Name: Automatizado de protocolos de cristalización Macromolecular en el laboratorio MRC de Biología Molecular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Aprende a automatizar protocolos de cristalización de macromoléculas mediante difusión de vapor con gotas nanométricas. Este método permite preparar hasta 1.920 experimentos para obtener cristales de alta calidad en estudios de biología estructural.

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La instalación de cristalización de MRC-LMB es amablemente respaldado por el Medical Research Council (Reino Unido). Agradecemos a los miembros del LMB por su apoyo: Olga Perisic (PNAC) y Tony Warne, Fusinita Van den Ent, Pat Edwards (estudios estructurales), Steve Scotcher, los otros miembros del taller mecánico, Neil Grant y Jo Westmoreland (ayudas visuales), Paul Hart y Tom Pratt (IT). También nos gustaría dar las gracias a Steve Elliot (Tecan, Reino Unido), Mitchell Stuart y Heather Ringrose (robótica de Hamilton, Reino Unido), Paul Thaw, Robert Lewis y Joby Jenkins (TTP Labtech, UK), Paul Reardon (Swissci AG, Suiza), George Stephens y Donald Ogg (Alphabiotech, Reino Unido), Neil Williams (Markem Imaje, Reino Unido) y Graham Harris (la Agencia de Cleveland) para la ayuda técnica.

