Cuantificación de la densidad de ramificación en las monturas enteras de la glándula mamaria de rata usando el método de análisis Sholl

El objetivo general de este método asistido por computadora es cuantificar de manera objetiva la densidad de ramificación y la decadencia de la ramificación en glándulas mamarias, dos indicadores importantes del desarrollo en roedores, mediante la aplicación de un análisis de Sholl modificado a imágenes de preparaciones completas de glándulas mamarias. Este método puede ayudar a responder preguntas en el campo de la biología de la glándula mamaria, como la forma en que la exposición a sustancias químicas puede alterar el desarrollo de la glándula mamaria. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza software de código abierto para cuantificar de manera objetiva características fundamentales del desarrollo de la glándula mamaria.

Para este procedimiento, disponga de imágenes de preparaciones completas que muestren el epitelio glandular a un aumento fijo. Para comenzar, abra una imagen en ImageJ. A continuación, seleccione la herramienta de trazo libre.

Dibuje un trazo alrededor del epitelio glandular y limpie el área circundante. Luego, dibuje un trazo alrededor del ganglio linfático y elimine esta parte de la imagen con el comando de corte. Si el fondo de la imagen es negro, debe convertirse a blanco.

Haga clic en Editar, luego en Opciones y luego en Colores. En el cuadro de diálogo, seleccione blanco en el menú desplegable de las opciones de fondo. Aunque el fondo pueda permanecer negro, se tratará como blanco al procesar la imagen.

Ahora, separe los canales de color en tres imágenes en escala de grises de ocho bits. Luego, seleccione el canal con el mejor contraste, que normalmente es el canal azul. Ahora, reste el fondo del canal de color seleccionado.

A continuación, continúe seleccionando los parámetros deseados y visualizando los cambios. Verifique el fondo claro y visualice la vista previa en el cuadro de diálogo, luego ajuste el número de píxeles hasta obtener el contraste deseado. Si se necesita un contraste adicional, utilice la opción Máscara de enfoque.

Compruebe la vista previa en el cuadro de diálogo y ajuste el radio de píxeles y el peso de la máscara hasta obtener el contraste deseado. Después de aplicar el filtro de máscara de nitidez, elimine el borde que fue creado por el filtro. Haga clic en el botón de doble flecha roja en la barra de herramientas y seleccione Herramientas de dibujo.

Luego, seleccione la herramienta Borrador. Ajuste su diámetro haciendo clic derecho en el botón de la herramienta borrador y luego mantenga presionado el botón izquierdo del mouse para borrar el borde. Solo se permite un nivel de Deshacer mientras se borra, así que tenga cuidado.

Después de aplicar uno de los filtros, elimine manualmente el ruido restante. Consulte una copia de la imagen original y elimine el ruido identificado haciendo primero clic en el botón de doble flecha roja en la barra de herramientas y seleccionando las herramientas de dibujo. Luego, elija la herramienta de borrado.

Ajuste su diámetro haciendo clic derecho en el botón de la herramienta de borrado. Luego, mantenga presionado el botón izquierdo del mouse para eliminar el ruido. Solo se permite un nivel de deshacer durante el borrado, así que tenga cuidado.

A continuación, ajuste el umbral de la imagen. Mueva los controles deslizantes para ajustar los valores mínimos y máximos del umbral con el fin de mejorar la imagen de la glándula. Luego, haga clic en Aplicar.

Elimine el ruido adicional automáticamente utilizando uno de dos métodos. La primera opción es usar el comando despeckle. La segunda opción es usar el comando remove outliers.

Este proceso solo sustituye un píxel por la mediana de su entorno inmediato si el píxel se desvía de la mediana en más de un valor umbral definido por el usuario. Ahora, utilizando la imagen original para comparación, reconstruya partes del epitelio glandular que fueron eliminadas mediante umbralización y eliminación de ruido. Al reconstruir la imagen, asegúrese de hacerlo con cuidado y de manera mínima para mantener la integridad de la imagen.

Seleccione la herramienta de lata de aerosol de las herramientas de dibujo. Haga clic con el botón derecho en el botón de la herramienta de lata de aerosol para ajustar el tamaño de la herramienta, luego rellene cuidadosamente las secciones faltantes de la glándula utilizando el botón izquierdo del ratón. A continuación, cree una imagen esqueletizada de la glándula para el análisis de Sholl.

Primero, coloque la imagen en un formato binario. Luego, esqueletice la imagen. Este proceso elimina repetidamente píxeles de los bordes de la imagen binaria hasta que se reduce a una forma de un solo píxel de ancho.

Ahora, dilate la imagen una vez para cerrar los espacios creados por el umbralizado y el esqueletizado. Luego, guarde la imagen como un archivo nuevo utilizando el comando guardar como. Finalmente, verifique la precisión de la imagen esquelética en comparación con la original superponiendo las dos imágenes.

