Automatizado de protocolos de cristalización Macromolecular en el laboratorio MRC de Biología Molecular

El objetivo general de este procedimiento es producir cristales de alta calidad a partir de las condiciones iniciales de cribado de cristalización. Los cristales se pueden utilizar para estudiar las estructuras de las proteínas, el ADN, el ARN y sus complejos. Hay algo en las estructuras macromoleculares que se ha vuelto cada vez más desafiante.

Y proporcionar una amplia variedad de condiciones iniciales aumenta el rendimiento de cristales útiles, al tiempo que reduce la necesidad de optimización de muestras y cristales. Los dos sistemas totalmente automatizados, el LMB, facilitan la preparación de hasta 1.920 experimentos de difusión de vapor en gotas de nanolitros. En aras de la brevedad, se supone que los usuarios ya están familiarizados con las funciones básicas y el mantenimiento del dispensador de nanolitros, la impresora de inyección de tinta y el sellador de placas adhesivas.

Antes de realizar el procedimiento, asegúrese de que los robots del sistema estén inicializados y que su software de control esté abierto. Encienda el enfriador del portador de enfriamiento del tubo, aproximadamente 30 minutos antes de que se inicie el programa principal. Coloque una placa de prueba en el soporte SBS motorizado del sellador de placas.

Encienda el sellador de placas y verifique que la película esté aplicada correctamente. Repita esta prueba dos veces más para verificar que el sellador de placas esté listo. Luego agregue 20 litros de agua desionizada al recipiente principal del manipulador de líquidos.

Desconecte los insertos de acoplamiento del recipiente más pequeño de solución de enjuague con etanol al 20% y conecte los insertos al recipiente principal. Introduzca el nombre de pantalla adecuado en la pantalla táctil de la impresora de inyección de tinta. A continuación, abra y cierre la puerta del carrusel para activar la rotación del carrusel.

Abra la puerta cuando se presente la primera pila. Cargue completamente la primera pila con 22 placas de cristalización, cada una con una columna hacia afuera. Cargue completamente las siguientes dos pilas de la misma manera.

Cargue las seis placas restantes en las posiciones más altas de la cuarta pila, luego cierre la puerta del carrusel. Verifique que la pantalla del enfriador indique 14 grados centígrados. Invierta suave y repetidamente los kits de cribado seleccionados durante un minuto.

A continuación, abra el panel frontal del manipulador de líquidos. Abra los tubos y colóquelos en el portador de enfriamiento en el diseño estándar de 96 pocillos. Al colocar cada tubo en el portador, coloque su tapa en la bandeja en el mismo diseño de 96 pocillos.

Cuando se utiliza el Sistema 1, los cables de la etiqueta se colocan en la bandeja en el diseño de 96 pocillos para permitir la verificación cruzada de que los tubos estén dispuestos correctamente. Verifique las posiciones de los tubos y luego asegúrese de que todos los tubos estén nivelados y asentados en el portador. A continuación, cierre el panel frontal.

En la ventana de inicio del software del manipulador de líquidos, seleccione Ejecutar mantenimiento y abra el programa de lavado. Ejecute el programa para eliminar el etanol al 20% del sistema y lavar el exterior de las puntas dispensadoras de líquido. Una vez finalizado el vaciado, haga clic en Cancelar para volver al inicio.

Seleccione Ejecutar un proceso existente y haga clic en Iniciar la selección. Abra el programa de dispensación del kit MRC. Rellene 18" para Instancias en la pantalla de Configuración y ejecute el programa, Supervise el sistema a medida que las primeras cuatro placas están etiquetadas, llenas y selladas.

No deje el sistema desatendido hasta que se complete la preparación de las primeras cuatro placas. Una vez que las 72 placas se hayan preparado y vuelto a colocar en el carrusel, cambie los insertos de acoplamiento del recipiente de agua desionizada al contenedor de etanol al 20%. Ejecute el programa de vaciado de inicio utilizando el mismo proceso que antes.

Apague el enfriador y deseche los tubos vacíos del kit de cribado. Retire con cuidado los 72 platos preparados del carrusel. Deseche los platos mal llenados o mal sellados.

Guarde las placas listas para usar a 10 grados centígrados. En primer lugar, asegúrese de que los robots del sistema estén encendidos, que el dispensador de nanolitros esté inicializado con su software abierto y que el administrador de métodos del manipulador de líquidos esté abierto. Encienda el portador de enfriamiento de microtubos unos 15 minutos antes de que se inicie el programa principal.

Coloque una placa de prueba en el soporte SBS motorizado del sellador de placas. Haga funcionar el sellador de placas y verifique que la placa esté sellada correctamente. Pruebe el sellador de placas tres veces.

A continuación, haga funcionar el dispensador de nanolitros para colocar 100 gotas de nanolitros de solución de prueba en una placa de prueba. Aquí se muestra una micrografía de luz de una gota de 100 nanolitros, producida por el dispensador de nanolitros, con la solución de prueba hecha con tinte rojo. Cierre el software del dispensador de nanolitros y retire el bloque de soporte de tiras de la plataforma.