1. los dos sistemas (proyección inicial) totalmente automáticos
<ol><li>
Sistema 1: preparación de placas de 96 pocillos cristalización 72 lleno de proyección kits (placas LMB)
	<ol>
<li>Antes de realizar el procedimiento, asegúrese de que los robots del sistema son inicializados y su software de control está abierta. Encienda el refrigerador de la compañía tubo de enfriamiento aproximadamente 30 minutos antes de iniciar el programa principal.</li>
		<li>Coloque una placa de prueba en la compañía SBS motorizada del sellador de placa. Ejecute el sellador de placa y compruebe que la película se aplica adecuadamente. Repita esta prueba dos veces más para verificar que el sellador de placa está listo.</li>
		<li>Luego, añada 20 L de agua desionizada en el contenedor principal del controlador del líquido. Desconecte los insertos de acople del recipiente pequeño (etanol del 20% solución de enjuague) y conectar los insertos en el contenedor principal.</li>
		<li>Escriba el nombre de pantalla apropiada (tabla 1) en la pantalla táctil de la impresora de inyección de tinta. A continuación, abra y cierre la puerta de carrusel para activar la rotación del carrusel. Abrir la puerta cuando se presenta la primera pila.</li>
		<li>La primera pila con 22 placas de cristalización, cada uno con la cara de la columna 1 de cargarse hacia fuera. De la misma forma de cargarse las dos pilas.</li>
		<li>Carga de las 6 placas restantes en las posiciones más altas de la pila de cuarto. A continuación, cierre la puerta del carrusel.</li>
		<li>Verificar que el display del refrigerador indica 14 ° C. Suavemente y varias veces invierten los kits de detección seleccionado durante 1 minuto. A continuación, abra el panel frontal del controlador del líquido.</li>
		<li>Abrir los tubos y colocarlos en el transportador de enfriamiento según la disposición estándar de 96 pocillos (A1, A2, etcetera). Al colocar cada tubo en el portabebé, coloque la tapa sobre una bandeja en el mismo diseño de 96 pocillos.</li>
		<li>Comprobar el tubo de posiciones y asegurar que todos los tubos de nivel y se instalaron en el portador. A continuación, cierre el panel frontal.</li>
		<li>En la ventana de 'Inicio' del software controlador líquido, seleccione "Ejecutar mantenimiento" y abrir el programa de lavado. Ejecute el programa para eliminar el etanol del 20% del sistema y el exterior de las puntas de dosificación de líquido de lavado.</li>
		<li>Cuando termine la descarga, haz clic en 'Cancelar' para volver a la 'Startup'. Seleccione 'Ejecutar un proceso existente' y pulse 'Inicio su selección. Abrir el programa 'MRC kit distribución'. Rellene '18' para 'Casos' en la configuración de la pantalla y ejecutan el programa.</li>
		<li>Monitor del sistema están marcados los cuatro primeros platos, llenado y sellado.</li>
		<li>Una vez que todas las 72 placas han sido preparadas y colocados en el carrusel, cambiar los insertos de acople del contenedor principal para el recipiente. Ejecute el programa de 'Puesta en marcha flush' (ver paso 1.1.10).</li>
		<li>Apagar el refrigerador y deseche el vacío kit tubos de detección. Cuidadosamente retire las placas preparadas 72 el carrusel. Deseche el llenado incorrectamente o mal sellado de las placas. Almacenar las placas listo para su uso a 10 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sistema 2: configuración de gotas de cristalización (proteína nL 100 + 100 nL condición) de una muestra de 20 placas LMB
	<ol>
<li>En primer lugar, asegúrese de que robots del sistema están en el dispensador nanoliter se inicializa con el software abierto y administrador del método del controlador líquido está abierta. Gire en el transportador de enfriamiento microtubo unos 15 minutos antes de iniciar el programa principal.</li>
		<li>Coloque una placa de prueba en la compañía SBS motorizada del sellador de placa. Ejecute el sellador de placa y verificar que la placa está correctamente sellada. Pruebe el sellador de placa tres veces.</li>
		<li>A continuación, ejecute el nanoliter dispensador para nL 100 gotas de solución de la prueba en una placa de prueba. Ver bajo un microscopio que las gotas están ajustadas correctamente. Cierre el software de dispensador nanoliter y retire el bloque del sostenedor de la tira de la cubierta.</li>
		<li>A continuación, inserte en el portaplacas personalizados (ver Resultados de representante: cristalización dispositivos desarrollados en el LMB) la placa de la LMB con la mayor cantidad relativa de reactivos volátiles en sus condiciones (tabla 1). Quite la película adhesiva de la placa.</li>
		<li>Abrir el panel frontal del controlador líquido y coloque la placa no sellada en la cubierta, en la parte posterior de la primera compañía de deslizamiento (deslizamiento portadores puede sacarse para facilitar el acceso).</li>
		<li>Cubra la placa con una tapa de aluminio de la SBS. Colocar la tapa hacia la esquina posterior izquierda del portador aplicando presión suave en la esquina opuesta de la tapa.</li>
		<li>Unseal, cargar en los portadores de la correderos y cubrir las restantes 19 placas de la misma manera, trabajar de más a menos volátiles condiciones. Una vez que el portador de microtubo de enfriamiento a 4 ° C, como se indica por una luz verde, retire su tapa.</li>
		<li>Cortar la tapa de un microtubo que contiene (al menos) 440 μl de la muestra de proteína (cuadro 2). Asegúrese de que la muestra no tiene ninguna espuma sobre el menisco, como esto interferirá con el sistema de detección de líquido. Coloque el tubo en la posición 1 del portador del microtubo de enfriamiento.</li>
		<li>Coloque una placa de la polimerización en cadena en la cubierta de líquido controlador frente el portador adaptador placa móvil. A continuación, cierre el panel frontal.</li>
		<li>Después de cargar la cubierta, asegúrese de que la cubierta de dispensador nanoliter está clara del bloque del sostenedor de la tira y que los portadores en la parte posterior de las pilas de punta de 50 μl de las tapas de aluminio SBS.</li>
		<li>En la interfaz de controlador líquido 'Método de gestión', seleccione 'Configuración de placas'. Controlar la inicialización de ambos sistemas y rellene los parámetros de funcionamiento. Seguir las directrices de la interfaz del método de gestión (avisos, figuras y un sistema de gestión de punta ayuda con la preparación).</li>
		<li>Comprobar que todos los necesarios componentes están listos y luego iniciar el proceso.</li>
		<li>Monitor del sistema como el dispensador de nanoliter pone las gotas en la primera placa y el sellador de placa posteriormente sella la placa.</li>
		<li>Una vez que todas las 20 placas han sido preparadas con gotitas de cristalización y volverá automáticamente a los portadores de la correderos, abrir el panel frontal y retire suavemente las placas. Compruebe que las placas estén selladas correctamente antes de almacenar para la cristalización.</li>
		<li>Limpie las tapas de la SBS con una solución de etanol al 20% antes de apilarlos en el lado izquierdo del controlador del líquido para el almacenamiento. Deseche la placa de la polimerización en cadena y microtubo.</li>
