Uso de inmunomarcación para analizar microtúbulos estables, dinámicos y emergente en el embrión de pez cebra

El objetivo general de estos procedimientos de marcado es obtener imágenes y cuantificar microtúbulos estables, dinámicos y nascentes en el embrión de pez cebra en desarrollo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurobiología del desarrollo, como, cómo contribuyen los microtúbulos al establecimiento de la polaridad celular. La principal ventaja de esta técnica es que optimiza la detección y cuantificación de poblaciones distintas de microtúbulos in situ.

Generalmente, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a los problemas para mantener la integridad de los microtúbulos. Después de desclorinar embriones de pez cebra en estadios determinados según el protocolo descrito, transfiérelos a tubos cónicos de 1,5 mL, eliminando tanto medio como sea posible. Añada un mililitro de PFA al 4 % en tampón de ensamblaje de microtúbulos o MAB, para fijar los embriones a 28,5 grados Celsius durante cinco minutos.

Luego, use una pipeta para aspirar el fijador y reemplazarlo con un mililitro de fijador fresco. Incube las muestras en un agitador orbital a temperatura ambiente durante tres horas. Aspire el fijador y agregue un mililitro de tampón TBS NP-40.

Agite suavemente los embriones en un agitador durante cinco minutos. Repita el lavado otras dos veces. Luego, después de reemplazar el tampón con un mililitro de TBS NP-40 fresco, almacene los embriones a cuatro grados Celsius durante no más de siete días.

Después de eliminar la yema e incrustar los embriones en agarosa según el protocolo descrito en el texto, coloque el recipiente para seccionar lleno con TBS NP-40 y utilice un vibrátomo para obtener secciones de 40 micrómetros en el eje más alto de los embriones incrustados en agarosa. Use pinzas finas para transferir las secciones de interés a 500 microlitros de TBS NP-40 en una placa de 24 pocillos. Retire el tampón y añada 500 microlitros de solución bloqueadora.

Luego, agite las secciones a temperatura ambiente durante al menos una hora. Sustituya la solución de bloqueo por 300 microlitros de anticuerpos primarios diluidos en tampón de bloqueo e incube las muestras en un agitador a cuatro grados Celsius durante 36 a 72 horas. Use 600 microlitros de TBS NP-40 para lavar las muestras dos veces.

Colóquelas en un agitador a temperatura ambiente durante 30 minutos cada una. Añada 300 microlitros de anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo diluidos en tampón de bloqueo a las secciones e incúbelas a oscuras en un agitador a cuatro grados Celsius durante 16 a 24 horas. Luego lave las muestras dos veces como se acaba de demostrar.

A continuación, agregue 500 microlitros de solución de DAPI a los embriones e incúbelos a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego, use TBS NP-40 para lavar las muestras tres veces a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de los lavados, coloque una gota de medio de montaje con agente antifade en el centro de un portaobjetos libre de polvo.

Utilice pinzas finas para transferir las secciones a la gota de medio de montaje. Luego coloque un cubreobjetos libre de polvo encima de la muestra. Almacene los portaobjetos envueltos en papel de aluminio, en un lugar seco, oscuro y fresco hasta que se realice la imagen.

Utilizando los detalles descritos en el protocolo escrito, capture imágenes confocales en z-stacks con ajustes de canales para los fluoróforos del anticuerpo secundario seleccionado y guarde los archivos de imagen. Con un software de análisis 3D como Image J, abra una copia del archivo de datos. Cree una imagen fusionada superponiendo los canales de interés seleccionando imagen, color y fusionar canales.

Seleccione los canales de 594 nanómetros, 488 nanómetros y DAPI para colorearlos artificialmente de rojo, verde y azul, respectivamente. Marque la casilla, cree una imagen compuesta y seleccione, luego haga clic en Aceptar. Visualice la pila Z combinada como una única imagen 2D realizando una proyección de intensidad máxima de la pila Z utilizando imágenes, pila, proyección Z.

Ingrese las posiciones inicial y final de los mejores planos z internos como la diapositiva inicial y la sección final, respectivamente. Seleccione la intensidad máxima como tipo de proyección y haga clic en aceptar. En el software de análisis 3D, seleccione crear biblioteca y proporcione un nombre descriptivo para la biblioteca de imágenes.

Haga clic, cree y arrastre archivos de imagen cruda a la biblioteca. A continuación, seleccione un archivo para analizar. Luego, en el menú de vista, elija enfoque extendido para mostrar la imagen fusionada por canales en la ventana principal.

Seleccione la herramienta de ROI de mano libre y delimite la región de interés que se analizará. Seleccione la pestaña acciones, seguida de recortar a la selección, para recortar la imagen. Luego guarde el archivo de imagen recortada con un nombre nuevo.

A continuación, haga clic en la pestaña mediciones para crear el protocolo de filtrado de objetos específicos relevantes para el análisis 3D. Luego, arrastre la función encontrar objetos a la ventana del protocolo y cambie el nombre del primer protocolo a DAPI. Seleccione el canal de beta tubulina en el menú desplegable.

Luego, arrastre los siguientes ajustes al protocolo de beta tubulina y colóquelos debajo de "encontrar objetos" en el siguiente orden: rellenar huecos y objetos, separar objetos que se tocan, excluir objetos por tamaño y excluir objetos que no tocan las ROI. Ahora, seleccione "medir" en la parte inferior de cada protocolo.

