Precondicionamiento hipóxico de las células progenitoras derivadas de la médula como fuente para la generación de células maduras de Schwann

El objetivo general de esta técnica de cultivo celular es enriquecer los progenitores neurales de la médula ósea para facilitar su diferenciación en células de Schwann funcionales. Este método aborda un tema clave en la medicina regenerativa y de células madre: cómo utilizar una fuente limitada de neuroprogenitores para generar glía que ayude en el recrecimiento axonal postraumático y la remielinización. Una ventaja de esta técnica es el uso de un acondicionamiento de cultivo eficiente para facilitar la expansión de las células neurales de las células estromales de la médula ósea para su uso en la terapia celular autóloga.

Después de dos días en cultivo, eliminar el 75% del medio gastado y las células no adherentes y enjuagar las células adherentes con tres lavados de PBS de 10 milímetros. Después del tercer lavado, reemplace el PBS con 10 mililitros de medio de crecimiento de células de estomal de médula, o MSC, y devuelva el cultivo a la incubadora. Las colonias visibles deberían aparecer entre el día seis y siete.

El día 10, lavar el cultivo en PBS fresco y separar las células con 1,5 mililitros de reactivo de disociación celular enzimática recombinante. Después de cinco minutos a 37 grados centígrados, agregue tres mililitros de medio de crecimiento MSC para neutralizar la reacción y recoger las células desprendidas por centrifugación. Vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de medio de crecimiento MSC fresco y siembre las células con una densidad de cuatro veces 10 a la cuarta células por centímetro cuadrado en una nueva placa de cultivo de tejidos de 10 centímetros.

Las células deben alcanzar un 80 a 90% de confluencia dentro de los dos días posteriores al paso. Para el preacondicionamiento hipóxico, primero suelte la abrazadera del anillo y limpie las partes expuestas con etanol al 70%. Desmonte aún más la cámara de hipoxia en componentes y colóquelos en una campana de flujo laminar para la esterilización bajo luz ultravioleta durante 15 minutos.

A continuación, lavar un cultivo de MSC confluente del 80 al 90% con 10 mililitros de PBS, como se acaba de demostrar, y tratar los cultivos con un medio de crecimiento fresco de MSC suplementado con hepes de 25 milimolares. Coloque el cultivo tratado en la cámara de hipoxia reensamblada y apriete la abrazadera del anillo. Selle los extremos de conexión de la cámara para asegurarse de que no haya fugas de gas y enjuague una mezcla de gas de 99% de nitrógeno y 1% de oxígeno en la cámara a un caudal de 10 litros por minuto.

Después de cinco minutos, coloque la cámara en la incubadora de cultivos celulares durante 16 horas. A la mañana siguiente, separe las células como se acaba de demostrar y recójalas por centrifugación. Vuelva a suspender el pellet en el medio progenitor neural y siembre seis veces 10 a la tercera celda por centímetro cuadrado en placas de 6 pocillos de baja adherencia para su cultivo a 37 grados centígrados y 5% de CO2 durante 12 días.

Se deben observar esferas de células no adherentes de tamaño considerable para el día seis o siete. Con más neurosferas aparentes en los cultivos condicionados por hipoxia que en los que estaban bajo normoxia a los días 10 a 12. El día 12, use una pipeta de 10 mililitros para transferir las neuroesferas a un tubo cónico de 15 mililitros y recoja las neuroesferas por centrifugación.

Vuelva a suspender las esferas en DMEM/F12 y coloque de cinco a 10 neuroesferas por centímetro cuadrado en placas de 6 pocillos recubiertas de poli-D-lisina laminina en 1,5 mililitros de medio de inducción glial por pocillo. Mantenga el cultivo de células esféricas durante al menos siete días, refrescando el medio cada tres días. Para recolectar los ganglios de la raíz dorsal, transfiera el primer embrión a una placa de cultivo de 10 centímetros que contenga PBS a temperatura ambiente bajo un microscopio de disección en posición prona e inserte pinzas de microdisección a lo largo de cada lado de la médula espinal.