		<li>Apague el transportador enfriamiento microtubo y limpie la condensación. Deje una toalla de papel sobre la superficie del evaporador para absorber la condensación. A continuación, vuelva a colocar la cubierta del portador y cierre el panel frontal.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. optimización de las condiciones
<ol><li>
Jeringa-manejador basado en el líquido: producir dos gradientes lineales de concentraciones en los embalses de una placa de cristalización (el método de la esquina 4).
	<ol>
<li>Primero, asegúrese de que el controlador de líquido en e inicializado con su software abierto.</li>
		<li>En el 'gradiente' tab: abrir el programa deseado, seleccione el tipo de placa de cristalización y el volumen final en los reservorios (tabla 3). La configuración avanzada para 'máximo tiro vol' debe ser bajada de 6.000 a 3.000 al utilizar soluciones que contengan [isopropanol] > 10% v/v y [MPD] > 20% v / v.
</li>
		<li>Preparar las jeringas. Colocar un pistón en cada jeringa (extremos puntiagudos hacia abajo) e introduzca la parte posterior de las jeringas en las ranuras designadas por debajo de la cabeza del robot. La torcedura derecha para bloquearlo en posición (el programa se iniciará sólo con todas las jeringas requiere conectadas correctamente) una jeringa.</li>
		<li>Preparar los canales. Retire el marco de acero inoxidable e inserte las artesas. Las 4 posiciones a la izquierda corresponden a las 4 esquinas A, B, C, D. interruptor de lengüeta 'SET UP' que muestra los volúmenes de soluciones necesarias en cada jeringa (en la tabla 3, 0.5 mL de volumen muerto fue agregado a los volúmenes de muestra). Verter las soluciones de esquina en sus canales respectivos y coloque el marco en la cubierta (la estructura se mantiene en posición con 2 pequeños imanes situados en la parte delantera de la cubierta). Una forma alternativa para proceder con este paso es verter las soluciones en los canales cuando ya se colocan en la bandeja.
</li>
		<li>Coloque la placa de cristalización en el transportador motorizado de la SBS.</li>
		<li>Haga clic en 'Aspirar' y esperar a que este paso a ser completado (cuando los pistones se detuvo en su camino).</li>
		<li>Cambie a la pestaña de 'RUN' y ejecutar el programa.</li>
		<li>Al finalizar el programa, volver a la ficha Configuración y haga clic en 'Eliminar': el sistema de purga las jeringuillas con las soluciones sobrantes de y entonces levanta los pistones completamente. 'Purga' puede solicitarse en lugar de 'Eliminar'; esto dejará los pistones en la posición inferior, lista para aspirar a soluciones más con las mismas jeringas.
</li>
		<li>Retire las jeringas girándolas hacia la izquierda.</li>
		<li>Deseche las jeringas y canales en el contenedor apropiado (o enjuague con agua desionizada y luego solución etanol al 20% v/v para su reutilización).</li>
		<li>Sellar la placa y coloque en el mezclador de microplacas para 3 minutos a 1.000 rpm, o 10 minutos cuando se mezclan soluciones altamente viscosas. La placa está lista para configurar gotitas de cristalización en el dispensador nanoliter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Añadido detección protocolo 1 (configuración de gotitas de cristalización en una placa de 96 pocillos cristalización precargada con pantalla aditivo)
	<ol>
<li>En primer lugar, preparar las condiciones con las concentraciones iniciales de los reactivos aumentadas un 10% (mínimo vol. 15 mL al transferir la condición de un contenedor en la pantalla del aditivo con el controlador de líquido).</li>
		<li>Asegúrese de que el controlador de líquido está listo para funcionar. Abrir el programa 'Pantalla agregar aditivos' para una sola placa (Introduzca el volumen en depósitos: 'μl 72'). De los avisos, figuras y una punta-sistema (puntas 12 x 1.000 μl necesarias) ayuda con asegurándose de que el robot está listo para funcionar según las selecciones de.
</li>
		<li>Recuperar la pantalla de la incubadora de-20 ° C y retirar inmediatamente el sello de aluminio (utilice el sostenedor de la placa), luego colocar la placa en la cubierta del controlador del líquido. El programa opera de acuerdo con un diseño de retratos (la placa se coloca con la esquina A1 ubicada en la parte delantera izquierda del portador de la). También colocar también el recipiente llenado con la condición. Ejecute el programa.</li>
		<li>Una vez que se han llenado los depósitos de la placa, colocar en el agitador de microplacas y ejecutar el programa. Enjuague el recipiente de condición con desionizada agua y 20% de etanol para su reutilización.</li>
		<li>
Configurar las gotitas en el dispensador nanoliter. En primer lugar, unseal la placa de cristalización (uso el sostenedor de la placa). Entonces, lugar que tira de la placa y la proteína 8-bien en la primera posición del bloque del sostenedor de la tira. La ficha 'Configuración' en el software de control muestra las posiciones reales de cada componente en la cubierta. Carga cada uno de la tira con la muestra de proteína según el tamaño de la gota necesario (tabla 4). Ejecutar el programa para preparar gotas.
</li>
		<li>Al finalizar el programa, retire la placa de la cubierta y sellar inmediatamente (utilizar el sellador de placas, cinta adhesiva ancha de 3 pulgadas). Deseche la tira en el recipiente adecuado.</li>
		<li>Evaluar el tamaño, forma y centrado de las gotitas al microscopio antes de guardarla.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Añadido detección protocolo 2 (creación de gotitas de cristalización en una placa de 96 pocillos cristalización con una pantalla de aditiva reutilizable)
	<ol>
<li>En primer lugar, preparar la pantalla añadida: dejar la correspondiente placa de cultivo celular de 96 pozos congelados se descongele a temperatura ambiente durante 40 minutos. Luego, centrifugar la pantalla añadida a 1.000 x g durante 2 minutos.</li>
		<li>Preparar la condición (vol. min 15 mL al transferir la condición de un contenedor en la pantalla del aditivo con el controlador de líquido).</li>
		<li>Llenar los depósitos de una placa de 96 pocillos cristalización con la condición. En el controlador de líquido, proceder del mismo modo que el protocolo 1, paso 2.2.2, pero entrar en '80 μl' para el volumen en depósitos.</li>
		<li>Configurar las gotitas en el dispensador nanoliter con 3 componentes en la cubierta (la placa que contiene la pantalla añadida, junto con la placa de cristalización y la tira de proteína 8-bien en la primera posición del bloque del sostenedor de la tira, tabla 4).</li>
		<li>Sellar la placa de cultivo celular que contiene la pantalla con una hoja de aluminio y colóquelo en la incubadora de-20 ° C.</li>
		<li>Evaluar el tamaño, forma y centrado de las gotitas al microscopio antes de guardarla.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Por este medio manifestamos un interés comercial conflictivo desde LifeArc comercializa los siguientes elementos: placas 96 - y 48-pozo MRC, el sello MRC de la gota colgante, las pantallas de cristalización MORPHEUS, Pi, ANGSTROM y LMB.

