Name: Cuantificación de la densidad de ramificación en las monturas enteras de la glándula mamaria de rata usando el método de análisis Sholl (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Aprende a cuantificar la densidad de ramificación en glándulas mamarias de rata mediante análisis Sholl modificado en monturas completas. Este método asistido por computadora utiliza software de código abierto para evaluar objetivamente el desarrollo glandular.

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Los autores desean agradecer al Dr. Michael Easterling (Sistemas Social y Científico, Inc., Durham, NC) por su ayuda con la validación de este método y el Dr. Tiago Ferreira (McGill University, Montreal, Quebec, Canadá) Asistencia con la aplicación Sholl.

<ol><li>Sholl, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+organization+of+the+neurons+in+the+visual+and+motor+cortices+of+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Dendritic organization of the neurons in the visual and motor cortices of the cat.</a> J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).</li>
<li>Ferreira, T. A., Iacono, L. L., Gross, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+receptor+1A+modulates+actin+dynamics+and+restricts+dendritic+growth+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serotonin receptor 1A modulates actin dynamics and restricts dendritic growth in hippocampal neurons.</a> Eur J Neurosci. 32 (1), 18-26 (2010).</li>
<li>Stanko, J. P., Easterling, M. R., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Sholl+analysis+to+quantify+changes+in+growth+and+development+in+rat+mammary+gland+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Application of Sholl analysis to quantify changes in growth and development in rat mammary gland whole mounts.</a> Reprod Toxicol. 54, 129-135 (2015).</li>
<li>Assis, S., Warri, A., Cruz, M. I., Hilakivi-Clarke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+Mammary+Gland+Morphology+and+Breast+Cancer+Risk+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats.</a> J. Vis. Exp. (44), e2260(2010).</li>
<li>Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Mammary+Gland+Development+and+Function+in+Mouse+Models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models.</a> J. Vis. Exp. (53), e2828(2011).</li>
<li>Ferreira, T. Sholl Analysis. ImageJ. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://imagej.net/Sholl_Analysis">http://imagej.net/Sholl_Analysis</a> (2012).</li>
<li>Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide. IJ 1.46r. ImageJ. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html</a> (2012).</li>
<li>Tucker, D. K., Foley, J. F., Hayes-Bouknight, S. A., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+High-quality+Hematoxylin+and+Eosin-stained+Sections+from+Rodent+Mammary+Gland+Whole+Mounts+for+Histopathologic+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Preparation of High-quality Hematoxylin and Eosin-stained Sections from Rodent Mammary Gland Whole Mounts for Histopathologic Review.</a> Toxicol Pathol. 44 (7), 1059-1064 (2016).</li>
<li>Fenton, S. E., Hamm, J. T., Birnbaum, L. S., Youngblood, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+abnormalities+in+the+rat+mammary+gland+following+gestational+and+lactational+exposure+to+2%2C3%2C7%2C8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin+%28TCDD%29%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Persistent abnormalities in the rat mammary gland following gestational and lactational exposure to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD).</a> Toxicol Sci. 67 (1), 63-74 (2002).</li>
<li>Murray, T. J., Maffini, M. V., Ucci, A. A., Sonnenschein, C., Soto, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+mammary+gland+ductal+hyperplasias+and+carcinoma+in+situ+following+fetal+bisphenol+A+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Induction of mammary gland ductal hyperplasias and carcinoma in situ following fetal bisphenol A exposure.</a> Reprod Toxicol. 23 (3), 383-390 (2007).</li>
<li>Moral, R., Santucci-Pereira, J., Wang, R., Russo, I. H., Lamartiniere, C. A., Russo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+exposure+to+butyl+benzyl+phthalate+induces+modifications+in+the+morphology+and+the+gene+expression+profile+of+the+mammary+gland%3A+an+experimental+study+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health%22%5BJournal%5D)">In utero exposure to butyl benzyl phthalate induces modifications in the morphology and the gene expression profile of the mammary gland: an experimental study in rats.</a> Environ Health. 10 (1), 5(2011).</li>
<li>Johnson, M. D., Mueller, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+dimensional+multiphoton+imaging+of+fresh+and+whole+mount+developing+mouse+mammary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Three dimensional multiphoton imaging of fresh and whole mount developing mouse mammary glands.</a> BMC Cancer. 13, 373(2013).</li>
<li>Enoch, R. R., Stanko, J. P., Greiner, S. N., Youngblood, G. L., Rayner, J. L., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+gland+development+as+a+sensitive+end+point+after+acute+prenatal+exposure+to+an+atrazine+metabolite+mixture+in+female+Long-Evans+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Persp%22%5BJournal%5D)">Mammary gland development as a sensitive end point after acute prenatal exposure to an atrazine metabolite mixture in female Long-Evans rats.</a> Environ Health Persp. 115 (4), 541-547 (2007).</li>
<li>Hovey, R. C., Coder, P. S., Wolf, J. C., Sielken, R. L., Tisdel, M. O., Breckenridge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+mammary+gland+development+in+female+Long+Evans+rats+following+in+utero+exposure+to+atrazine%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of mammary gland development in female Long Evans rats following in utero exposure to atrazine.</a> Toxicol Sci. 119 (2), 380-390 (2011).</li>
<li>Mandrup, K. R., Hass, U., Christiansen, S., Boberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinatal+ethinyl+oestradiol+alters+mammary+gland+development+in+male+and+female+Wistar+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Inter+J+of+Androl%22%5BJournal%5D)">Perinatal ethinyl oestradiol alters mammary gland development in male and female Wistar rats.</a> Inter J of Androl. 35 (3), 385-396 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Desde el nacimiento hasta la pubertad, el crecimiento de la glándula mamaria es alométrico. Después de la pubertad, la glándula mamaria se desarrolla a través de ramificaciones ductales extensas y elongación, que continúan hasta que el epitelio mamario ocupa la almohadilla de grasa entera. Las características de ramificación son un aspecto importante del desarrollo de la glándula mamaria y la capacidad de cuantificar objetivamente estas características puede ser muy útil para evaluar el desarrollo mamario normal y para ...

