Microcristalografía de Protein Crystals y

El objetivo general de este protocolo es presentar las metodologías de cristalografía de rayos X aplicadas a microcristales, particularmente a aquellos producidos en células, que se consideran cristales in vivo. La principal ventaja de este enfoque es que proporciona un proceso sencillo y eficiente para producir, detectar y analizar microcristales. Este método pretende facilitar el uso de microcristales mediante el empleo de cristales crecidos dentro de células vivas, lo que elimina la necesidad de procesos complejos de purificación y ensayos de sedación con Aprocox.

En este video nos centraremos en la preparación y manipulación sencilla para experimentos de desviación de rayos X en una línea de haz de sincrotrón. Mostraremos los pasos que difieren más de la cristalografía clásica. En esta demostración utilizaremos cristales de la proteína del poliedro vital cultivados con éxito, pero el método también puede aplicarse a proteínas que forman cristales en cualquier tipo de célula bacteriana, de insecto, mamífera o de levadura.

Primero, incube 30 mililitros de células Sf9 que sobreexpresan la proteína de poliedro del cipovirus durante tres días a 27 grados celsius en una plataforma rotatoria. Transfiera 500 microlitros de cultivo celular Sf9 a un tubo de microcentrífuga utilizando una pipeta serológica estéril, teniendo cuidado de mantener la esterilidad del cultivo principal mediante el uso de una cabina de seguridad biológica clase II y siguiendo técnicas asépticas estándar. Pipete cinco microlitros de células del tubo de microcentrífuga sobre un portaobjetos de vidrio.

Luego, incline suavemente una lámina de vidrio sobre la muestra con un borde tocando la gota y baje cuidadosamente la cubreobjetos sobre el líquido, evitando la formación de burbujas de aire. A continuación, obtenga una imagen del portaobjetos con un microscopio invertido. Examine cuidadosamente las células, comenzando con un aumento de 200x y acercando al máximo aumento al detectar un cristal potencial.

Busque bordes definidos y cambios en la refractividad. Si se identifican cristales, examine el cultivo diariamente para monitorear el crecimiento cristalino repitiendo los pasos anteriores. Para células Sf9, recolecte transfiriendo el cultivo a un tubo de centrífuga.

Coloque el tubo en hielo y continúe con el siguiente paso lo antes posible. Para el aislamiento de células que contienen cristales, pipetee cuatro mililitros de células Sf9 infectadas en un tubo adaptado para análisis por citometría de flujo. Prepare un segundo tubo con un número equivalente de células Sf9 procedentes de un cultivo mock infectado como control.

A continuación, agregue yoduro de propidio a ambas muestras hasta alcanzar una concentración final de un microgramo por mililitro, justo antes de la evaluación mediante citometría de flujo. Ahora, aplique las células de la muestra control a un citómetro de flujo estándar capaz de ordenar células según FSC y SSC. Analice al menos 20.000 eventos.

Tras descartar células muertas, agregados celulares y restos de la muestra en el análisis, genere el gráfico de FSC frente a SSC. A continuación, analice al menos 20.000 eventos de la muestra que contiene cristales. Compare el gráfico de FSC frente a SSC con el control y busque la aparición de una población distinta correspondiente a células que contienen cristales.

Defina las compuertas alrededor de la población celular que contiene cristales, que generalmente aparece con valores más altos de SSC o FSC. Mediante esta estrategia de selección, separen alrededor de 150.000 a 200.000 células que contienen cristales en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros previamente llenado con 50 microlitros de tampón PBS. Observe las muestras separadas mediante microscopía de luz, como se describió anteriormente, para confirmar qué población está asociada con células que contienen cristales.

En esta etapa, las células pueden estar incubando con soluciones de átomos pesados si se requiere el aplazamiento experimental. Este enfoque sigue el tamizaje de diversos compuestos y tiempos de incubación descritos en el texto y en otras revisiones. Prepare las herramientas para montar la muestra sujetando primero una micromalla montada en un pin al extremo de una varilla magnética.