1 - preparación y uso de pantallas iniciales en las placas
Kits de detección se debe mezclar antes de ser despachado en placas porque luz separación de fase o precipitación ocurre en algunos tubos durante el almacenamiento. Cuando una pantalla se compone de dos kits (tubos de 2 x 48), el primer tubo del segundo juego se coloca en E1 lugar del portador del enfriamiento. Cuando una pantalla se compone de 4 kits (4 x 24 tubos), el primer tubo del segundo juego se coloca en lugar C1, el primer tubo de la tercera equipación se coloca en la posición E1 y el primer tubo del cuarto juego se coloca en la ubicación G1. Al insertar los tubos en su portador de enfriamiento, las tapas se colocan en una bandeja siguiendo el diseño estándar de 96 pocillos de paisaje. Ya que los fabricantes indican números bien encima de las tapas, esto permite contrastar si todos los tubos han sido colocados en el orden correcto. Esto también ayuda a reemplazar las tapas correctas en los tubos cuando un número reducido de placas de relleno.
Almacenamos las placas similares previos a 10 ° C, un compromiso para evitar la congelación y almacenamiento a 4 ° C que pueden causar deterioro de las condiciones y problemas con el lacre. Las placas se almacenan durante varios meses normalmente sin notable condensación sobre la cara interior del sello. Esto es menos cierto para LMB05, LMB06, LMB09 y LMB10 placas como éstos contienen condiciones con concentraciones relativamente altas de reactivos volátiles (tabla 1). Pequeña cantidad de condensación en el lado interno de la Junta reduce la eficiencia de sellado y puede causar contaminación cruzada entre pozos al desprecintar las placas. Para ayudar con la prevención de la condensación durante el enfriamiento inicial, las placas pueden ser transferidas primero desde el carrusel en un picnic aislado refrigerador que se almacena en cuarto frío de 4 ° C durante la noche. El enfriamiento muy lento minimiza el desarrollo de gradientes de temperatura dentro de los pozos cerrados y por lo tanto, reduce la condensación total15. Además, una vez que las placas se almacenan en la incubadora de 10 ° C, una interno personalizada tapa poliestireno de SBS se coloca en la placa en la parte superior de cada pila (no mostrado).
El conjunto de nuestras placas de prellenado puede utilizarse como una gran pantalla inicial contra una muestra de proteína soluble en agua, novela. Como alternativa, menos placas pueden ser seleccionadas para que coincida con los requisitos específicos. Por ejemplo, LMB15 y LMB19 son pantallas especialmente formulados para la membrana proteína muestras26,27, o LMB20 es un formulado con átomos pesados para facilitar la eliminación experimental de datos de difracción28 (véase también : <a href="https://www.youtube.com/watch?v=Gpb4SypWnQY&t=11s">Formulación de las pantallas de cristalización de proteínas de Morfeo</a>).
2. creación de gotas de cristalización
Al usar el sistema 2, proyección kits con importantes cantidades de reactivos volátiles debe ser procesado primero. Esto evita la condensación en la goma de las tapas de la SBS, que afecten el manejo de tapa y sellado de la placa. Una tapa SBS tiene un poco de espacio libre cuando en la parte superior de una placa, que por eso necesitan alinearse inicialmente (ver Protocolo, paso 1.2.6). Los volúmenes muertos de proteína en los pocillos de la placa PCR son relativamente generoso (0,8 μl, ver leyenda del cuadro 2). Tenga en cuenta que igualmente generosos volúmenes muertos se emplean cuando se usa el dispensador nanoliter individualmente con la proteína en tiras de 8 pocillos (tabla 4). Menores volúmenes muertos puede funcionar, sin embargo algunas muestras se adhieren a las puntas, calibración de un robot puede llegar a ser un poco inexacto, la sala puede ser más caliente de lo habitual, etcetera. Llevar a pérdidas de la muestra cubiertas por los generosos volúmenes muertos para consolidar el enfoque.
Novedades más permitió la miniaturización de los experimentos y por lo tanto, el volumen de muestra requerido para la detección de las condiciones de cristalización puede reducirse significativamente mediante la integración de la correspondiente tecnología29,30 . Sin embargo, algunos aspectos de la mayor miniaturización necesitan una cuidadosa consideración, tales como la evaporación de gotitas31 y la manipulación de microcristales32.
Por último, centrifugación de la placa (2.000 rpm, 1 minuto) podría integrarse como paso final rutina al configurar gotitas de cristalización (en los pozos de superior esféricas). Un tamaño y forma de las gotas resultantes de centrifugación más consistente pueden reducir problemas de reproducibilidad33,34. Sin duda, gotas centradas facilitará la posterior evaluación de experimentos utilizando un microscopio como la longitud focal necesaria será similar en toda la placa.
3. ventajas del método 4-esquina
La ventaja más significativa del método 4-esquina es su simplicidad, que minimiza los errores y facilita sencillos protocolos automatizados. Por ejemplo, las soluciones de 4 esquina siempre se colocará en la cubierta de un líquido controlador siguiendo el mismo diseño. Además, todos los programas se basan en relaciones fijas entre las soluciones (figura 3). Preparación manual de las soluciones de 4 esquina se prefiere al manejo automatizado de soluciones en las altas concentraciones que pueden ser altamente viscosas. Entonces es posible en la mayoría de los tipos de controladores de líquido con requisitos mínimos para la optimización de las clases de líquido relativamente rápido y preciso de aspiración/dispensación. Sin embargo, algunas soluciones de esquina pueden todavía ser demasiado viscosos para un robot con un sistema de líquido para funcionar eficientemente. Por esta razón, optamos por un controlador líquido con desplazamiento positivo (figura 3B).
Además de los 2 lineales gradientes de concentraciones, un tercer componente (es decir, un conjunto de buffers/aditivos) puede analizarse en una concentración constante de una manera conveniente. Para esto, un volumen relativamente grande de un conjunto básico de soluciones de esquina en una concentración más alta convenientemente, excluyendo el componente a ser variada, se prepara en primer lugar. Luego, soluciones incluyendo este componente se añade para ajustar las concentraciones finales. Por ejemplo, se preparan 50 mL de un conjunto de soluciones de esquina 4 en concentraciones más altas de 10% que inicialmente. Este conjunto básico es entonces dividida en 5 subconjuntos más pequeños de 4. Por último, 10% en volumen de soluciones de diferentes pH de buffer se agrega a cada subconjunto.
4. formatos y tipos de pantallas de aditivos
Las pantallas normalmente se almacenan a-20 ° C (figura 4), puesto que no se utilizan regularmente y contienen compuestos volátiles/inestable. El uso de una pantalla aditivo congelado en un bloque de pozo profundo (1 mL en los pozos) debe planificarse temprano porque tarda 12-24 horas para todas las soluciones aditivas se descongele completamente a temperatura ambiente. También, una multitud de usuarios compartir la misma pantalla aditiva, puede provocar problemas con la contaminación cruzada. Finalmente, la altura de pozos profundos bloques hace inadecuado para la mayoría nanoliter dispensadores. Como una solución conveniente para eludir estos problemas, la pantalla debe ser transferida desde el bloque de pozo profundo a las placas de bajo perfil (figura 4).
Históricamente, aditivas pantallas que incluyen una amplia variedad de reactivos individuales (con concentraciones individuales) han sido muy populares35,36. Sin embargo, han desarrollado otros tipos de pantallas de aditivos que integran la mezcla de aditivos37 o un número reducido de aditivos individuales en diferentes concentraciones38. Por último, un enfoque complementario es investigar el efecto de aditivos sobre las muestras antes de la cristalización39,40.
5. más consideraciones
Buenas prácticas: Mayoría de las pantallas contiene sustancias dañinas o incluso tóxicas y por lo tanto debe emplearse protección personal adecuada durante los protocolos. Igualmente, las piezas de los robots móviles pueden conducir a lesiones, sobre todo cuando se trata de interferir manualmente mientras está ejecutando un programa (aunque la mayoría de los robots tienen sistema/botón de parada de emergencia). Debido a las complejidades técnicas involucradas, regulares control de robots, pantallas y programas con caracterizado previamente muestras de prueba son importantes para el sostenido alto nivel de reproducibilidad.
Rendimiento: Como indicación, entre 4.000 a 8.000 LMB placas se producen anualmente con el sistema 1 (y posteriormente empleado por los usuarios para la investigación inicial). No se adapta a la acción una gran cantidad de placas similares previos a 10 ° C cuando el volumen de ventas esperado es mucho menor, como después de 4-5 meses, algunas condiciones comenzará a deteriorarse y se evaporan. Se han implementado diferentes enfoques para protocolos de automatización para laboratorios de tamaño pequeño a mediano41.
Almacenamiento y evaluación de experimentos: Después de preparar las gotitas, las placas se almacenan en estantes de baja vibración en una habitación a 4 o 18 ° C con temperatura bien controlada (+-0.5 ° C de desviación máxima). Experimentos se evaluaron mediante microscopios de fuente de luz fría. ¿Diversos sistemas de proyección de imagen automatizados están comercialmente disponibles, sin embargo uno debe considerar cuidadosamente todos los aspectos: la velocidad necesaria para analizar un plato será suficiente para alto rendimiento? ¿Objetos que no sean cristales interferirá en enfoque automático? ¿Será suficiente con puntos muy pequeños cristales (especialmente alrededor del borde de las gotitas) la calidad resultante de las imágenes? 42 , 43 , 44
Comparación de las condiciones de cristalización: Después de cuidadosa investigación acerca de la naturaleza de los cristales obtenidos inicialmente, uno puede analizar tendencias y similitudes a través de condiciones utilizando la <a href="http://fms-3.lmb.internal/screens2/search.html">base de datos de pantalla LMB</a> o el C6 <a href="http://c6.csiro.au/">Herramienta Web</a>45.