La ramificación de las glándulas mamarias es una característica que comúnmente se evalúa como un indicador del desarrollo de las glándulas, pero es difícil de cuantificar objetivamente. En 1953, Sholl 1 describe un método para medir arborización dendrítica neuronal en las cortezas visuales y motoras del gato, y un plugin para esta técnica fue desarrollada por Ferriera et al 2. Debido a que las neuronas y las glándulas mamarias exhiben una estructura parecida a un árbol similar, el plugin se empleó para cuantificar las densidades de ramificación epitelial mamaria en imágenes 2D de la glándula mamaria peripubertal de rata. La etapa peripuberal fue elegida para el análisis porque el destete es una etapa de la vida que se evalúa a menudo en los laboratorios académicos y los estudios de la guía de la prueba. El análisis de Sholl es un plugin distribuido con FIJI, que es el paquete de procesamiento de imágenes de código abierto ImageJ, con complementos adicionales incluidos. El complemento crea una serie de anillos concéntricos que rodean un prefijo(Típicamente el soma de una neurona o el origen del conducto primario de una glándula mamaria) y extendiéndose hacia fuera hasta la porción más distal del objeto (el radio envolvente). A continuación, cuenta el número de intersecciones (N) que se producen en cada uno de los anillos. El complemento también devuelve un coeficiente de regresión de Sholl ( k ), que es una medida de la tasa de decaimiento de la ramificación epitelial. Utilizando ImageJ, se crea una imagen esqueletizada de una glándula mamaria de montaje completo y se mide el área epitelial mamaria (MEA). La imagen se analiza utilizando el plugin de análisis de Sholl, y se devuelven valores para N yk , entre otros valores no utilizados aquí. La densidad de ramificación epitelial mamaria se determina mediante el cálculo de N / MEA. La extensión a la cual la ramificación continúa en las regiones externas del epitelio glandular es la complejidad de la ramificación y es un indicador del crecimiento epitelial distal uniforme. Como k es una medida de la disminución distal en epítetoEs una medida eficaz de la complejidad ramificada y un indicador fiable del desarrollo mamario. Este protocolo describe un método asistido por ordenador para crear imágenes esqueletizadas de glándulas mamarias globales y evaluar cuantitativamente las características de ramificación mamaria en ratas peripuberales macho y hembra. Este método es relativamente rápido y no requiere el uso de equipos de microscopía especializados. El desarrollo y la validación de este método se describen en Stanko et al. (2015) 3 . Este informe también describe la preparación de glándulas mamarias de rata enteras = monturas. Se han descrito procedimientos mamarios de montaje completo similares en de Assis et al. (2010) 4 y Plante et al. (2011) 5 .

