Name: Aislamiento de células primarias de ganglio retiniano murino (RGC) por citometría de flujo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Aprende a aislar células primarias de ganglio retiniano murino mediante citometría de flujo. Este protocolo estandarizado permite obtener poblaciones enriquecidas de RGCs para investigar enfermedades degenerativas de la retina.

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Los autores desean agradecer al Sr. Tim Higgins, Illustrator Senior del Departamento de Microbiología, Inmunología y Bioquímica, por la asistencia técnica de video; Dr. Matthew W. Wilson para las discusiones y los miembros de los laboratorios Jablonski y Morales-Tirado por sus útiles comentarios. Este trabajo fue apoyado por el Premio al Investigador Joven del Instituto de Investigación Alcon (VMM-T), la Fundación de Investigación de la Universidad de Tennessee (VMM-T), el Instituto Nacional del Ojo EY021200 (MMJ), el Gerwin Fellowship (VMM-T); La Beca de Pre-doctorado Gerwin (ZKG), el Departamento de Defensa del Ejército de Investigación Médica y el Comando de Materiales (VMM-T), y la subvención no restringida de la investigación para prevenir la ceguera.

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

FACS es la técnica de elección para purificar poblaciones celulares. Otros métodos de aislamiento incluyen el inmunopanning, las perlas magnéticas y el agotamiento de la fijación del complemento. La ventaja de FACS sobre estas otras metodologías se basa en la identificación simultánea de marcadores de superficie celular con diferentes grados de intensidad. La intensidad fluorescente de la molécula es proporcional a la cantidad de expresión de la proteína. Hasta ahora, el aislamiento de RGCs se basó únicamente en la posi...