Cristalografía de rayos x se aplica extensivamente para avanzar nuestra comprensión de los mecanismos biológicos y enfermedad a nivel atómico y posteriormente ayudar a enfoques racionales de drogas discovery1. Para ello, purificado y concentrado (2-50 mg/mL) muestras macromoleculares de proteínas, ADN, ARN, otros ligandos y sus complejos son probadas por su propensión a formar ordenó enrejados tridimensionales a través Cristalización2,3 ,4. Cuando cristales de alta calidad se obtienen que difractan los rayos x, la estructura cristalina puede resolverse en cerca de5,de resolución atómica6. Fundamentalmente, las condiciones para cristalizar una muestra novedosa no pueden ser predichas y la producción de cristales de alta calidad es generalmente muy baja. Una razón subyacente es que muchas muestras de interés tienen propiedades bioquímicas desafiantes, que los hacen inestables en el plazo correspondiente para la cristalización (por lo general unos pocos días). Finalmente, el proceso se complica por el tiempo necesario para producir las muestras y las variantes de la muestra y para optimizar su purificación y cristalización de7,8.
Una condición de la cristalización es una solución con un precipitado que reduce la solubilidad de la muestra y las condiciones a menudo también contienen los amortiguadores y los aditivos. Cientos de estos reactivos se adaptan bien para modificar los parámetros de los experimentos de cristalización ya que tienen baja propensión a interferir con la integridad de la muestra (como proteínas o ácidos nucleicos despliega). Mientras que prueba millones de combinaciones de reactivos de cristalización no es factible, prueba varios a muchos kits de detección - formulados con diferentes estrategias9,10 - es posible con ensayos miniaturizados y protocolos automatizados. En esta perspectiva, la técnica más favorable es probablemente la difusión de vapor con 100-200 gotas de nL sentado en un pozo pequeño encima de un depósito que contiene la condición de la cristalización (25-250 μL), implementada en cristalización especializada placas11 , 12. la proteína muestra y condición son a menudo combinados en una proporción de 1:1 para un volumen total de 200 nL al configurar las gotitas en los pozos de la parte superior. Cristalización de proteínas nanoliter robótica puede implementarse con técnicas alternativas y las placas de la fase cúbica lipídica14 (el último de ellos se aplica específicamente a las proteínas de membrana trans-que son como el debajo-aceite lote13 muy poco solubles en agua).
<a href="http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/groups/JYL/WWWrobots/robot.html">La facilidad de cristalización en el MRC-LMB</a> se inició en la década de 2000 y se presentó un resumen temprano de nuestros protocolos automatizados en 200515. Se presentó una introducción histórica a la cristalización de proteínas y también un resumen de las ventajas de la robótica nanoliter acercarse (entonces un nuevo enfoque a la experimentación de rutina). Desde cristalización macromolecular es esencialmente un proceso estocástico con muy poca o ninguna previa información, empleando una amplia variedad de condiciones iniciales (convenientes) aumentar el rendimiento de calidad difracción cristales16. Además, una ventaja a menudo pasado por alto de una gran pantalla inicial es reducir significativamente la necesidad de optimización de las muestras y los cristales en muchos casos. Por supuesto, uno puede todavía necesita continuar con la optimización de algunas condiciones iniciales más adelante. Normalmente, la concentración de los reactivos y el pH entonces se investigan sistemáticamente. Más reactivos también pueden introducirse en la condición optimizada para modificar más parámetros de cristalización. Por cierto, uno debería tratar de cristalización con una muestra recién preparada, por lo tanto los protocolos correspondientes deben ser sencilla y disponible cualquier momento.
Aquí, dos totalmente automatizado sistemas diseñados en el MRC-LMB (sistemas 1 y 2) y los correspondientes protocolos describen detalladamente. La principal aplicación de estos dos sistemas es inicial por difusión de vapor en gota cristalización placas se sentaba. Sistema 1 integra un controlador de líquido, un carrusel automático para chapa, una impresora de inyección de tinta para el etiquetado de la placa y un sellador de placa adhesiva. En el sistema 1, 72 placas de 96 pocillos llenadas con kits de detección disponibles comercialmente (80 μl de condición transferida al depósito de un volumen inicial de 10 mL en tubos de ensayo), etiquetadas y selladas. Las placas se almacenan entonces en una incubadora de 10 ° C donde están disponibles para los usuarios en cualquier momento (como pantallas iniciales llamadas 'Placas de LMB').
Sistema 2 integra un controlador de líquido, un dispensador de nanoliter y un sellador de placa adhesiva. En el sistema 2, sentado gotas (100-1.000 nL) para experimentos de difusión de vapor se producen mediante la combinación de condiciones y la muestra en los pocillos de superior de 20 placas de 48 o 96 pocillos previamente llena de condiciones. Esto significa 1.920 condiciones de proyección inicial exitosa cuando se utilizan 20 placas LMB en el sistema 2.
Robots también se utilizan individualmente para la optimización de las condiciones, y también se describen los protocolos semi-automatizados correspondientes. El método 4-esquina17 se emplea habitualmente para producir pantallas de optimización. El protocolo correspondiente requiere primero la preparación manual de 4 soluciones ('A, B, C y D'). Dos gradientes lineales de concentraciones (para dos agentes de la cristalización principal) entonces automáticamente se generan directamente en los depósitos de una placa de cristalización. Para esto, un manejador de líquido basado en jeringa distribuye las soluciones de 4 esquina en diferentes proporciones.
Para optimizar aún más la condición, uno puede emplear pantallas aditivos potencialmente mejorar las propiedades de los cristales resultantes18. Existen dos enfoques para tamizaje aditivo: un protocolo a partir de aditivos que distribuye en los depósitos de placas de cristalización antes de configurar las gotitas (protocolo 1) y otro protocolo donde se distribuye la pantalla añadida directamente a las gotitas (protocolo 2).
Otros desarrollos útiles que se iniciaron en el MRC-LMB para facilitar la cristalización macromolecular automatizado, también se presentan. Esencialmente, cristalización placas y dispositivos asociados como un apilable sociedad de Biomolecular de detección (SBS) tapa reduce al mínimo la evaporación de las condiciones al usar el sistema 2.
Por brevedad, se supone que los usuarios están familiarizados con las funciones básicas y mantenimiento de dispensador nanoliter, la impresora de inyección de tinta y el sellador de placa adhesiva. A menos que se indique lo contrario, se colocan las placas en la cubierta de los robots que el pocillo A1 ('A1-esquina') es la esquina trasera izquierda de un portador de la placa.