<table><tbody><tr><td>Tablero de disección</td><td>NA</td><td>NA Un</td><td>trozo de espuma de poliestireno de aproximadamente 10"x12" es adecuado.</td></tr><tr><td>Disección de T-Pins</td><td>Daigger EF7419A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Botella de spray con etanol</td><td>NA</td><td>NA</td><td>70% de etanol es adecuado.</td></tr><tr><td>Tijeras de disección curvas Fine</td><td>Science Tools</td><td>14569-09</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de disección rectas</td><td>Fine Science Tools</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas curvas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11003-12</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 24 x 75 x 1 mm portaobjetos de microscopio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4951PLUS-001</td><td>Thermo Scientific Superfrost Plus & Los portaobjetos Colorfrost Plus sujetan las secciones de tejido de forma permanente sin necesidad de costosos recubrimientos en aplicaciones de IHQ y patología anatómica. Este tratamiento reduce la pérdida de tejido durante la tinción, así como las horas de preparación del portaobjetos. Los portaobjetos atraen electrostáticamente secciones de tejido congelado y preparaciones citológicas y cuentan con una química similar al silano, aunque optimizada para mejorar el rendimiento de la aplicación. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4951PLUS4.&nbsp;</td></tr><tr><td>Fisherfinest Cubreobjetos Premium 24 x 60 x 1 mm</td><td>Fisher scientific</td><td>12-548-5P</td><td></td></tr><tr><td>Bemis Parafilm M Película de envoltura de laboratorio</td><td>Fisher scientific</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9967</td><td></td></tr><tr><td>Absoluto de etanol, &ge; 99.8% (GC)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24102</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>Alumbre Carmín&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1022</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de aluminio y potasio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6435</td><td></td></tr><tr><td>Medios de montaje Permount Fisher</td><td>Scientific</td><td>SP15</td><td></td></tr><tr><td>Macroscopio</td><td>Leica</td><td>Z16 APO&nbsp;</td><td>Este es el hardware y software de captura de imágenes utilizado en este laboratorio. Como hay muchas opciones diferentes, los métodos y aplicaciones pueden variar de un laboratorio a otro.</td></tr><tr><td>Cámara digital</td><td>Leica</td><td>DFC295</td><td></td></tr><tr><td>Software de cámara</td><td>Leica</td><td>Leica Application Suite v3.1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Software ImageJ</td> Análisis de <td>código abierto</td><td>http://imagej.net/Welcome</td><td></td></tr><tr><td>Sholl&nbsp;</td><td>http://imagej.net/Sholl_Analysis</td><td></td> <td>de código abierto</td></tr></tbody></table>

cuantificación de la densidad de ramificación en las monturas enteras de la glándula mamaria de rata usando el método de análisis sholl

Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method

Un número creciente de estudios están utilizando la glándula mamaria de roedor como punto final para evaluar la toxicidad de desarrollo de una exposición química. Los efectos que estas exposiciones tienen en el desarrollo de la glándula mamaria se evalúan típicamente usando mediciones dimensionales básicas o marcando características morfológicas. Sin embargo, la amplia gama de métodos para interpretar los cambios en el desarrollo podría llevar a traducciones inconsistentes entre los laboratorios. Se necesita un método común de evaluación para que las interpretaciones adecuadas puedan formarse a partir de los datos que se comparan entre los estudios. El presente estudio describe la aplicación del método de análisis Sholl para cuantificar las características de ramificación de las glándulas mamarias. El método de Sholl se desarrolló originalmente para su uso en la cuantificación de patrones dendríticos neuronales. Mediante el uso de ImageJ, un paquete de software de análisis de imágenes de código abierto, y un complemento desarrollado para este análisis, la densidad de ramificación de la glándula mamaria y la complejidad de la amSe determinó la glándula mamaria de una rata hembra peripubertal. Los métodos descritos aquí permitirán el uso del análisis de Sholl como una herramienta eficaz para cuantificar una característica importante del desarrollo de la glándula mamaria.

Los valores para el radio cerrado medido, MEA, N, k , y densidad de ramificación calculada para la glándula mamaria analizada en este protocolo se presentan en la Tabla 1 . El análisis de Sholl genera diagramas lineales y semi-log del número de intersecciones en cada radio ( Figura 9 ) y, si se selecciona, un mapa de calor de las intersecciones ( Figura 10 ). Las glándulas menos desarrolladas exhiben me...

El desarrollo de la glándula mamaria en el roedor se ha evaluado típicamente mediante evaluaciones descriptivas o mediante la medición de atributos físicos básicos. La densidad de ramificación es un indicador del desarrollo mamario que es difícil de cuantificar objetivamente. Este protocolo describe un método fiable para la evaluación cuantitativa de las características de ramificación de las glándulas mamarias.

Cuantificación de la densidad de ramificación en las monturas enteras de la glándula mamaria de rata usando el método de análisis Sholl

An increasing number of studies are utilizing the rodent mammary gland as an endpoint for assessing the developmental toxicity of a chemical exposure. The ...

El objetivo general de este método asistido por computadora es cuantificar de manera objetiva la densidad de ramificación y la decadencia de la ramificación en glándulas mamarias, dos indicadores importantes del desarrollo en roedores, mediante la aplicación de un análisis de Sholl modificado a imágenes de preparaciones completas de glándulas mamarias. Este método puede ayudar a responder preguntas en el campo de la biología de la glándula mamaria, como la forma en que la exposición a sustancias químicas puede alterar el desarrollo de la glándula mamaria. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza software de código abierto para cuantificar de manera objetiva características fundamentales del desarrollo de la glándula mamaria.Para este procedimiento, disponga de imágenes de preparaciones completas que muestren el epitelio glandular a un aumento fijo. Para comenzar, abra una imagen en ImageJ. A continuación, seleccione la herramienta de trazo libre.Dibuje un trazo alrededor del epitelio glandular y limpie el área circundante. Luego, dibuje un trazo alrededor del ganglio linfático y elimine esta parte de la imagen con el comando de corte. Si el fondo de la imagen es negro, d

quantifying-branching-density-rat-mammary-gland-whole-mounts-using

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

El protocolo describe cómo diseccionar la rata de las glándulas mamarias abdominales y la forma de preparar montajes de la glándula mamaria completa. También se describe la forma de analizar la morfología de la glándula mamaria con tres puntos finales (número de yemas terminales de final, la elongación y la diferenciación del epitelio) y utilizar estos resultados para predecir el riesgo de cáncer de mama en ratas que fueron expuestas a modificaciones en la...

Los cambios en la morfología de la glándula mamaria y el riesgo de cáncer de mama en ratas

Este método describe la forma de analizar y evaluar el desarrollo de la glándula mamaria y la función de los ratones. Extirpado las glándulas mamarias son evaluados por el grado de desarrollo con montaje completo, mientras que la eyección de leche se evaluó mediante un ensayo basado en la oxitocina contracción de las células mioepiteliales.

