneidad de la microglía y mejorar la comprensión de sus funciones en el desarrollo y la enfermedad del cerebelo.

Citometría de flujo y análisis unicelular para caracterizar la activación de la microglía en el desarrollo temprano del cerebro de ratón posnatal

Aprende a analizar subpoblaciones de microglia y macrófagos del sistema nervioso central mediante citometría de flujo en ratones adultos. Este protocolo permite identificar marcadores específicos y estudiar procesos neuroinflamatorios.

Análisis de microglia y macrófagos derivados de monocitos del sistema nervioso central por citometría de flujo

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