<table><tbody><tr><td>Robots</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freedom EVO&reg;</td><td>Tecan</td><td>n/a</td><td>Manipulador de líquidos (Sistema 1). Aspiración/Dispensación en función del líquido del sistema. Integra un carrusel automatizado. Software de control EVOware plus v.2.4.12.0.&nbsp;</td></tr><tr><td>Microlab&reg; STAR&trade;</td><td>Hamilton</td><td>n/a</td><td>Manipulador de líquidos (Sistema 2). Aspiración/Dispensación basada en desplazamiento positivo (tecnología CO-RE&trade;). Software de control Hamilton STAR v.4.3.5.4785 con interfaz de gestión de métodos.</td></tr><tr><td>Mosquito&reg;</td><td>TTP Labtech</td><td>n/a</td><td>Dispensador de nanolitros a base de microjeringa utilizado para configurar gotas (Sistema 2 e independiente), cubierta de 3 posiciones. Software de control v.3.11.0.1422.&nbsp;</td></tr><tr><td>Libélula&reg;</td><td>TTP Labtech</td><td>n/a</td><td>Manipulador de líquidos a base de jeringa utilizado para producir cribas de optimización (método de 4 esquinas). Software de control v.1.2.1.10196.&nbsp;</td></tr><tr><td>Selladora de placas adhesivas</td><td>Brandel</td><td>n/a</td><td>Integrada en los Sistemas 1 y 2 (también utilizada como robot autónomo).</td></tr><tr><td>Impresora de inyección de tinta 9232</td><td>Markem-Imaje</td><td>n/a</td><td>Integrada en el Sistema 1. Interfaz de pantalla táctil.</td></tr><tr><td><pantallas > cristalización fuerte</pantalla ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>cristal fuerte&trade; 1</td> kit de cristalización <td>Hampton Research</td><td>HR2-110</td><td>(tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB01</td></tr><tr><td>Crystal Screen 2&trade;</td>Kit de cristalización <td>Hampton Research</td><td>HR2-112</td><td>(tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB01</td></tr><tr><td>Wizard&trade; Classic 1</td><td>Rigaku</td><td>1009530</td><td>Kit de cristalización (tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB02</td></tr><tr><td>Wizard&trade; Kit de cristalización Classic 2</td><td>Rigaku</td><td>1009531</td><td>(tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB02</td></tr><tr><td>Grid Screen&trade; Sulfato de amonio</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-211 Kit de</td><td>cristalización (tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB03</td></tr><tr><td>Grid Screen&trade; PEG/LiCl</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-217</td><td>Kit de cristalización (tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB03</td></tr><tr><td>Quick Screen&trade;</td>Kit de cristalización <td>Hampton Research</td><td>HR2-221</td><td>(tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB03</td></tr><tr><td>Grid Screen&trade; Cloruro de sodio</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-219</td><td>Kit de cristalización (tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB03</td></tr><tr><td>Grid Screen&trade; PEG 6000</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-213</td><td>Kit de cristalización (tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB04</td></tr><tr><td>Grid Screen&trade; MPD</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-215</td><td>Kit de cristalización (tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB04</td></tr><tr><td>MemFac&trade;</td>Kit de cristalización <td>Hampton Research</td><td>HR2-114</td><td>(tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB04</td></tr><tr><td>PEG/Ion&trade;</td>Kit de cristalización <td>Hampton Research</td><td>HR2-126</td><td>(tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB05</td></tr><tr><td>Natrix&trade;</td>Kit de cristalización <td>Hampton Research</td><td>HR2-116</td><td>(tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB05</td></tr><tr><td>Crystal Screen Lite&trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-128</td><td>Kit de cristalización (tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en la pantalla LMB06</td></tr><tr><td>Custom Lite</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>n/a</td><td>Kit de cristalización (tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB06</td></tr><tr><td>Wizard&trade; Cryo 1</td><td>Rigaku</td><td>1009536</td><td>Kit de cristalización (tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB07</td></tr><tr><td>Wizard&trade; Cryo 2</td><td>Rigaku</td><td>1009537</td><td>Kit de cristalización (tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB07</td></tr><tr><td>JBS1</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-101L</td><td>Kit de cristalización (tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB08</td></tr><tr><td>JBS2</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-102L Kit de</td><td>cristalización (tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB08</td></tr><tr><td>JBS3</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-103L</td><td>Kit de cristalización (tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB08</td></tr><tr><td>JBS4</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-104L Kit de</td><td>cristalización (tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB08</td></tr><tr><td>JBS5</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-105L</td><td>Kit de cristalización (tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB09</td></tr><tr><td>JBS6</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-106L Kit de</td><td>cristalización (tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB09</td></tr><tr><td>JBS7</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-107L Kit de</td><td>cristalización (tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB09</td></tr><tr><td>JBS8</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-108L Kit de</td><td>cristalización (tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB09</td></tr><tr><td>JBS9</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-109L Kit de</td><td>cristalización (tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB10</td></tr><tr><td>JBS10</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-110L</td><td>Kit de cristalización (tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Pantalla 1 pH 4.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB Kit de</td><td>cristalización (tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Pantalla 1 pH 5.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB Kit de</td><td>cristalización (tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Pantalla 1 pH 6.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB Kit de</td><td>cristalización (tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Pantalla 1 pH 7.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB Kit de</td><td>cristalización (tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Pantalla 1 pH 8.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB Kit de</td><td>cristalización (tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Pantalla 2 pH 4.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB Kit de</td><td>cristalización (tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Pantalla 2 pH 5.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB Kit de</td><td>cristalización (tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB12</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Pantalla 2 pH 6.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB Kit de</td><td>cristalización (tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB12</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Pantalla 2 pH 7.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB Kit de</td><td>cristalización (tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB12</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Pantalla 2 pH 8.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB Kit de</td><td>cristalización (tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB12</td></tr><tr><td>Index&trade;</td>Kit de cristalización <td>HR2-144</td> de <td>Hampton Research</td><td>(tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB13</td></tr><tr><td>SaltRX&trade; 1</td> kit de cristalización <td>Hampton Research</td><td>HR2-107</td><td>(tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB14</td></tr><tr><td>SaltRX&trade; 2</td> kit de cristalización <td>Hampton Research</td><td>HR2-109</td><td>(tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB14</td></tr><tr><td>MemStar&trade;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-21</td><td>Kit de cristalización (tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB15</td></tr><tr><td>MemSys&trade;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-25 Kit de</td><td>cristalización (tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB15</td></tr><tr><td>JCSG-plus&trade; Suite</td><td>Qiagen</td><td>130720</td><td>Kit de cristalización (tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en la pantalla LMB16</td></tr><tr><td>MORPHEUS&reg;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-46 Kit de</td><td>cristalización (tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en la pantalla mínima LMB17</td></tr><tr><td>Pi</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-127 Kit de</td><td>cristalización (tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en la pantalla LMB18</td></tr><tr><td>Pi-PEG</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-128 Kit de</td><td>cristalización (tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB19</td></tr><tr><td>MORPHEUS&reg; II pantalla</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-91 Kit de</td><td>cristalización (tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en LMB20</td></tr><tr><td>LMB pantalla y comercio;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-98 Kit de</td><td>cristalización (tubos de ensayo, 10 ml por condición) utilizado en las</td></tr> <tr><td>cribas de aditivos</td> LMB21<< / > <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-138</td><td>congeladas en un bloque >de pozos profundos de 96 pocillos (1 mL por pocillo).</td></tr><tr><td>Criba de aditivos MORPHEUS&reg;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-93-500</td><td>Congelado en bloque de 96 pocillos profundos (500 y micro; L por pozo).</td></tr><tr><td>Criba de aditivos ANGSTROM; &nbsp;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-100</td><td>Congelado en un bloque de 96 pocillos (1 mL por pocillo).</td></tr><tr><td>criba de aditivos MORPHEUS&reg;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-93</td><td>Congelado en cultivo celular de 96 pocillos Placa Costar&reg; con pocillos en forma de V (100 &micro; L por pozo).</td></tr><tr><td>Criba de aditivos ANGSTROM; &nbsp;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-100-FX</td><td>Congelado en cultivo celular de 96 pocillos Costar&reg; placa con pocillo en forma de V (100 &micro; L por pozo).</td></tr><tr><td>Criba de aditivos HIPPOCRATES</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>n/a</td><td>48 aditivos individuales (compuestos farmacéuticos encontrados en MORPHEUS&reg; III).</td></tr><tr><td><fuerte>Otros consumibles</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 pocillos Placa de 2 caídas</td><td>MRC Swissci</td><td>MRC 96T-UVP</td><td>Placa de difusión de vapor. Volumen recomendado del depósito: 80&nbsp; &micro;L. Rango de volúmenes útiles de gota: 10-1000 nL. Transmisible a los rayos UV.</td></tr><tr><td>Placa de 1 gota MRC de 48 pocillos&nbsp; ('Placa MAXI')</td><td>Swissci</td><td>MMX01-UVP&nbsp;</td><td>Placa de difusión de vapor sentada para escalado/optimización. Volumen recomendado del depósito: 200 &nbsp; &micro;L. Rango de volúmenes útiles de gota: 0,1-10 &micro;L. Transmisible a los rayos UV.</td></tr><tr><td>Junta de caída colgante MRC</td><td>Swissci</td><td>n/a</td><td>Colgante, compatible con las dos placas de difusión de vapor MRC (MRC 96T-UVP y MMX01-UVP ). Transmisible por rayos UV y X.</td></tr><tr><td>Cinta adhesiva de sellado</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-50</td><td>de 3 pulgadas de ancho Duck&reg; HD Clear&trade; para sellador y sellado manual.</td></tr><tr><td>Chapa adhesiva de aluminio</td><td>Beckman Coulter</td><td>538619</td><td>Se utiliza para volver a sellar pantallas de aditivos.</td></tr><tr><td>Cartucho de tinta</td><td>Markem-Imaje</td><td>9651</td><td>System 1 (impresora de inyección de tinta).</td></tr><tr><td>Cartucho</td><td>solvente Markem-Imaje</td><td>8652</td><td>System 1 (impresora de inyección de tinta).</td></tr><tr><td>50 y micro; L consejos&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>235947</td><td>System 2 (STAR&trade; manipulador de líquidos). Caja de 6 juegos con 1920 x CO-RE&trade; Puntas en pilas desechables.</td></tr><tr><td>Recipiente de reactivo</td><td>Hamilton</td><td>194052</td><td>Se utiliza para dispensar una condición en la(s) placa(s) durante los protocolos de detección de aditivos.&nbsp;</td></tr><tr><td>placa de PCR</td><td>Thermo Scientific&trade;</td><td>AB-2150</td><td>Sistema 2 (contiene proteína para ser transferida al Mosquito&reg;). Abgene Diamond ultra, 384 pozos en forma de V.</td></tr><tr><td>microjeringas</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03020</td><td>Bobina de 26.000 microjeringas para el dispensador de nanolitros Mosquito&reg; (espaciado de 9 mm).</td></tr><tr><td>bloque de soporte de tiras</td><td>TTP Labtech</td><td>3019-05013</td><td>Dispositivo SSB para las tiras Mosquito&reg;, también conocido como 'Soporte de reactivo de 4 vías'.</td></tr><tr><td>2 y micro; L Tira de 8 pocillos</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03110</td><td>Contiene proteína en la cubierta del Mosquito&reg;. Caja de 40 tiras, máx. vol. en el pozo es de 3.2 &micro;L.</td></tr><tr><td>5 y micro; L Tira de 8 pocillos</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03100</td><td>Contiene proteína en la cubierta del Mosquito&reg;. Caja de 40 tiras, el vol. máx. en el pozo es de 7.5 &micro;L.</td></tr><tr><td>Jeringas de 5 mL</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-07100</td><td>Cuerpo de jeringa y pistón para el manipulador de líquidos Dragonfly&reg;. Paquete de 100.</td></tr><tr><td>Comederos/Depósitos</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-07103</td><td>Contiene soluciones madre en la cubierta del Dragonfly&reg;. Paquete de 50.</td></tr><tr><td>Agitador orbital de microplacas</td><td>CamLab Limited</td><td>n/a</td><td>Variomag&reg; para condiciones de mezcla en una sola placa (0-2000 rpm).</td></tr><tr><td>Mezclador de microplacas</td><td>TTP Labtech</td><td>3121-01015</td><td>MxOne. Condición de mezcla en una sola placa con 96 pines vibratorios.</td></tr></tbody></table>