En el cuadro de diálogo para agregar imagen, seleccione la imagen del esqueleto y establezca su opacidad en 30 %. A continuación, guarde la superposición como una imagen nueva para referencia futura. Para comenzar, abra una imagen del esqueleto y convierta la imagen en un formato binario. Ahora, defina la escala de la imagen.

Introduzca el número de píxeles por milímetro, luego configure tanto la distancia conocida como la relación de aspecto de píxeles en uno, a continuación introduzca milímetros como unidad de longitud y active la opción global para aplicar la escala a todas las imágenes. A continuación, determine el radio final para el análisis de Sholl utilizando la herramienta de dibujo de líneas. Dibuje una línea desde el inicio del conducto principal hasta el punto más distal del epitelio glandular.

Luego, presione la tecla M y se informará la distancia de la línea. Ahora, introduzca los ajustes para el análisis de Sholl. Primero, seleccione las opciones en la sección definición de capas, establezca el radio inicial en 0,00 milímetros y establezca el tamaño del paso del radio en 0,1 milímetros.

Establezca el número de muestras en uno. La longitud de la línea recién dibujada se ingresa automáticamente en el campo de radio final. Para las opciones de múltiples muestras por radio, seleccione media para la integración.

Para los descriptores y las opciones de ajuste curvo, establezca el valor de corte del radio envolvente en uno. Elija inferir a partir del radio inicial para el número de ramas primarias y seleccione las opciones de grado de ajuste lineal y mejor ajuste. Luego, en perfiles sin normalización, seleccione el más informativo.

Ahora, en la sección de métodos de Sholl, seleccione área para el perfil normalizado. Por último, en la sección de salida, elija crear máscara de intersecciones para generar un mapa de calor de las intersecciones. Ahora, abra una ventana de vista previa de la imagen con anillos y confirme el área de análisis.

Si todo se ve bien, haga clic en aceptar para ejecutar el análisis. La ejecución del análisis creará una ventana lineal de perfil de Sholl, una ventana de perfil de Sholl semilogarítmica, una ventana de resultados de Sholl, que contiene todos los valores de salida de Sholl, y una ventana de nombres de archivo de perfiles de Sholl, que proporciona el número de intersecciones en cada radio determinado por el polinomio. Para medir la MEA, trabaje a partir de la imagen esquelética de la glándula en ImageJ.

Abra la herramienta de polígono y dibuje un polígono alrededor del perímetro de la glándula. Utilice clics del ratón para agregar segmentos de línea. Cuando se haya rodeado completamente el área epitelial, haga doble clic para cerrar el polígono.

Luego, presione la tecla M para abrir una ventana de resultados. El valor en la columna de área corresponde al área epitelial mapeada (MEA). Si el epitelio glandular se extiende más allá del ganglio linfático, reste el área del ganglio linfático al MEA al calcular la densidad de ramificación.

El área del ganglio linfático se puede medir de la misma manera que el MEA. Mediante los métodos descritos, se analizaron dos grupos de ratas con edades emparejadas. Los animales del grupo B fueron tratados con una sustancia química conocida por provocar un desarrollo precoz de la glándula mamaria.

Representar gráficamente el número de intersecciones de ramificaciones a lo largo del radio desde la glándula ilustra la variación en los resultados. Los resultados del análisis de Sholl revelaron una diferencia clara en el número medio de intersecciones entre los grupos. Sin embargo, los datos de intersecciones deben normalizarse respecto al área de la glándula mamaria para poder extraer conclusiones.

El análisis de Sholl y las mediciones del área epitelial de la glándula mamaria proporcionan dos parámetros fisiológicos útiles para realizar análisis comparativos. Es evidente que el tamaño de las glándulas fue mucho mayor en el grupo de tratamiento. El análisis de Sholl devuelve el valor de Sum N, que se utiliza para calcular la densidad de ramificación y el valor de k.

En el grupo de tratamiento, la mayor densidad media de ramificación y el valor medio más bajo de k, que refleja una tasa menor de decaimiento de la ramificación, indican que los animales tratados tenían glándulas más desarrolladas que los animales no tratados. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que la eliminación del ruido es el paso más crucial. Eliminar demasiado o demasiado poco puede alterar la integridad de la glándula y sesgar los resultados.

Al utilizar este método, es importante comenzar con un montón completo de glándula mamaria intacto. No se puede obtener una imagen esqueletizada precisa si existen imperfecciones, como desgarros o pliegues. Crear una imagen esqueletizada precisa requiere paciencia y práctica.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 15 a 20 minutos por glándula analizada si se realiza correctamente.