Los RGC son neuronas diferenciadas terminalmente, y por lo tanto, las células primarias son necesarias para la experimentación. El desarrollo de un protocolo para el aislamiento y enriquecimiento de las células ganglionares primarias de la retina murina (RGCs) es fundamental para revelar los mecanismos de la salud y la degeneración de RGC in vitro . Esto es especialmente importante para los estudios que buscan generar terapias potenciales para promover la función de RGC y para minimizar su muerte. La degeneración de RGC se asocia con enfermedades degenerativas de la retina, como el glaucoma, la retinopatía diabética y el envejecimiento normal. Aunque los mecanismos celulares específicos subyacentes a la pérdida de RGC no están claros, se han identificado una serie de factores de riesgo. La falta de oxigenación en la cabeza 1 , 2 , 3 del nervio óptico causa la muerte 4 de RGC y actúa como la alteración de la homeostasis entre la activación de la excitación e iNhibitory receptores dentro de RGCs individuales 5 , 6 . Una serie de desafíos impiden el progreso hacia el uso de estas células para estudios en profundidad. En primer lugar, el número de RGC presentes en una retina murina es pequeño. RGCs representan menos del 1% de las células retinianas totales 7 , 8 , 9 . En segundo lugar, la mayoría de los marcadores específicos de RGC son proteínas intracelulares 10 , 11 , 12 . La selección basada en estos marcadores deja las células no viables, lo que impide el análisis funcional posterior. Finalmente, los protocolos actualmente disponibles son largos y carecen de estandarización 13 , 14 . Los primeros protocolos de aislamiento de RGC se basaron en métodos de inmunopanning. Barres et al. 15 Adaptado el clásico immunopY añadió un segundo paso, que excluyó monocitos y células endoteliales de la mayor parte de las células de la retina antes de la selección positiva basada en la inmunopositividad al antígeno anti-timocito (aka Thy1), un marcador de la superficie celular. Años después, Hong et al. Combinado técnicas de aislamiento magnético de grano con estrategias de clasificación celular para aislar RGCs con mayor pureza [ 16] . El uso de cuentas magnéticas todavía se utiliza en muchas aplicaciones científicas. Juntos, las perlas magnéticas y los protocolos de citometría de flujo mejoraron la pureza de las células aisladas. Sin embargo, estos sistemas de purificación aún no han sido estandarizados para el aislamiento de RGC murinos a partir de retina disociada. La citometría de flujo es un poderoso método analítico que mide las características ópticas y de fluorescencia de las suspensiones celulares. Las células son analizadas tanto cuantitativa como cualitativamente con un alto nivel de sensibilidad, proporcionando un análisis multidimensional de la población celularCión. La discriminación celular se basa en dos propiedades físicas principales: tamaño o superficie de las células y granularidad o complejidad interna 17 . Se puede realizar un análisis multidimensional combinando anticuerpos marcados con fluorocromos que tienen longitudes de onda de excitación similares y diferentes emisiones. La citometría de flujo es rápida, reproducible y sensible. Los láseres multipunto permiten un análisis multidimensional aún mayor de células individuales mediante citometría de flujo. Por lo tanto, es una metodología atractiva para el estudio de especímenes citológicos. Selección de células activadas por fluorescencia (FACS) utiliza las diferencias fenotípicas multidimensionales identificadas por citometría de flujo para clasificar las células individuales en distintas subpoblaciones. En la última década, se han identificado múltiples proteínas superficiales e intracelulares como biomarcadores potenciales para la selección de células, incluidas las neuronas. Los estudios iniciales que buscaban aislar RGC de ratas utilizaron Thy1 como un ganglio celL marcador. Desafortunadamente, Thy1, también conocido como CD90, tiene múltiples isoformas en otras especies de roedores 18 , 19 , 20 y se expresa por múltiples tipos de células de retina 19 , 20 , lo que lo convierte en un marcador no específico para RGCs. Otro marcador de superficie, CD48, se encuentra en poblaciones monocíticas en la retina, incluyendo macrófagos y microglia. Usando estos dos marcadores de superficie, se desarrolló una firma RGC modificada-Thy1 + y células CD48 neg - 15 , 16 , 21 , 22 . Lamentablemente, estos dos criterios de selección no son suficientes para seleccionar una población RGC altamente enriquecida. Para abordar esta necesidad insatisfecha, se desarrolló un protocolo de citometría de flujo 23 basado en criterios de selección positiva y negativa multicapa usiNg marcadores de superficie celular conocidos para enriquecer y purificar RGCs murinos primarios.