automatizado de protocolos de cristalización macromolecular en el laboratorio mrc de biología molecular

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

Cuando cristales de alta calidad se obtienen que difractan los rayos x, la estructura cristalina puede ser resuelto en cerca de resolución atómica. Las condiciones para cristalizar proteínas, ADN, ARN y sus complejos sin embargo no pueden ser predicho. Empleando una amplia variedad de condiciones es una forma de aumentar la producción de cristales de difracción la calidad. Dos sistemas totalmente automatizados se han desarrollado en el MRC laboratorio de Biología Molecular (Cambridge, Inglaterra, MRC-LMB) que facilitan la proyección de cristalización contra 1.920 condiciones iniciales por la difusión del vapor en gotas nanoliter. Protocolos semi-automatizados también se han desarrollado para optimizar las condiciones cambiando las concentraciones de los reactivos, el pH, o mediante la introducción de aditivos potencialmente mejorar propiedades de los cristales resultantes. Todos los protocolos correspondientes se describen en detalle y discute brevemente. Tomados en conjunto, permiten la cristalización macromolecular conveniente y altamente eficiente en una instalación de multiusuario, mientras que a los usuarios control sobre parámetros clave de sus experimentos.

Sistemas automatizados y protocolos para la preparación rutinaria de un gran número de pantallas y nanoliter gotitas de cristalización para los experimentos de difusión de vapor se describen y discuten.

Automatizado de protocolos de cristalización Macromolecular en el laboratorio MRC de Biología Molecular

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

El objetivo general de este procedimiento es producir cristales de alta calidad a partir de condiciones iniciales de cribado de cristalización. Los cristales pueden utilizarse para estudiar las estructuras de proteínas, ADN, ARN y sus complejos. Algo sobre las estructuras macromoleculares se ha vuelto cada vez más desafiante.Y proporcionar una amplia variedad de condiciones iniciales aumenta el rendimiento de cristales útiles, al tiempo que reduce la necesidad de optimización de la muestra y de los cristales. Los dos sistemas completamente automatizados, el LMB, facilitan la preparación de hasta 1.920 experimentos de difusión de vapor en gotas de nanolitros. Por brevedad, se asume que los usuarios ya están familiarizados con las funciones básicas y el mantenimiento del dispensador de nanolitros, la impresora de inyección de tinta y el sellador adhesivo de placas.Antes de realizar el procedimiento, asegúrese de que los robots del sistema estén inicializados y de que el software de control esté abierto. Encienda el refrigerador del portador de enfriamiento de tubos aproximadamente 30 minutos antes de que comience el programa principal. Coloque una placa de prueba en el portador SBS motorizado del sellador de placas.Coloque en funcionamiento el sellador de placas y verifique que la película esté correctamente aplicada. Repita esta prueba dos veces más para confirmar que el sellador de placas esté listo. A continuación, agregue 20 litros de agua desionizada al recipiente principal del dispensador de líquidos.Desconecte los insertos de acoplamiento del recipiente más pequeño con solución de enjuague de etanol al 20 % y conecte los insertos al recipiente principal. Ingrese el nombre de pantalla adecuado en la pantalla táctil de la impresora de inyección de tinta. Luego, abra y cierre la puerta del carrusel para activar la rotación del mismo.Abra la puerta cuando aparezca la primera pila. Cargue completamente la primera pila con 22 placas de cristalización, cada una con la columna uno orientada hacia afuera. Cargue completamente las siguientes dos pilas de la misma manera.Cargue las seis placas restantes en las posiciones superiores de la cuarta pila y luego cierre la puerta del carrusel. Verifique que la pantalla del refrigerador indique 14 grados Celsius. Invierta suavemente y repetidamente los kits de tamizaje seleccionados durante un minuto.Luego, abra el panel frontal del dispensador de líquidos. Abra los tubos y colóquelos en el portador de enfriamiento siguiendo el diseño estándar de 96 pocillos. Al colocar cada tubo en el portador, coloque su tapa en la bandeja siguiendo el mismo diseño de 96 pocillos.Al utilizar el Sistema 1, las etiquetas de los cables se colocan en la bandeja con el diseño de 96 pocillos para permitir verificar que los tubos estén dispuestos correctamente. Verifique las posiciones de los tubos y asegúrese de que todos los tubos estén nivelados y bien asentados en el portador. Luego cierre el panel frontal.En la ventana de inicio del software del manipulador líquido, seleccione Ejecutar mantenimiento y abra el programa de lavado. Ejecute el programa para eliminar el etanol al 20 % del sistema y lavar los exteriores de las puntas dispensadoras de líquido. Cuando el lavado esté completo, haga clic en Cancelar para regresar a la pantalla de inicio.Seleccione Ejecutar un proceso existente y haga clic en Comience su selección. Abra el programa de dispensación del kit MRC. Complete con 18" para Instancias en la pantalla de configuración y ejecute el programa. Supervise el sistema mientras las primeras cuatro placas son etiquetadas, llenadas y selladas.No deje el sistema sin vigilancia hasta que se complete la preparación de las primeras cuatro placas. Una vez que se hayan preparado las 72 placas y colocado nuevamente en el carrusel, cambie los insertos de acoplamiento del recipiente de agua desionizada al recipiente de etanol al 20%. Ejecute el programa de lavado de arranque utilizando el mismo procedimiento que antes.Apague el refrigerador y deseche los tubos vacíos del kit de tamizaje. Retire cuidadosamente las 72 placas preparadas del carrusel. Deseche las placas llenadas incorrectamente o mal selladas.Almacene las placas listas para usar a 10 grados Celsius. Primero asegúrese de que los robots del sistema estén encendidos, que el dispensador de nanolitros esté inicializado con su software abierto y que el administrador de métodos del manipulador de líquidos esté abierto. Encienda el portador de enfriamiento para microtubos aproximadamente 15 minutos antes de que comience el programa principal.Coloque una placa de prueba en el portaplacas SBS motorizado del sellador de placas. Ejecute el sellador de placas y verifique que la placa esté correctamente sellada. Pruebe el sellador de placas tres veces.Luego, ejecute el dispensador de nanolitros para colocar gotas de 100 nanolitros de la solución de prueba en una placa de ensayo. Aquí se muestra una micrografía de luz de una gota de 100 nanolitros, producida por el dispensador de nanolitros, con la solución de prueba preparada con colorante rojo. Cierre el software del dispensador de nanolitros y retire el bloque portador de tiras del deck.A continuación, coloque en un soporte de placas diseñado a medida una placa de cristalización de 96 pocillos precargada que contenga la mayor cantidad relativa de reactivos volátiles en sus condiciones. Retire la película adhesiva de la placa. Abra el panel frontal del dispensador automático de líquidos y coloque la placa sin sellar sobre la plataforma en la parte trasera del primer portador deslizante.Cubra la placa con una tapa de aluminio SBS. Acomode la tapa hacia la esquina trasera izquierda del portador aplicando una presión suave en la esquina opuesta de la tapa. Al utilizar el Sistema 2, los kits de cribado que contengan cantidades significativas de reactivos volátiles deben procesarse primero.Esto evita la formación de condensación en las puntas SBS, lo que podría afectar la manipulación automatizada de las puntas o el sellado de las placas. Retire el sello, cargue las placas restantes en los portadores deslizantes y cúbralas de la misma manera, trabajando desde las condiciones más hasta las menos volátiles. Una vez que el portador de enfriamiento para microtubos alcance 4 grados Celsius, indicado por una luz verde, retire su tapa.Corte la tapa de un microtubo que contenga al menos 440 microlitros de una muestra de proteína. Asegúrese de que la muestra no tenga espuma sobre el menisco, ya que esto interferirá con el sistema de detección de líquido. Coloque el tubo en la Posición 1 del portador de enfriamiento para microtubos.Coloque una placa de PCR en la plataforma del manipulador líquido frente al portador del adaptador para movimiento de placas. Luego cierre el panel frontal. En la interfaz de gestión de métodos del manipulador líquido, seleccione Configurar placas.Supervise la inicialización de ambos sistemas y complete los parámetros de ejecución, incluyendo el tipo de placa y el número de gotas para cada condición, el tamaño de la gota, la posición de la primera placa que se procesará y el número de placas. Haga clic en No cuando se le pregunte si desea ayuda para cargar la plataforma. Una vez que haya verificado que no hay bastoncillos vacíos, haga clic en Aceptar. Una vez que haya comprobado que hay bastoncillos suficientes para la ejecución, haga clic en Aceptar. Cuando sea necesario, actualice el sistema de manejo de puntas y haga clic en Aceptar. Asegúrese de que la plataforma del dispensador de nanolitros esté libre del bloque portador de tiras y de que el portador esté en la parte trasera de las pilas de puntas de 50 microlitros, las cuales deben estar libres de las tapas de aluminio SBS.Vuelva a verificar que todos los demás componentes necesarios estén listos y luego inicie el proceso. Supervise el sistema mientras el dispensador de nanolitros coloca las gotas en la primera placa y el sellador de placas posteriormente sella la placa. No deje el sistema sin supervisión hasta que se complete la preparación de la primera placa.Una vez que las 20 placas hayan sido preparadas con gotas de cristalización y regresen automáticamente a los portadores deslizantes, abra el panel frontal y retire suavemente las placas. Verifique que las placas estén selladas correctamente antes de almacenarlas para la cristalización. Limpie las tapas SBS con la solución de etanol al 20 % antes de apilarlas en el lado izquierdo del manipulador de líquidos para su almacenamiento.Deseche la placa de PCR y el microtubo. Apague el portador de enfriamiento para microtubos y elimine la condensación. Coloque una toalla de papel sobre la superficie fría para absorber cualquier condensación adicional.Luego, reemplace la tapa del portador y cierre el panel frontal. OmpF y MreB se seleccionaron inicialmente utilizando estos protocolos completamente automatizados. Se encontraron cristales de OmpF de calidad suficiente para difracción de rayos X en el pocillo A4 de la placa LMB 7.Se encontraron cristales de calidad para difracción de MreB en el pocillo D12 de la placa LMB 20. Almacenar las placas pre-incubadas a 10 grados Celsius es un compromiso para evitar la congelación y el almacenamiento a 4 grados, lo cual podría provocar el deterioro de las condiciones de cristalización y problemas relacionados con la condensación. Cuando se almacenan de esta manera, las placas pueden utilizarse dentro de los cuatro a cinco meses siguientes.Entre 4 000 y 8 000 placas LMB se producen anualmente con el Sistema 1 y posteriormente se utilizan para el cribado inicial. Los protocolos deben optimizarse de forma diferente cuando el rendimiento esperado es mucho más bajo. Normalmente, todo nuestro conjunto de placas precombustible se utiliza como una pantalla inicial amplia para una muestra novedosa.Sin embargo, se pueden seleccionar menos placas según requisitos de muestra más específicos. Después de preparar las gotas, las placas se almacenan en estantes de baja vibración con la temperatura controlada rigurosamente a 4 o 18 grados Celsius. Los experimentos se evalúan con microscopios de fuente de luz de desplazamiento.Después de investigar cuidadosamente la naturaleza de los cristales, se pueden analizar rasgos y similitudes entre condiciones utilizando herramientas basadas en la web, como las bases de datos LMB o C6 Screen. Puede ser aún necesario un posterior ajuste de las condiciones de cristalización. Otros protocolos automatizados, con los métodos de cuatro esquinas y el cribado de aditivos, se describen en nuestro manuscrito.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