A continuación, coloque en un soporte de placas diseñado a medida, una placa de cristalización precargada de 96 pocillos con la mayor cantidad relativa de reactivos volátiles en sus condiciones. Retire la película adhesiva de la placa. Abra el panel frontal del manipulador de líquidos y coloque la placa sin sellar en la plataforma en la parte posterior del primer portador deslizante.

Cubra el plato con una tapa de aluminio SBS. Coloque la tapa hacia la esquina trasera izquierda del transportador aplicando una presión suave en la esquina opuesta de la tapa. Cuando se utiliza el Sistema 2, primero se deben procesar los kits de cribado con cantidades significativas de reactivos volátiles.

Esto evita la formación de condensación en los cables SBS, lo que podría afectar la manipulación automatizada de los cables o el sellado de la placa. Abra el sello, cargue en los soportes deslizantes y cubra las 19 placas restantes de la misma manera, trabajando de mayor a menor volatilidad. Una vez que el portador de enfriamiento del microtubo esté a 4 grados centígrados, como lo indica una luz verde, retire su tapa.

Corta la tapa de un microtubo que contenga al menos 440 microlitros de una muestra de proteína. Asegúrese de que la muestra no tenga espuma por encima del menisco, ya que esto interferirá con el sistema de detección de líquidos. Coloque el tubo en la posición 1 del portador de enfriamiento de microtubos.

Coloque una placa PCR en la plataforma del manipulador de líquidos frente al soporte del adaptador móvil de placas. A continuación, cierre el panel frontal. En la interfaz de administración del método del manipulador de líquidos, seleccione Placas de configuración.

Supervise la inicialización de ambos sistemas y rellene los parámetros de ejecución, incluido el tipo de placa y el número de gotas para cada condición, el tamaño de la gota, la posición de la primera placa que se procesará y el número de placas. Haga clic en No cuando se le pregunte si desea ayuda para cargar el mazo. Una vez que hayas comprobado que no hay gradillas de propinas vacías, haz clic en Aceptar. Una vez que hayas comprobado que hay suficientes consejos para la carrera, haz clic en Aceptar. Cuando sea necesario, actualice el sistema de gestión de propinas y haga clic en Aceptar. Asegúrese de que la plataforma del dispensador de nanolitros esté libre del bloque de soporte de tiras y que el portador esté en la parte posterior de las pilas de puntas de 50 microlitros, esté libre de las tapas de aluminio SBS.

Vuelva a verificar que todos los demás componentes necesarios estén listos y luego inicie el proceso. Supervise el sistema a medida que el dispensador de nanolitros fija las gotas en la primera placa y el sellador de placas sella posteriormente la placa. No deje el sistema desatendido hasta que se complete la preparación de la primera placa.

Una vez que las 20 placas se hayan preparado con gotas de cristalización y regresen automáticamente a los soportes deslizantes, abra el panel frontal y retire suavemente las placas. Compruebe que las placas estén correctamente selladas antes de almacenarlas para su cristalización. Limpie las tapas SBS con la solución de etanol al 20% antes de apilarlas en el lado izquierdo del manipulador de líquidos para su almacenamiento.

Deseche la placa de PCR y el microtubo. Apague el portador de enfriamiento de microtubos y limpie la condensación. Deje una toalla de papel encima de la superficie del enfriador para absorber más condensación.

A continuación, vuelva a colocar la cubierta del soporte y cierre el panel frontal. OmpF y MreB se examinaron inicialmente utilizando estos protocolos totalmente automatizados. Se encontraron cristales de OmpF de calidad suficiente para la difracción de rayos X en el pozo A4 de la placa LMB 7.

Se encontraron cristales de MreB de calidad de difracción en el pozo D12 de la placa LMB 20. El almacenamiento de las placas de precombustible a 10 grados centígrados es un compromiso para evitar la congelación y el almacenamiento a 4 grados, lo que puede causar deterioro de las condiciones de cristalización y problemas relacionados con la condensación. Cuando se almacenan de esta manera, las placas se pueden usar dentro de cuatro a cinco meses.

Se producen anualmente entre 4 y 8.000 placas LMB con el Sistema 1 y se utilizan posteriormente para el cribado inicial. Los protocolos deben optimizarse de manera diferente cuando la rotación esperada es mucho menor. Todo nuestro conjunto de placas de precombustible se utiliza normalmente como una gran criba inicial para una nueva muestra.

Sin embargo, es posible que se seleccionen menos placas para requisitos de muestra muy específicos. Después de preparar las gotas, las placas se almacenan en estantes de baja vibración con la temperatura estrictamente controlada a 4 o 18 grados centígrados. Los experimentos se evalúan con microscopios de fuente de luz scroll.

Después de investigar cuidadosamente la naturaleza de los cristales, los rasgos y las similitudes entre las condiciones se pueden analizar con herramientas basadas en la web, como las bases de datos LMB o C6 Screen. Es posible que aún sea necesaria la optimización posterior de las condiciones de cristalización. En nuestro manuscrito se describen protocolos automatizados adicionales, con los métodos de 4 esquinas y el cribado aditivo.