Usando una disección roma, separe la médula espinal del tejido blando circundante usando fórceps para extirpar la médula espinal a lo largo de la abertura del cuello y el talón de la cola. Extirpe el tejido blando residual de la médula espinal liberada hasta que solo queden la médula espinal, las raíces nerviosas y el ganglio de la raíz dorsal adherido. Separe los ganglios de la raíz dorsal individuales de sus raíces nerviosas conectivas.

A continuación, utilice una pluma pipeta equipada con una punta de pipeta de un mililitro para transferir hasta 100 ganglios de la raíz dorsal al tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros de PBS. Recoja los ganglios por centrifugación y resuspenda los gránulos en 200 microlitros de reactivo de disociación de células enzimáticas recombinantes por tubo. Después de 10 minutos a 37 grados centígrados, centrifugue los ganglios de la raíz dorsal nuevamente con una punta de pipeta de 200 microlitros para triturar suavemente los gránulos en el medio de mantenimiento de la neurona ganglionar de la raíz dorsal.

Siembre las células ganglionares de la raíz dorsal cinco veces 10 a la tercera celdilla por centímetro cuadrado en placas de 6 pocillos recubiertas de poli-D-lisina laminina en 1,5 mililitros de medio de mantenimiento de neuronas ganglionares de la raíz dorsal por pocillo. Después de dos días en cultivo a 37 grados centígrados y 5% de CO2, lave las células y devuelva los cultivos de células neuronales a la incubadora en un medio fresco de purificación de neuronas ganglionares de raíz dorsal durante otros dos días. Después de tres o cuatro ciclos de mantenimiento y purificación, los cultivos de células ganglionares de la raíz dorsal deben dar positivo para el marcador neuronal Tuj-1 y negativo para el marcador de células gliales S100 beta.

En el séptimo día del cultivo de células similares a células de Schwann, enjuague las células en PBS seguido de disociación con 0,5 mililitros de reactivo de disociación de células enzimáticas recombinantes por pocillo a 37 grados Celsius durante cinco minutos. Vuelva a suspender el pellet celular en el medio de cocultivo y siembre las células similares a las células de Schwann en el cultivo de neuronas ganglionares de raíz dorsal purificado a una vez de 10 a la tercera célula por centímetro cuadrado durante 14 días de cocultivo a 37 grados Celsius y 5% de CO2. Las MSC sanas exhiben una morfología cónica en contraste con la apariencia cuadrangular de las MSC que se han mantenido durante un gran número de pasajes y han perdido su multipotencia.

Las colonias expandidas de MSC deben demostrar la expresión de marcadores de MSC, la ausencia de marcadores de células madre hematopoyéticas y la capacidad de diferenciación en linajes adipogénicos, osteogénicos y condrogénicos. Los cultivos sanos de MSC que han sido sometidos a precondicionamiento hipóxico, muestran neuroesferas que son más grandes tanto en número como en tamaño. La pureza de la red neuronal del ganglio de la raíz dorsal puede confirmarse mediante la expresión del marcador neuronal Tuj-1 y la ausencia concomitante del marcador de células de Schwann S100.

Después de 14 días en cocultivo con neuronas ganglionares de la raíz dorsal, las células similares a las células de Schwann adquieren las características y propiedades funcionales de las células de Schwann maduras comprometidas con el destino. Una vez dominada, la subpoblación de progenitores neurales puede expandirse en BMSC humanas o de ratas en 10 días si la técnica de expansión celular se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar confirmar que la muestra de BMSC está dotada de neuroprogenitores nestin-positivos y que se han extirpado todos los progenitores hematopoyéticos CD45 positivos.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo obtener BMSC, enriquecer para la subpoblación de progenitores neurales y dirigir la diferenciación de progenitores neuronales en células de Schwann comprometidas con el destino para su uso en la mejora del recrecimiento axonal postraumático y la remielinización. Después de este procedimiento, se pueden derivar glías mielinizantes, como las células de Schwann maduras, para su uso en el desarrollo de terapias para lesiones desmielinizantes y enfermedades del sistema nervioso periférico y central.