Luego, para todos los canales excepto DAPI, seleccione la medición de intensidad y volumen, y la longitud esquelética para todas las etiquetas de tubulina. Dibuje una ROI alrededor de la región que se va a medir. En la pestaña de resumen, observe las mediciones después de que el software procese la región.

Luego copie los datos y guárdelos en una hoja de cálculo utilizable como se muestra aquí. Para construir un aparato de flujo a través de múltiples pocillos, utilizando una plantilla o una sierra de cinta, divida longitudinalmente un tubo centrífugo de 50 mililitros por la mitad. A partir de una malla de nailon de 70 micrómetros, corte siete semicírculos con un radio de tres centímetros y ajústelos para que encajen firmemente en una mitad del tubo centrífugo dividido.

Utilizando un sellador de silicona seguro para acuarios, pegue los semicírculos dentro del tubo centrífugo en paralelo a las marcas de graduación de 10 mililitros. Después de dejar que el dispositivo se seque durante dos días, enjuáguelo sumergiéndolo en un vaso de precipitados con agua durante dos o tres horas. Forre el extremo roscado superior del tubo centrífugo cortado con arcilla de modelar, de manera que la altura del líquido retenido en el dispositivo de flujo continuo tenga una profundidad de un cuarto de pulgada.

Prepare el aparato de lavado retirando el émbolo de una jeringa de 50 mililitros e inserte 30 centímetros de tubo delgado en la punta. Empuje el tubo tanto como sea posible y use arcilla de modelar para sellar alrededor de la unión. Con medio para embriones, humedezca previamente la malla para permitir que el líquido fluya a través de todo el dispositivo de flujo continuo.

Coloque el dispositivo sobre hielo con un ángulo tal que el líquido llene todos los compartimentos, pero aún pueda salir por la parte delantera donde se encuentra el borde de arcilla. Suspenda el aparato de lavado en un soporte con anillo por encima del dispositivo de flujo, manteniéndolo sobre hielo. Enfríe 200 mililitros de medio para embriones sobre hielo y vierta una cantidad suficiente en el aparato de lavado para asegurar que se eliminen todas las burbujas de aire y que la velocidad de flujo sea aproximadamente de siete mililitros por minuto.

Ajuste el caudal modificando la altura de la jeringa. Después de desclorinar los embriones y preparar la nocodazol según el protocolo descrito en el texto, utilice 10 mililitros de solución de trabajo fría de nocodazol para reemplazar el medio de los embriones del grupo de tratamiento con nocodazol. Coloque las placas de Petri sobre hielo durante un tiempo adecuado según el estadio de desarrollo.

Luego, utilizando una pipeta de vidrio de un mililitro con la punta pulida al fuego, transfiera los embriones al aparato de flujo continuo usando compartimentos separados para cada grupo experimental. Inicie la eliminación de nocodazol vertiendo medio para embriones frío en hielo en la parte superior de la jeringa de 50 mililitros. Permita que los microtúbulos vuelvan a crecer tras 20 minutos de lavado a temperatura ambiente utilizando una pipeta de vidrio de un mililitro con la punta pulida al fuego para transferir los embriones a placas de Petri de vidrio que contengan medio para embriones tibio.

Apenas se transfieran los embriones, inicie un cronómetro. Finalmente, fije los embriones de control y de lavado a uno, cinco y diez minutos pipeteando aproximadamente 10 embriones en un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros lleno con un mililitro de fijador MAB al 4 % PFA y fije las muestras como se demostró anteriormente en este video. Utilizando glu-tubulina y tyr-tubulina como marcadores para microtúbulos estables y dinámicos.

Se ha demostrado que los microtúbulos dinámicos predominan en el cerebro posterior en la etapa de placa neural. A medida que la placa se desarrolla en el cordón neural, una etapa de epitelialización aumentada, cualitativamente hay menos microtúbulos inmunorreactivos con el anticuerpo anti-tubulina tyr, especialmente en el cordón neural ventral. En contraste, la tubulina glu está dispersa y puntiforme en toda la placa neural, pero se enriquece en el cordón neural ventral a lo largo del trayecto de los microtúbulos.

Las cabezas de flecha indican haces o estructuras microtubulares específicas donde la marcación está aumentada. El tratamiento con nocodazol despolimeriza los microtúbulos, lo que resulta en una marcación difusa. A medida que los microtúbulos vuelven a crecer, se extienden desde el centrosome.

Sin embargo, esto puede no ser evidente en un solo plano debido a sus trayectorias no planares. No obstante, algunos programas de análisis de imágenes pueden medir longitudes en 3D, lo que permite evaluar el crecimiento de los microtúbulos tras el lavado de nocodazol. La longitud media de los microtúbulos parece aumentar con el tiempo tras el lavado de nocodazol en todas las regiones del tubo neural analizadas.

Una vez finalizado el análisis de datos mediante el software de análisis de imágenes 3D y controlada la calidad, se puede recuperar información útil de los datos brutos, como la longitud promedio de los microtúbulos totales y de los microtúbulos estables, junto con la proporción de microtúbulos estables respecto a los microtúbulos totales. Una vez dominada, esta técnica no lleva más de una semana desde el comienzo hasta el final. Al intentar este procedimiento, es importante recordar recolectar y procesar las muestras de manera oportuna, ya que los microtúbulos se despolimerizan fácilmente.

Este procedimiento también puede aplicarse al análisis de mutantes. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo capturar poblaciones distintas de microtúbulos en el embrión intacto.