Coloque la varilla de forma lateral en la hendidura de una boya de diálisis flotante. Luego, tome una mecha de papel con un par de pinzas y bloquéelas. Verifique nuevamente que el montaje esté completo antes de continuar.

Ahora, mezcle las células con un volumen igual de solución de azul de tripano al 0,4 % para obtener una concentración final del 0,2 %. Después de resuspender las células, aspire 0,5 microlitros de las células ordenadas y dispóngalos sobre la malla microscópica. Tras permitir que las células se depositen sobre la superficie de la malla, elimine la mayor parte del líquido excedente mediante absorción con una mecha de papel. Si la malla microscópica no se seca suficientemente, las células quedarán a diferentes profundidades dentro del líquido excedente, lo que complicará su alineación con el haz de rayos X en el sincrotrón.

Además, el exceso de líquido aumentará la dispersión de rayos X de fondo. Si la malla microscópica se seca en exceso, el líquido se eliminará por completo y la muestra no se mantendrá en las aberturas de la rejilla. Con un secado óptimo, solo queda una capa delgada de líquido sobre la malla microscópica, lo que protege la muestra y la obliga a entrar en las aberturas de la rejilla.

Algunos cristales requerirán el uso de un crioprotector. Esto no es necesario en nuestro caso, pero el procedimiento sería el mismo que para aplicar la muestra y luego secarla. Asegúrese de que solo quede una capa delgada de líquido.

Enfriar inmediatamente por choque el microrejilla en nitrógeno líquido y transferirlo a una barquilla robótica para su transporte a una línea de haz microenfocada de sincrotrón. Debido al pequeño tamaño de los cristales in vivo, recoger datos de fracción en una línea de haz de cristalografía microenfocada. Primero, montar el microrejilla en el goniómetro.

Ahora, comience centrando la malla microscópica con la trayectoria del haz utilizando las orientaciones frontal y lateral. Con la malla microscópica en orientación frontal, ajuste finamente la alineación alineando el centro de una de las hileras horizontales de la malla microscópica. Recolecte datos a lo largo de esta hilera horizontal con solo pequeños reajustes en la alineación.

Una vez que se hayan probado todos los cristales del canal, continúe con el siguiente canal y repita el procedimiento de alineación. Asegúrese de identificar claramente los canales que ya han sido procesados para no omitir cristales ni irradiarlos dos veces, utilizando el cambio de color del azul de tripano como guía. Se presenta una visión general de dos métodos para la determinación de estructuras utilizando microcristales in vivo.

La fila superior describe el enfoque clásico que implica la purificación de cristales a partir de células, mientras que la fila inferior muestra el enfoque de cristalografía en célula que mantiene los cristales dentro de las células huésped para la recopilación de datos. En el enfoque en célula, se compara el perfil de citometría de flujo de células no infectadas con el perfil de células que contienen cristales, y se utiliza para determinar qué población celular debe seleccionarse para separar las células con cristales del resto de las células. En este ejemplo, las células que contienen poliedros presentan un mayor dispersión lateral que las células no infectadas.

Las células teñidas con azul de tripano pueden visualizarse fácilmente mediante cámaras disponibles en la mayoría de las líneas de luz de sincrotrón. Aunque los cristales purificados son laboriosos de identificar y alinear con el haz de rayos X debido a su pequeño tamaño, al recopilar datos es mejor proceder en un patrón de cuadrícula para minimizar los procedimientos de centrado y evitar exponer la misma célula o cristal más de una vez o pasar por alto células y cristales. Una vez dominado, este flujo requiere aproximadamente medio día desde la recolección de las células que contienen cristales hasta la adquisición de datos.

Este procedimiento es compatible con inmersiones en átomos pesados para el emparejamiento experimental de fases. En el caso del poliedro, la estructura normal se obtuvo en ocho días a partir del inicio de la expresión proteica. No olvide que trabajar con nitrógeno líquido puede ser extremadamente peligroso y que se deben tomar precauciones contra la asfixia y las quemaduras.