Uso de inmunomarcación para analizar microtúbulos estables, dinámicos y emergente en el embrión de pez cebra

El objetivo general de estos procedimientos de etiquetado es obtener imágenes y cuantificar microtúbulos estables, dinámicos y nacientes en el embrión de pez cebra en desarrollo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurobiología del desarrollo, como por ejemplo, cómo contribuyen los microtúbulos al establecimiento de la polaridad celular. La principal ventaja de esta técnica es que optimiza la detección y cuantificación in situ de distintas poblaciones de microtúbulos.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a las dificultades para mantener la integridad de los microtúbulos. Después de declular los embriones de pez cebra en etapas de acuerdo con el protocolo de texto, transfiéralos a tubos de centrífuga de 1,5 mililitros, eliminando la mayor cantidad de medio posible. Añadir un mililitro de PFA al 4% en tampón de ensamblaje de microtúbulos o MAB, para fijar los embriones a 28,5 grados centígrados durante cinco minutos.

A continuación, utilice una pipeta para aspirar el fijador y sustitúyalo por un mililitro de fijador fresco. Incubar las muestras en un balancín a temperatura ambiente durante tres horas. Aspirar el fijador y añadir un mililitro de tampón TBS NP-40.

Agite suavemente los embriones en una mecedora durante cinco minutos. Repite el lavado dos veces más. Luego, después de reemplazar el tampón con un mililitro de TBS NP-40 fresco, almacene los embriones a cuatro grados centígrados durante no más de siete días.

Después de des-yemar e incluir embriones en agarosa de acuerdo con el protocolo de texto, coloque el plato de sección lleno de TBS NP-40, use un vibratomo para generar secciones de 40 micrómetros del acceso más alto de los embriones incrustados en agarosa. Utilice pinzas finas para transferir secciones de interés a 500 microlitros de TBS NP-40 en una placa de 24 pocillos. Retire el tampón y agregue 500 microlitros de solución de bloqueo.

A continuación, agita las secciones a temperatura ambiente durante al menos una hora. Reemplace la solución de bloqueo con 300 microlitros de anticuerpos primarios diluidos en tampón de bloqueo e incube las muestras en un balancín a cuatro grados centígrados durante 36 a 72 horas. Utilice 600 microlitros de TBS NP-40 para lavar las muestras dos veces.

Colocándolos en una mecedora a temperatura ambiente durante 30 minutos cada uno. Agregue 300 microlitros de anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos diluidos en tampón de bloqueo a las secciones e incube en la oscuridad en un balancín a cuatro grados centígrados durante 16 a 24 horas. A continuación, lave las muestras dos veces como se acaba de demostrar.

A continuación, añade 500 microlitros de solución de DAPI a los embriones e incuba a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, utilice TBS NP-40 para lavar las muestras tres veces a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de los lavados, coloque una gota de medio de montaje con agente antidecoloración en el centro de un portaobjetos libre de polvo.

Utilice pinzas finas para transferir las secciones a la gota del medio de montaje. A continuación, coloque un cubreobjetos libre de polvo encima de la muestra. Guarde los portaobjetos envueltos en papel de aluminio, en un lugar seco, oscuro y fresco hasta que se realicen las imágenes.

Utilizando los detalles descritos en el protocolo de texto, capture imágenes confocales de la pila z con la configuración de canal para los fluoróforos de anticuerpos secundarios seleccionados y guarde los archivos de imagen. Con un software de análisis 3D como Image J, abra la copia del archivo de datos. Cree una imagen combinada superponiendo los canales de interés seleccionando imagen, color, fusionar canales.

Seleccione los canales de 594 nanómetros, 488 nanómetros y DAPI para que sean de falso color rojo, verde y azul respectivamente. Marque, cree un compuesto y seleccione, está bien. Visualice la pila z fusionada como una sola imagen 2D realizando una proyección de intensidad máxima de la pila z mediante imágenes, pila, proyecto z.

Introduzca las posiciones inicial y final de los mejores planos z interiores como el corte de inicio, deslizamiento y parada, respectivamente. Seleccione Intensidad máxima como tipo de proyección y haga clic en Aceptar. En el software de análisis 3D, seleccione, cree biblioteca y proporcione un nombre descriptivo para la biblioteca de imágenes.

Haga clic, cree y arrastre archivos de imagen sin procesar a la biblioteca. A continuación, seleccione un archivo para analizar. A continuación, en el menú de visualización, elija enfoque extendido para mostrar la imagen combinada de canales en la ventana principal.

Seleccione la herramienta de ROI a mano alzada y delinee la región de interés a analizar. Seleccione la pestaña de acciones, seguida de recortar a selección para recortar la imagen. A continuación, guarde el archivo de imagen recortado con un nuevo nombre.

A continuación, haga clic en la pestaña de mediciones para crear el protocolo para filtrar objetos específicos relevantes para el análisis 3D. A continuación, arrastre, busque objetos en la ventana de protocolo y cambie el nombre del primer protocolo, DAPI. Seleccione el canal beta de tubulina en el menú desplegable.

A continuación, arrastre los siguientes ajustes al protocolo beta tubulin y colóquelos debajo de buscar objetos en el siguiente orden. Rellene agujeros y objetos, separe los objetos táctiles, excluya los objetos por tamaño y excluya las ROI que no se tocan. Ahora, seleccione, medir en la parte inferior de cada protocolo.