<table><tbody><tr><td>Anti-ratón CD15 PE</td><td>BioLegend</td><td>125606</td><td>Clon MC-480</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD48 PE-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>103424</td><td>Clon HM48-1</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD57</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6680-100TST</td><td>Clon VC1.1</td></tr><tr><td>Antiratón CD90.2 AF700</td><td>BioLegend</td><td>105320</td><td>Clon 30-H12</td></tr><tr><td>Violeta Brillante 421 Cabra Anti-ratón IgG BioLegend</td><td></td><td>405317</td><td>Clon Poly4053</td></tr><tr><td>Anti-ratón purificado CD16/32</td><td>BioLegend</td><td>101302</td><td>bloque FcgRII/III, Clon 93</td></tr><tr><td>Zombie Aqua&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>423102</td><td>Discriminación de células vivas/células muertas</td></tr><tr><td>Suero bovino fetal</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>Origen estadounidense</td></tr><tr><td>AbC Total Antibody Compensation Bead Kit Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A10497</td><td>Multi-species Ig</td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Medium Thermo Fisher Scientific</td><td>21103049</td><td>Agregue suero a los medios antes del cultivo.</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td> solución <td>salina</td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Microscopio estereoscópico</td><td>modelo Olympus SZ-PT</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Sorvall Thermo</td><td>Scientific</td><td>ST 16R</td><td>Toda la centrifugación realizada&nbsp; en la</td></tr><tr><td>placa base RT &ndash; Bandeja de disección</td><td>Fisher Scientific</td><td>SB15233FIM</td><td>También se puede utilizar una placa de cera</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Aesculap</td><td>5002-7</td><td>4 y frac12; pulgadas</td></tr><tr><td>Tijeras de iris, rectas</td><td>Aesculap</td><td>1360</td><td>5 y frac12; pulgadas</td></tr><tr><td>Tubos cónicos Falcon 15 mL Fisher</td><td>Scientific 352097</td><td></td><td>Tubos de polipropileno Falcon</td></tr><tr><td>50 mL Tubos cónicos</td><td>Fisher Scientific</td><td>352098</td><td>Tubos de polipropileno</td></tr><tr><td>BD FACS Tubos</td><td>Fisher Scientific</td><td>352003</td><td>Tubos de polipropileno Platos de</td></tr><tr><td>40 mm</td><td>MidSci</td><td>TP93040</td><td>Cultivo de tejidos tratado</td></tr><tr><td>70 &mu; m colador de nylon</td><td>MidSci</td><td>70ICS</td><td>estéril</td></tr><tr><td>40 &mu; m colador de nylon</td><td>MidSci</td><td>40ICS</td><td>estéril</td></tr><tr><td>&nbsp; BD Jeringa de 10 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>301604</td><td>Jeringa desechable sin aguja</td></tr><tr><td>Mortles</td><td>MidSci</td><td>PEST</td><td>estéril</td></tr><tr><td>Wheaton Viales</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>986734 Sin revestimiento</td></tr><tr><td>Aguja BD 30 G</td><td>Fisher Scientific</td><td>305128</td><td>Hausser Scientific de 1 pulgada</td></tr><tr><td>Cámara contadora de vidrio Hausser Scientific Fisher</td><td>Scientific</td><td>0267151B</td><td>Hemocitómetro</td></tr><tr><td>Gibco Trypan azul 0.4% Solución</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>15250061 Tubo</td></tr><tr><td>de viabilidad Tubos Eppendorf</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-25</td><td>1.5mL</td></tr><tr><td>EVOS Imágenes de células floides</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>447113</td><td>Imágenes de fluorescencia con un objetivo 20X</td></tr><tr><td>100% Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-452</td><td>Se utiliza para hacer etanol al 70%</td></tr><tr><td>Pipeta Pipet-Lite LTS L-1000XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014282</td><td>LTS Pipeta</td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipeta L-200XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014391</td><td>LTS Pipeta</td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipeta L-20XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014392</td><td>LTS Gradilla de pipetas</td></tr><tr><td>LTS 1000 mL &ndash; GPS-L1000S</td><td>Rainin</td><td>17005088</td><td>Azul Rack Puntas Estériles</td></tr><tr><td>Rack LTS 250 mL &ndash; GPS-L250S</td><td>Rainin</td><td>17005092</td><td>Verde Rack Puntas Estériles</td></tr><tr><td>LTS 20 mL &ndash; GPS-L10S</td><td>Rainin</td><td>17005090</td><td>Red Rack Puntas Estériles</td></tr><tr><td>FACSAria II Clasificador de Células</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>Pedido personalizado</td></tr><tr><td>Citómetro LSR II</td> BD <td>Biosciences</td><td>N/A</td><td>Pedido personalizado</td></tr><tr><td>Abca8a</td><td>Thermo Fisher Scientific Mm00462440_m1</td><td></td><td>M&uuml; ller cells</td></tr><tr><td>Aldh1al</td><td>Thermo Fisher Scientific Mm00657317_m1</td><td></td><td>M&uuml; ller cells</td></tr><tr><td>Aqp4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00802131_m1</td><td>Astrocytes</td></tr><tr><td>Calb2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00801461_m1</td><td>Amacrine, Horizontal</td></tr><tr><td>Cd68</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm03047340_m1</td><td>Retinal Pigment Epitelial Cells</td></tr><tr><td>Gad2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Mm00484623_m1 Amacrine</td></tr><tr><td>Hprt</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm01545399_m1</td><td>House keeping gene</td></tr><tr><td>Lhx1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm01297482_m1</td><td>Horizontal</td></tr><tr><td>Lim2</td><td>Thermo Fisher Scientific Mm00624623_m1</td><td></td><td>Horizontal</td></tr><tr><td>Nrl</td><td>Thermo Fisher Scientific Mm00476550_m1</td><td></td><td>Fotorreceptores</td></tr><tr><td>Ntrk1</td><td>Thermo Fisher Scientific Mm01219406_m1</td><td></td><td>Horizontal</td></tr><tr><td>Pcp4</td><td>Thermo Fisher Scientific Mm00500973_m1</td><td></td><td>Bipolar, Amacrine</td></tr><tr><td>Pou4f1</td><td>Thermo Fisher Scientific Mm02343791_m1</td><td></td><td>Células ganglionares</td></tr> <tr>de la retina<td>Prdx6</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00725435_s1</td><td>Astrocytes</td></tr><tr><td>Prkca</td><td>Thermo Fisher Scientific Mm00440858_m1</td><td></td><td>Bipolar</td></tr><tr><td>Prox1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00435969_m1</td><td>Horizontal</td></tr><tr><td>Pvalb</td><td>Thermo Fisher Scientific Mm00443100_m1</td><td></td><td>Amacrine</td></tr><tr><td>Rbpms</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm02343791_m1</td><td>Células ganglionares de la retina</td></tr><tr><td>Rom1</td><td>Thermo Fisher Scientific Mm00436364_g1</td><td></td><td>Fotorreceptores</td></tr><tr><td>Rpe65</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00504133_m1</td><td>Retinal Pigment Células epiteliales</td></tr><tr><td>Slc1a3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00600697_m1</td><td>Astrocitos</td></tr><tr><td>Slc6a9</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Mm00433662_m1 Amacrine</td></tr><tr><td>Sncg</td><td>Thermo Fisher Scientific Mm00488345_m1</td><td></td><td>Células ganglionares de la retina</td></tr><tr><td>Tubb3</td><td>Thermo Fisher Scientific Mm00727586_s1</td><td></td><td>Células ganglionares de la retina</td></tr><tr><td>Vim</td><td>Thermo Fisher Scientific Mm01333430_m1</td><td></td><td>M&uuml; Células ller</td></tr><tr><td>Taqman Universal Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4440047</td><td>qPCR Reactivo</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>Aislamiento de ARN</td></tr><tr><td>SuperScript VILO Kit de síntesis de ADNc Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>11754250</td><td>Síntesis de ADNc</td></tr><tr><td>Taqman PreAmp Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4391128</td><td>paso de preamplificación</td></tr><tr><td>BD Cytofix/ Cytoperm</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>554714 Fijación/ Tampón de permeabilización</td></tr><tr><td>BD Perm/ Wash</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>554723 solución de permeabilización</td></tr><tr><td>RBPMS</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-86815</td><td>anticuerpo intracelular</td></tr><tr><td>SNCG</td><td>Gene Tex</td><td>GTX110483</td><td>anticuerpo intracelular</td></tr><tr><td>BRN3A</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>anticuerpo intracelular</td> <td>sc-8429</td></tr><tr><td>TUJ1</td><td>BioLegend</td><td>801202</td><td>anticuerpo intracelular</td></tr></tbody></table>