La estructura 3-D de una molécula proporciona un conocimiento único de cómo funciona la molécula. El principal método para la determinación de la estructura en casi atómica resolución cristalografía de rayos X. En este sentido, demostrar los métodos actuales de obtención de cristales tridimensionales de cualquier macromolécula, dado que son adecuados para la determinación de la estructura por cristalografía de rayos X.

De cristalización de proteínas para la cristalografía de rayos X

Aquí se describe un enfoque robótico a alto rendimiento de cristalización de proteínas de membrana en mesofases lipídicos para su uso en la determinación de estructura macromolecular usando cristalografía de rayos X. Tres robots capaces de manejar la viscosa y pegajosa proteína cargada de mesofase integral con el método se introducen.

El uso de un robot para la cristalización de alto rendimiento de proteínas de membrana en mesofases lipídicas

Aquí se describe un método general para la detección de la matriz microseed al azar. Esta técnica se muestra para aumentar de manera significativa la tasa de éxito de la proteína experimentos de cribado de cristalización, reducir la necesidad de optimización, y proporcionar un suministro fiable de cristales para la recopilación de datos y experimentos ligando-spa.

La mejora de la tasa de éxito de cristalización de proteínas por Random Matrix Microseed Screening

Aquí, se describe cómo utilizar la selección automática y opciones de recopilación de datos disponibles en algunos beamlines del sincrotrón. Los científicos enviaran muestras de cryocooled el sincrotrón, las propiedades de difracción son evaluadas, los conjuntos de datos son recogidos y procesados y, cuando sea posible, una solución de la estructura se lleva a cabo, todo ello sin intervención humana.

Caracterización totalmente autónoma y colección de datos de cristales de macromoléculas biológicas

Se presenta un nuevo portamuestras para cristalografía de rayos X macromolecular junto con un protocolo de manipulación adecuado. El sistema permite el crecimiento de cristales, el remojo de cristales y la recopilación de datos de difracción in situ a temperatura ambiente y criogénica sin necesidad de manipulación o montaje de cristales.

Un soporte de muestra todo en uno para cristalografía de rayos X macromolecular con dispersión mínima de fondo

Los estudios estructurales de biomacromolecules por cristalografía requieren cristales de alta calidad. Aquí demostramos un protocolo que puede ser utilizado por OptiCrys (un instrumento totalmente automatizado desarrollado en nuestro laboratorio) y / o botones de microdiálisis para el crecimiento de grandes cristales de alta calidad basados en el conocimiento del diagrama de fase de cristalización.

Optimización del crecimiento del cristal para la cristalografía macromolecular de neutrones

La relación señal-ruido de los datos es una de las consideraciones más importantes para realizar mediciones de difracción de rayos X a partir de microcristales. La línea de haz VMXm proporciona un entorno de bajo ruido y microhaces para tales experimentos. Aquí, describimos los métodos de preparación de muestras para montar y enfriar microcristales para VMXm y otras líneas de haz de cristalografía macromolecular de microenfoque.

Una tubería de preparación de muestras para microcristales en vmXm Beamline

Aquí, describimos cómo utilizar las tuberías automatizadas de cristalografía macromolecular para el análisis rápido de complejos de ligando-proteína y proteína de proteína a proteína y el cribado de fragmentos a gran escala basado en la tecnología CrystalDirect en el Laboratorio HTX en EMBL Grenoble.

Las tuberías de cristalografía automatizadas en las instalaciones de EMBL HTX en Grenoble

Este protocolo detalla el cribado de cristalización de alto rendimiento, que va desde la preparación de la placa de microensayo de 1.536 hasta el final de una ventana de tiempo experimental de 6 semanas. Se incluyen detalles sobre la configuración de la muestra, las imágenes obtenidas y cómo los usuarios pueden realizar análisis utilizando una interfaz gráfica de usuario habilitada para inteligencia artificial para identificar rápida y eficientemente las condiciones de cristalización...

Cribado de alto rendimiento para obtener golpes de cristal para cristalografía de proteínas

Presentamos un protocolo para la cristalización de proteínas utilizando la instalación de cristalización en el Complejo de Investigación en Harwell y la posterior recopilación de datos cristalográficos de rayos X in situ de cristales dentro de las placas en la línea de luz de Cristalografía Macromolecular Versátil in situ (VMXi) de Diamond. Describimos los requisitos de la muestra, los protocolos de cristalización y las pautas de recopilación de datos.

Cristalización y recopilación de datos a temperatura ambiente in situ utilizando la instalación de cristalización en Harwell y Beamline VMXi, fuente de luz de diamante

Aprende a automatizar protocolos de cristalización de macromoléculas mediante difusión de vapor con gotas nanométricas. Este método permite preparar hasta 1.920 experimentos para obtener cristales de alta calidad en estudios de biología estructural.

Automatizado de protocolos de cristalización Macromolecular en el laboratorio MRC de Biología Molecular

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