Análisis de microglia y macrófagos derivados de monocitos del sistema nervioso central por citometría de flujo

El objetivo general de este experimento es evaluar los diversos marcadores expresados por las subpoblaciones de macrófagos dentro del sistema nervioso central o SNC. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neuroinmunología, como los macrófagos duperry mientras intentamos marear el SNC, y cuáles son los fenotipos del SNC en los macrófagos. Las principales ventajas de esta técnica son el aislamiento de un gran número de subpoblaciones de macrófagos altamente purificadas, así como una convalidación del marcador celular de la subpoblación de macrófagos.

Comience usando tijeras finas para cortar la piel ventral justo debajo de la apófisis xifoides para exponer la cavidad torácica. Haga una incisión en el diafragma y corte los aspectos laterales de la caja torácica en dirección caudal a rostral para exponer el corazón. Después de identificar el ventrículo izquierdo y la aurícula derecha, inserte un catéter de mariposa con una aguja de calibre 25 en el ventrículo izquierdo.

Haga una incisión en la aurícula derecha y comience a profundir 20 mililitros de PBS a través del catéter a una velocidad de diez mililitros por minuto tan pronto como la sangre comience a fluir. Una profusión exitosa estará indicada por un blanqueamiento de los pulmones y el hígado a medida que la sangre se desplaza. A continuación, utilice unas tijeras finas para diseccionar la columna vertebral.

Extirpar la musculatura de la pared abdominal en el lado ventral de la columna vertebral y cortar la columna vertebral en la base de la cola para eliminar la columna vertebral a medida que se cosecha. Inserte una jeringa de diez mililitros de PBS equipada con una punta de pipeta modificada de 200 microlitros en el lado lumbar de la columna vertebral. A continuación, enjuague la médula espinal del lado cervical.

Retire la piel por encima del cráneo e inserte una punta de las tijeras en la base del cráneo. Cortar el cráneo siguiendo la sutura sagital. A continuación, inserte unas pinzas pequeñas en la incisión y retire suavemente la parte superior del cráneo.

Disecciona el cerebro de la cabeza del ratón y retira el bulbo olfativo y el cerebelo. A continuación, coloque el cerebro y la médula espinal en un tubo de un coma cinco mililitros que contenga un coma uno, dos, ocho mililitros de cóctel de digestión. Para disociar las células, use tijeras pequeñas para cortar finamente el cerebro y la médula espinal en pedazos de uno o dos milímetros cúbicos y coloque los pedazos a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono durante 30 minutos.

Al final de la incubación, detenga la digestión con 20 microlitros de EDTA cero coma cinco molares, seguido de una trituración suave con una pipeta de cinco mililitros. Filtre la suspensión celular resultante a través de un colador de malla de 70 micras en un tubo cónico de 50 mililitros utilizando el émbolo de una jeringa de diez mililitros para macerar suavemente cualquier tejido cerebral o de la médula espinal restante. Enjuague el colador con 20 mililitros de cinco por ciento FBS y PBS.

Y recoger las células filtradas por centrifugación. Luego, aspire con cuidado el sobrenadante sin alterar el pellet. Para la separación de gradiente de densidad de las células, suspendemos el pellet con cuatro mililitros de medio de gradiente de densidad del 30 por ciento y transferimos las células a un tubo cónico de 15 mililitros.

Coloque suavemente cuatro mililitros de medio con gradiente de densidad del 37 por ciento, seguidos de cuatro mililitros de medio con gradiente de densidad del 70 por ciento bajo el medio con gradiente de densidad del 37 por ciento. Transfiera el tubo a una centrífuga de sobremesa para separar las celdas. Las células de microglía y macrófagos estarán en la interfaz de las capas de gradiente de densidad del 70 y 37 por ciento.

El tubo aparecerá estratificado. Después de retirar cuidadosamente la capa superior de mielina, transfiera de tres a cuatro mililitros de la capa de interfase de la microglía y los macrófagos a un nuevo tubo de 15 mililitros. A continuación, lavar las células inmunitarias con tres centrífugas en 15 mililitros de PBS, volviendo a suspender el pellet en un mililitro de PBS después del lavado final.

Para evaluar la expresión del marcador de subpoblación de macrófagos, transfiera las células a un tubo de análisis de citometría de flujo de cinco mililitros, seguido de la adición de un microlitro de reactivo de tinción de células muertas fijable. Después de 30 minutos en hielo, protegido de la luz, lavar las muestras en dos mililitros de PBS y volver a suspender el pellet en 400 microlitros de tampón de fax por tubo de análisis experimental. Divida las células en el número apropiado de tubos de análisis de citometría de flujo de cinco mililitros.

A continuación, bloquee la unión al receptor FC inespecífico con un microgramo de cóctel de anticuerpos bloqueantes CD 16 CD 32 por cada 100 microlitros de células durante una incubación de 10 a 15 minutos en hielo, protegida de la luz. A continuación, etiquete las células con 100 microlitros de los anticuerpos primarios adecuados, para una incubación de 30 minutos en hielo, protegidos de la luz. Al final de la incubación, lavar las células en dos mililitros de PBS cuatro veces.

A continuación, se añadieron 100 microlitros de los anticuerpos secundarios adecuados durante 30 minutos en hielo, protegidos de la luz, seguidos de cuatro lavados en PBS, como se acaba de demostrar. Después del último lavado, vuelva a suspender suavemente los pellets en 100 microlitros de paraformaldehído al uno por ciento durante 15 minutos a temperatura ambiente, protegidos de la luz. A continuación, lave las células cuatro veces en PBS.

Vuelva a suspender los gránulos finales en 200 microlitros de PBS fresco y analice las células mediante citometría de flujo. La microglía derivada del cerebro y la médula espinal y los macrófagos derivados de monocitos se identifican en función de su expresión de CD 11 B y CD 45. La expresión de CX3CR1 y Tmem119 por parte de las células microgliales medianas CD 11 B positivas para CD 45 permite distinguir aún más esta población celular de los macrófagos derivados de monocitos CD 45 CD 45 positivos para CD 11, que no expresan ninguno de estos marcadores, pero sí CCR2.

Después de la separación por gradiente de densidad, entre el 85 y el 95 por ciento de las células siguen siendo viables. En ausencia de aislamiento por gradiente de densidad, las subpoblaciones de macrófagos no son identificables en un diagrama de dispersión de dos lados hacia adelante, debido a la presencia de células no macrófagas y restos de mielina. Dado que el epítopo reconocido por el anticuerpo anti-Tmem119 es intracelular, se requiere permeabilización para el marcaje de este importante marcador de células microgliales.

Sin embargo, tenga en cuenta que la permeabilización induce la contracción de las células, lo que hace que las subpoblaciones de macrófagos parezcan más pequeñas en el análisis de dispersión frontal frente a lateral. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en cinco horas si se realiza correctamente. Mientras intenté este procedimiento, es importante recordar configurar el resplandor de la densidad con mucho cuidado.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la rt-PCR cuantitativa para responder preguntas adicionales sobre las vías de señalización de las subpoblaciones de macrófagos. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran la activación de la subpoblación de macrófagos en modelos de ratón de enfermedad neurológica. Después de ver este video, debe realizar pruebas o seguir esta tradición como subpoblaciones de macrófagos mediante citometría de flujo.

No olvide que trabajar con paraformaldehído puede ser extremadamente peligroso, y que siempre se deben tomar precauciones como el uso de una capucha al realizar este procedimiento.