aislamiento de células primarias de ganglio retiniano murino (rgc) por citometría de flujo

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Las enfermedades neurodegenerativas a menudo tienen un impacto devastador en los afectados. La pérdida de células ganglionares de la retina (RGC) está implicada en una serie de enfermedades, incluyendo retinopatía diabética y glaucoma, además del envejecimiento normal. A pesar de su importancia, RGCs han sido extremadamente difíciles de estudiar hasta ahora debido en parte al hecho de que comprenden sólo un pequeño porcentaje de la gran variedad de células en la retina. Además, los métodos actuales de aislamiento utilizan marcadores intracelulares para identificar RGC, que producen células no viables. Estas técnicas también implican largos protocolos de aislamiento, por lo que hay una falta de métodos prácticos, estandarizados y confiables para obtener y aislar los RGC. Este trabajo describe un método eficiente, completo y confiable para aislar RGC primaria de ratones retinae utilizando un protocolo basado en ambos criterios de selección positivos y negativos. Los métodos presentados permiten el estudio futuro de los CGR, con el objetivo de comprender mejor lasDisminución de la agudeza visual que resulta de la pérdida de RGC funcional en las enfermedades neurodegenerativas.

<html> El estudio en profundidad de los CGR se ve obstaculizado por muchos factores, entre ellos su baja frecuencia y la falta de una metodología robusta y estandarizada para su aislamiento. La Figura 1 muestra la metodología utilizada para el aislamiento de las retina. Existen variaciones en el procedimiento de enucleación basado en el tipo de análisis, como si la enucleación es parte de la experimentación in vivo [ 27]</s...

Millones de personas sufren de enfermedades degenerativas retinianas que resultan en ceguera irreversible. Un elemento común de muchas de estas enfermedades es la pérdida de células ganglionares de la retina (RGCs). Este protocolo detallado describe el aislamiento de los RGC murinos primarios mediante selección positiva y negativa con citometría de flujo.

Aislamiento de células primarias de ganglio retiniano murino (RGC) por citometría de flujo