Evaluación de la glándula mamaria de desarrollo y función en modelos de ratón

Presentamos un enfoque de registro de imágenes para la reconstrucción del volumen histológico en 3 dimensiones (3D), que facilita el estudio de los cambios de un órgano a nivel de macroestructuras formadas por células. Utilizando este enfoque, estudiamos los cambios en 3D entre las glándulas mamarias de tipo salvaje y las glándulas mamarias nulas de Igfbp7.

Reconstrucción de 3-Dimensional Volumen Histología y su aplicación al estudio del ratón glándulas mamarias

Las uniones intercelulares son requisitos para las funciones y desarrollo específicos de la glándula mamaria. Este manuscrito proporciona un protocolo detallado para el estudio de las interacciones proteína-proteína (IPP) y co-localización utilizando glándulas mamarias murinas. Estas técnicas permiten investigar la dinámica de la asociación física entre las uniones intercelulares en diferentes etapas del desarrollo.

Análisis de las interacciones proteína-proteína y co-localización entre los componentes de la separación, estrecha, y adhiere a las uniones en las glándulas mamarias murinas

Desarrollamos un método para eliminar, procesar, seccionar y teñir exitosamente, para la evaluación histopatológica, el tejido mamario que originalmente había sido fijado en diapositivas como monturas enteras. Este método puede promover la recolección y evaluación de monturas enteras de glándulas mamarias en estudios de referencia de pruebas reproductivas y de desarrollo.

Seccionando los Montes Enteros de las Glándulas Mamarias para la Identificación de Lesiones

Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento de entero, intacto el ratón glándulas mamarias para investigar la expresión de matriz extracelular (ECM) y morfología ductal. Las glándulas abdominales de ratón #4 se extrajeron de ratones femeninos nulíparas del 8-10 semanas de edad fijado en formalina tamponada neutra, seccionadas y teñido mediante inmunohistoquímica para las proteínas de la ECM.

Aislamiento de las glándulas mamarias del ratón intacto, todo para el análisis de expresión de la matriz extracelular y la morfología de la glándula

Presentamos un método bastante simple y sensible para la cuantificación precisa de la densidad de las vías biliares en el hígado del ratón. Este método puede ayudar a determinar los efectos de los modificadores genéticos y ambientales y la eficacia de las terapias potenciales en modelos de ratón de enfermedades biliares.

Determinación de la densidad del conducto biliar en el hígado del ratón

Este artículo describe un método de trasplante para injertar células epiteliales mamarias de ratas de donantes en la almohadilla de grasa blanca interescapular de los animales receptores. Este método se puede utilizar para examinar los efectos del huésped y/o del donante en el desarrollo del epitelio mamario y elimina la necesidad de pre-clearing, extendiendo así la utilidad de esta técnica.

Trasplante de células epiteliales de rata mamaria en la almohadilla de grasa blanca interescapular

Este protocolo describe una nueva ventana de imágenes mamarias con una tapa reemplazable (R.MIW). La microscopía intravital después de la implantación del R.MIW permite obtener imágenes longitudinales y de varios días de la glándula mamaria sana y enferma con una resolución celular durante las diferentes etapas del desarrollo.

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Se describe un procedimiento para la administración de una solución ablativa química al árbol ductal mamario de rata para el tratamiento preventivo guiado por imágenes del cáncer de mama. Las células epiteliales mamarias pueden ser atacadas con un daño tisular colateral mínimo a través de la canulación directamente en la abertura del pezón y la infusión intraductal de una solución ablativa a base de etanol al 70%.

Visualización de rayos X del tratamiento ablativo intraductal a base de etanol para la prevención del cáncer de mama en modelos de rata

Aquí, describimos un protocolo simple y económico para realizar una cuantificación no sesgada de la densidad microvascular pulmonar para tejido pulmonar de ratones enteros utilizando la tinción única de Isolectin B4.

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Cuantificación de la densidad de ramificación en las monturas enteras de la glándula mamaria de rata usando el método de análisis Sholl (Video) | JoVE Journal

Cuantificación de la densidad de ramificación en las monturas enteras de la glándula mamaria de rata usando el método de análisis Sholl

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