Luego, para todos los canales excepto DAPI, elija la medición de intensidad y volumen y la longitud del esqueleto para todo el etiquetado de tubulina. Dibuje un retorno de la inversión alrededor de la región que se va a medir. En la pestaña de resumen, observe las mediciones después de que el software procese la región.

A continuación, copie los datos y guárdelos en una hoja de cálculo viable, como se muestra aquí. Para construir un aparato de flujo múltiple de pozos, utilizando una plantilla o una sierra de cinta, divida una tina de centrífuga de 50 mililitros por la mitad a lo largo. A partir de una malla de nailon de 70 micrómetros, corte siete semicírculos con un radio de tres centímetros y recórtelos para que quepan firmemente en la mitad del tubo de centrífuga dividido.

Con un sellador de silicona apto para acuarios, pegue los semicírculos en el tubo de centrífuga paralelos a las marcas de gradación de 10 mililitros. Después de dejar que el dispositivo se seque durante dos días, enjuáguelo sumergiéndolo en un vaso de precipitados con agua durante dos o tres horas. Cubra el extremo roscado superior del tubo de centrífuga cortado con arcilla para modelar, de modo que la altura del líquido retenido en el dispositivo de flujo tenga una profundidad de un cuarto de pulgada.

Prepare el aparato de lavado quitando el émbolo de una jeringa de 50 mililitros e inserte 12 pulgadas de tubo fino en la punta. Empuje el tubo hacia adentro tanto como sea posible y use arcilla para modelar para sellar alrededor de la junta. Con el medio para embriones, humedezca previamente la malla para permitir que el líquido corra a través de todo el dispositivo de flujo.

Incline el dispositivo sobre el hielo para que el líquido entre en todos los compartimentos, pero aún así se vacíe por la parte delantera donde se encuentra el borde de arcilla. Suspenda el aparato de lavado en un soporte de anillo sobre el dispositivo de flujo a través sobre hielo. Enfríe 200 mililitros de medio embrionario en hielo y vierta lo suficiente en el aparato de lavado para asegurarse de que se eliminen todas las burbujas de aire y que el caudal sea de aproximadamente siete mililitros por minuto.

Ajuste el caudal cambiando la altura de la jeringa. Después de declorar los embriones y preparar el nocodazol de acuerdo con el protocolo de texto, use 10 mililitros de solución de trabajo fría de nocodazol para intercambiar el medio embrionario del grupo de tratamiento con nocodazol. Coloque las placas de Petri en hielo durante un tiempo adecuado para la etapa de desarrollo.

A continuación, utilizando una pipeta de vidrio pulida por fuego en mililitros, se transfieren los embriones al aparato de flujo utilizando compartimentos separados para cada grupo experimental. Comience el lavado con nocodazol vertiendo medio de embrión helado en la parte superior de la jeringa de 50 mililitros. Permita que los microtúbulos vuelvan a crecer después de 20 minutos de lavado a temperatura ambiente mediante el uso de una pipeta de vidrio de un mililitro pulida al fuego para transferir embriones a placas de Petri de vidrio que contengan medio embrionario caliente.

Tan pronto como se transfieran los embriones, inicie un temporizador. Por último, fije los embriones de control y de lavado a uno, cinco y 10 minutos pipeteando aproximadamente 10 embriones en un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros lleno de un mililitro de fijador MAB al 4% de PFA y fije las muestras como se ha demostrado anteriormente en este vídeo. Uso de glu-tubulina y tyr tubulina como marcadores de microtúbulos estables y dinámicos.

Se ha demostrado que los microtúbulos dinámicos pre=dominan en el cerebro posterior en la etapa de muerte neuronal. A medida que la muerte se desarrolla en la varilla neural, una etapa de epitelización mejorada, cualitativamente, menos microtúbulos son inmunorreactivos con el anticuerpo anti-tibulina, especialmente, en la varilla ventral. Por el contrario, la glu-tubulina se dispersa y puntea a lo largo de la muerte neuronal, pero se enriquece en el bastón neural ventral a lo largo del tracto de los microtubérculos.

Las puntas de flecha apuntan a haces o estructuras microtubulares específicas donde el etiquetado está aumentado. El tratamiento con nocodazol despolimeriza los microtúbulos, lo que da como resultado un etiquetado desactivado. A medida que los microtúbulos vuelven a crecer, se extienden desde el centrosoma.

Sin embargo, esto puede no ser obvio en un solo avión debido a sus trayectorias no planas. Sin embargo, algunos software de análisis de imágenes son capaces de medir longitudes en 3D, lo que permite evaluar el crecimiento de los microtúbulos después del lavado con nocodazol. La longitud media de los microtúbulos parece aumentar con el tiempo después del lavado con nocodazol en todas las regiones del tubo neural analizadas.

Una vez que se finaliza el análisis de datos utilizando el software de análisis de imágenes 3D y se controla la calidad, se puede recuperar información útil de los datos sin procesar, como la longitud promedio de los microtúbulos totales y los microtúbulos estables con la relación entre los microtúbulos estables y los microtúbulos totales. Una vez dominada, esta técnica no lleva más de una semana de principio a fin. Al intentar este procedimiento, es importante recordar recolectar y procesar muestras de manera oportuna, ya que los microtúbulos se despolimerizan fácilmente.

Este procedimiento también se puede aplicar al análisis de mutantes. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo capturar distintas poblaciones de microtúbulos en el embrión intacto.