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar una población homogénea enriquecida de células ganglionares retinianas primarias de ratón. Este método puede ayudar a responder preguntas en el campo de las células ganglionares retinianas sobre los mecanismos subyacentes a la disminución de la agudeza visual en poblaciones de edad avanzada y en poblaciones con enfermedades degenerativas de la retina. La principal ventaja de esta técnica es que puede ofrecer un protocolo rápido, visible, reproducible y estandarizado para el aislamiento de células ganglionares retinianas primarias de ratón enriquecidas.La idea de este método surgió por primera vez cuando Sumana Chintalapudi, quien en ese momento era estudiante de posgrado en mi laboratorio y autora principal de este estudio, presentó en nuestro club de revistas un artículo de 2013 de Krishna Murtheadol, cuyo estudio demostró claramente que la línea celular RGC cinco, originalmente generada como una línea inmortalizada de células ganglionares de la retina de rata, ya no tenía origen en rata, ni poseía el fenotipo de células ganglionares de la retina (RGC). Nos quedó claro que este problema dejaba un vacío importante en los recursos disponibles para la comunidad de investigación en visión, incluido nuestro propio laboratorio. Sumana y yo contactamos al Dr. Morales-Tirado y, juntos, los tres desarrollamos un nuevo método para aislar células ganglionares de la retina viables y altamente enriquecidas.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque los objetivos de este procedimiento consisten en aislar una población celular viva y altamente enriquecida que pueda cultivarse como células primarias o inmortalizarse como una línea celular. Debido a esto, se debe tener mucho cuidado para no dañar las células que se intentan aislar. Además, los parámetros del método de clasificación celular deben ajustarse según las células específicas que se intenten aislar.Ambos métodos requieren conjuntos de habilidades especiales. Las demostraciones de los procedimientos estarán a cargo del Dr. Xiang Di Wang, asociado de investigación del laboratorio de la Dra. Jablonski, y de Zach Goldsmith, candidato a doctorado de mi laboratorio. Para enucleizar el ojo, primero inserte la pinza por debajo del globo ocular.Sujete el nervio óptico y tire hacia arriba. El globo ocular será enucleado con el nervio óptico intacto. Coloque el ojo en un frasco con PBS sobre hielo, y enuclee el otro ojo.Una vez que se hayan recolectado todos los ojos, coloque un ojo en una placa de Petri con PBS fresco bajo un microscopio de disección y use pinzas para sujetar cuidadosamente el globo ocular en la base del nervio óptico. Con una aguja fina de calibre 30, punce la córnea para permitir el drenaje del humor acuoso, lo que facilitará sostener el ojo con las pinzas. Sosteniendo la córnea con las pinzas, use tijeras para hacer una pequeña incisión en el tejido corneal y luego use las pinzas para desprender suavemente la córnea y la esclerótica.Cuando el globo ocular esté pelado hasta la mitad, use la pinza para enrollar la retina y el cristalino. Coloque la retina en una pequeña placa de Petri de 40 milímetros que contenga PBS y 1% FPS dentro de una cabina de seguridad biológica, y lave la retina tres veces con PBS fresco más suero bovino fetal (FBS) en cada lavado. Cuando se hayan lavado todos los ojos, coloque hasta 12 retinas sobre un filtro de nailon estéril de 70 micrones humedecido con PBS y FBS, y macere suavemente las retinas con el extremo posterior del émbolo de una jeringa de 10 mililitros, utilizando un movimiento circular.Una vez que todas las células se hayan disociado, coloque el filtro sobre un tubo de recolección de polipropileno y utilice una pipeta P1000 para filtrar las células a través del filtro hacia el tubo de recolección. Enjuague el filtro con PBS y FBS, recogiendo el lavado en el tubo de recolección. Añada suficiente PBS con FBS para llevar el volumen final a un mililitro de solución por retina y recoja las células mediante centrifugación.Luego, resuspenda el precipitado en PBS más FBS a una concentración de un mililitro de medio por cinco retinas, si se va a realizar la inmunomarcación de inmediato. Alternativamente, incube las células resuspendidas en medio para células neuronales durante la noche a cuatro grados Celsius en posición horizontal. Para inmunomarcar las células retinianas, centrifugue la suspensión de células retinianas y resuspenda el precipitado en 50 microlitros de PBS fresco más FBS en un tubo tipo fax.Reserve cinco veces 10 a la sexta células para el control negativo sin etiquetar. A continuación, bloquee cualquier unión no específica a los receptores Fc en cada tubo con un microlitro de anticuerpo anti-CD16/32 de ratón por cada 1 × 10⁶ células, durante 10 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación de bloqueo, agregue la mezcla de anticuerpos de interés a las células mediante pipeteo suave y realice una incubación de 30 minutos en hielo protegida de la luz.Luego, lave las células dos veces en un volumen final de un litro de PBS y FBS. Etiquete las células con un anticuerpo secundario adecuado durante otros 30 minutos en hielo y protegido de la luz, seguido de dos lavados en PBS más FBS como se acaba de demostrar. Re_suspenda los pellets en PBS y FBS fresco para contar las células.Para ajustar la compensación, agregue tres gotas de microesferas de poliestireno en un tubo de ensayo estéril por cada florafór y un microgramo del florafór respectivo a cada tubo. Incube las microesferas durante 15 minutos a temperatura ambiente protegidas de la luz. Luego, lave las microesferas con tres mililitros de PBS y FBS y retire cuidadosamente el sobrenadante.Re-suspender los pellet de microesferas en 250 microlitros de PBS y suero bovino fetal, y colocar el tubo de muestra sin etiquetar en el citómetro de flujo. En el software del citómetro de flujo, seleccionar el experimento, configurar la compensación y crear controles de compensación. Agregar los controles específicos de florafor de la lista mostrada y hacer clic en Aceptar. Verificar la luz dispersada hacia adelante y la luz dispersada lateralmente, y delimitar la población inicial.Luego, instale el tubo de control negativo en el citómetro y haga clic en cargar. Verifique que se muestre la población de interés o P1 y seleccione la población. Haga clic con el botón derecho en la compuerta P1 y seleccione calcular compensación.Luego haga clic en grabar datos. Cuando finalice la grabación, haga clic en descargar para retirar el tubo y cargue el siguiente tubo control para ajustar los controles de compensación. Cuando se hayan grabado todas las muestras control, cree un gráfico de dispersión directa versus dispersión lateral para el primer tubo experimental y delimite la población P1.A continuación, abra un gráfico pseudocolor de altura de dispersión lateral versus anchura de dispersión lateral y seleccione las células individuales. Utilizando las células individuales, cree un gráfico de altura de dispersión frontal versus anchura de dispersión frontal, y seleccione para excluir los dobletes. Luego, genere un gráfico pseudocolor de CD48 versus CD90.2 y seleccione las células positivas para CD90.2 y negativas para CD48 para eliminar los monocitos, seguido de un gráfico pseudocolor de CD57 versus CD15 para eliminar cualquier contaminante de células amacrinas.Ahora defina las poblaciones que se recopilarán para la muestra en la hoja de diseño de clasificación y separe las células. Al final de la clasificación, utilice una alícuota de 2.5 veces 10 a la cuarta células para confirmar la pureza de la población celular aislada. Después de triturar las retinas en el filtro celular, pueden visualizarse múltiples células de la retina interna, aunque las células ganglionares de la retina hayan perdido su morfología característica debido a la axotomía durante el procedimiento de aislamiento celular.El fenotipo clásico de superficie positivo para el colorante uno y negativo para CD48 no es suficiente para identificar y aislar las células ganglionares de la retina murina, ya que estas células expresan genes asociados con amacrinas, células de Müller, bipolares, horizontales, fotorreceptoras y epitelio pigmentario de la retina. Las células ordenadas también expresan marcadores intracelulares asociados con las células ganglionares de la retina, como la sinucleína gamma, BRN3A, TUJ1 y RBPMS, cuya localización intracelular se confirmó además mediante citometría de flujo con imágenes. Algunas de las células ordenadas incluso comienzan a exhibir morfología de células ganglionares de la retina tras el cultivo celular in vitro.Además, el análisis mediante PCR cuantitativa de la población celular ordenada altamente enriquecida revela un aumento de varios órdenes de magnitud en los genes que codifican marcadores intracelulares específicos de las células ganglionares de la retina. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en menos de seis horas si se realiza adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener la suspensión celular estéril, bloquear los receptores FC de la suspensión celular, evitar la unión no específica de los anticuerpos y discutir con el operador del citómetro de flujo los detalles o la estrategia de clasificación celular.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la QPCR para responder preguntas adicionales sobre el perfilado de la expresión génica. No olvide que el manejo de equipos especializados, como un clasificador celular, requiere un operador altamente especializado. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la visión comprendieran los mecanismos de supervivencia y muerte en las células ganglionares de la retina, contribuyendo así al desarrollo de terapias novedosas para la preservación de la visión.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar una población homogénea enriquecida de células ganglionares retinianas primarias de ratón.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Este artículo proporciona una descripción de cómo analizar y record de la preparación aislada de la retina en el ratón. En particular, se describe la forma de registrar las respuestas de la luz de una población de células ganglionares marcados con fluorescencia y, posteriormente, identificar y analizar su morfología.

Una preparación aislada de retina para registrar la respuesta de la luz a partir de semillas etiquetadas las células ganglionares retinianas

Este video muestra el procedimiento para aislar células ganglionares primarias de la retina (RGCs) murinas mediante citometría de flujo. Este método permite el estudio futuro de las RGCs, con el objetivo de comprender mejor la importante disminución de la agudeza visual que resulta de la pérdida de RGCs funcionales en las enfermedades neurodegenerativas.

Aislamiento de células ganglionares de la retina murinas mediante clasificación celular activada por fluorescencia

Fuente: Laboissonniere, et. al. Secuenciación de ARN unicelular de subconjuntos definidos de células ganglionares de la retina. J. Vis. Exp. (2017).  Este video muestra una técnica de trazado fluorescente para identificar subtipos de células ganglionares de la retina (RGC) en la retina de un ratón transgénico. El proceso consiste en asegurar la retina aislada en una cámara de registro, mantener la viabilidad celular con perfusión oxigenada y dirigirse a las RGC marcadas con fluorescencia...

Identificación de subtipos de células ganglionares de la retina de ratón mediante trazado fluorescente

fagocitosis microglial es crítica para el mantenimiento de la homeostasis del tejido e inadecuada función fagocítica se ha implicado en la patología. Sin embargo, la evaluación de la función de la microglia in vivo es un desafío técnico. Hemos desarrollado una técnica sencilla pero robusto para el seguimiento y cuantificar el potencial fagocítica de microglia en un entorno fisiológico con precisión.

La evaluación de la función retiniana Microglial fagocítica<em&gt; En Vivo</em&gt; El uso de un ensayo basado en citometría de flujo

Aquí, presentamos un enfoque combinatorio para clasificar los tipos de células neuronales antes del aislamiento y para la posterior caracterización de los transcriptomas de una sola célula. Este protocolo optimiza la preparación de muestras para el éxito de secuenciación de ARN (RNA-Seq) y describe una metodología diseñada específicamente para la mejora de la comprensión de la diversidad celular.

RNA-Seq de una sola célula de subconjuntos definidos de células de ganglio retiniano

Este protocolo presenta dos técnicas para aislar los compartimentos subcelulares de los fotorreceptores de bastón murino para el análisis de proteínas. El primer método utiliza retina viva y papel de filtro de celulosa para separar los segmentos externos de la varilla, mientras que el segundo emplea retinas liofilizadas y cinta adhesiva para pelar las capas internas y externas de la varilla.

Dos métodos de peeling para el aislamiento de compartimentos de células fotorreceptoras en la retina del ratón para el análisis de proteínas

Este protocolo describe un método para el aislamiento de células endoteliales retinianas postnatales murinas optimizadas para el rendimiento, la pureza y la viabilidad celular. Estas células son adecuadas para los enfoques de secuenciación de próxima generación.

Aislamiento de células endoteliales retinianas murinas para secuenciación de próxima generación

Este manuscrito describe un protocolo detallado para aislar células de Müller gliales de la retina de ojos de ratón. El protocolo comienza con la enucleación y disección de los ojos de los ratones, seguida del aislamiento, la siembra y el cultivo de las células de Müller.

Aislamiento de células Müller gliales retinianas primarias de ratón

El epitelio pigmentario de la retina (EPR) actúa como una barrera crucial entre la coroides y la retina, promoviendo la salud y la función de los tipos de células de la retina, como los fotorreceptores. En este trabajo se describe un protocolo sencillo y eficaz para el aislamiento y cultivo de EPR murino adulto.

Un método simplificado para el aislamiento y cultivo de células epiteliales pigmentarias de la retina de ratones adultos

Este protocolo describe el procedimiento para aislar la retina de ratón de montaje completo y realizar inmunotinción para marcar todas las células ganglionares de la retina (RGC). Al proceso le siguen las imágenes y el recuento automático de las RGC mediante un software basado en IA, lo que proporciona un método sencillo, rápido y preciso para cuantificar las RGC en toda la retina del ratón.

Inmunotinción de montaje completo y recuento automático de células ganglionares de la retina de ratón

Este artículo presenta un protocolo detallado para aislar células de Müller de retina primaria de ratas Sprague-Dawley (SD) neonatales. El procedimiento incluye la enucleación de los globos oculares, la disección del tejido de la retina, la extracción e identificación de las células, y consideraciones clave para el cultivo celular posterior.

Aislamiento y cultivo de células primarias de Müller en la retina de ratas Sprague-Dawley (SD)

Aprende a aislar células primarias de ganglio retiniano murino mediante citometría de flujo. Este protocolo estandarizado permite obtener poblaciones enriquecidas de RGCs para investigar enfermedades degenerativas de la retina.

Aislamiento de células primarias de ganglio retiniano murino (RGC) por citometría de flujo

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