Precondicionamiento hipóxico de las células progenitoras derivadas de la médula como fuente para la generación de células maduras de Schwann

El objetivo general de esta técnica de cultivo celular es enriquecer progenitores neurales de la médula ósea para facilitar su diferenciación en células de Schwann funcionales. Este método aborda un problema clave en la medicina regenerativa y de células madre: cómo utilizar una fuente limitada de neuroprogenitores para generar células gliales que ayuden en la regeneración axonal postraumática y la remielinización. Una ventaja de esta técnica es el uso de un acondicionamiento eficiente del cultivo para facilitar la expansión de células neurales a partir de células estromales de la médula ósea, con el fin de emplearlas en terapia celular autóloga.

Después de dos días en cultivo, retire el 75 % del medio gastado y las células no adherentes, y enjuague las células adherentes con tres lavados de PBS de 10 milimoles. Después del tercer lavado, sustituya el PBS por 10 mililitros de medio de crecimiento para células estromales de médula, o MSC, y regrese el cultivo al incubador. Deben aparecer colonias visibles entre el día seis y siete.

En el día 10, lave el cultivo con PBS fresco y desprenda las células con 1,5 mililitros de reactivo enzimático recombinante para disociación celular. Después de cinco minutos a 37 grados Celsius, agregue tres mililitros de medio de crecimiento para MSC para neutralizar la reacción y recolecte las células desprendidas mediante centrifugación. Resuspenda el precipitado en cinco mililitros de medio de crecimiento fresco para MSC y siembre las células a una densidad de cuatro por 10 a la cuarta células por centímetro cuadrado en una nueva placa de cultivo de tejidos de 10 centímetros.

Las células deben alcanzar una confluencia del 80 al 90 % en un plazo de dos días después del pase. Para la preacondicionamiento hipóxico, primero suelte la abrazadera de anillo y limpie las partes expuestas con etanol al 70 %. Desarme además la cámara de hipoxia en sus componentes y colóquelos en una cabina de flujo laminar para su esterilización bajo luz ultravioleta durante 15 minutos.

A continuación, lave una cultura de MSC confluente al 80-90 % con 10 mililitros de PBS tal como se acaba de demostrar y trate las culturas con medio de crecimiento para MSC fresco suplementado con 25 milimolar de hepes. Coloque la cultura tratada en la cámara de hipoxia reensamblada y apriete la abrazadera anular. Selle los extremos de conexión de la cámara para asegurar que no haya fugas de gas y purgue una mezcla de gas compuesta por 99 % de nitrógeno y 1 % de oxígeno dentro de la cámara a un flujo de 10 litros por minuto.

Después de cinco minutos, coloque la cámara en el incubador de cultivo celular durante 16 horas. A la mañana siguiente, desprenda las células como se acaba de demostrar y recópilas mediante centrifugación. Re-suspenda el sedimento en medio de progenitor neural y siembre seis veces 10 a la tercera células por centímetro cuadrado en placas de 6 pocillos con baja adhesión para su cultivo a 37 grados Celsius y 5%CO2 durante 12 días.

Deben observarse esferas celulares no adherentes de tamaño considerable al sexto o séptimo día. Habrá más neuroesferas evidentes en cultivos sometidos a condiciones de hipoxia que en aquellos bajo normoxia entre los días 10 y 12. En el día 12, utilice una pipeta de 10 mililitros para transferir las neuroesferas a un tubo cónico de 15 mililitros y recopile las neuroesferas mediante centrifugación.

Re-suspender las esferas en DMEM/F12 y sembrar de cinco a 10 neuroesferas por centímetro cuadrado en placas de 6 pocillos recubiertas con poli-D-lisina y laminina, con 1,5 mililitros de medio de inducción glial por pocillo. Mantener el cultivo celular de esferas durante al menos siete días, renovando el medio cada tres días. Para recolectar los ganglios de la raíz dorsal, transferir el primer embrión a una placa de cultivo de 10 centímetros que contenga PBS a temperatura ambiente bajo un microscopio estereoscópico, en posición prona, e insertar pinzas de disección microscópica a ambos lados de la médula espinal.

Mediante disección romo, separe la médula espinal del tejido blando circundante usando pinzas para extirpar la médula espinal a lo largo de la abertura del cuello y el muñón de la cola. Retire el tejido blando residual de la médula espinal liberada hasta que solo queden la médula espinal, las raíces nerviosas y el ganglio de la raíz dorsal adherido. Separe los ganglios de la raíz dorsal individuales de sus raíces nerviosas conectadas.

Luego, utilice un pipeteador equipado con una punta de pipeta de un mililitro para transferir hasta 100 ganglios de la raíz dorsal a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros de PBS. Recolecte los ganglios mediante centrifugación y resuspenda los pellets en 200 microlitros de reactivo enzimático recombinante para disociación celular por tubo. Después de 10 minutos a 37 grados Celsius, centrifugue nuevamente los ganglios de la raíz dorsal utilizando una punta de pipeta de 200 microlitros para triturar suavemente los pellets en medio de mantenimiento para neuronas del ganglio de la raíz dorsal.

Siembre las células del ganglio de la raíz dorsal a una densidad de cinco veces 10 a la tercera células por centímetro cuadrado en placas de 6 pocillos recubiertas con poli-D-lisina y laminina, utilizando 1,5 mililitros de medio de mantenimiento de neuronas del ganglio de la raíz dorsal por pocillo. Después de dos días de cultivo a 37 grados Celsius y 5 %CO2, lave las células y devuélvalas al incubador en medio fresco de purificación de neuronas del ganglio de la raíz dorsal durante otros dos días. Tras tres o cuatro ciclos de mantenimiento y purificación, los cultivos de células del ganglio de la raíz dorsal deben dar positivo para el marcador neuronal Tuj-1 y negativo para el marcador de células gliales S100 beta.

En el día siete del cultivo de células similares a células de Schwann, lave las células con PBS seguido de la disociación con 0,5 mililitros de reactivo enzimático recombinante para disociación celular por pocillo a 37 grados Celsius durante cinco minutos. Reuspenda el sedimento celular en medio de co-cultivo y siembre las células similares a células de Schwann sobre el cultivo purificado de neuronas del ganglio de la raíz dorsal a una densidad de 1 × 10³ células por centímetro cuadrado durante 14 días de co-cultivo a 37 grados Celsius y 5 %CO₂. Las CMM sanas presentan una morfología afilada en contraste con el aspecto cuadrangular de las CMM que se han mantenido durante un alto número de pasajes y han perdido su pluripotencialidad.

Las colonias de CMM expandidas deben demostrar la expresión de marcadores de CMM, la ausencia de marcadores de células madre hematopoyéticas y la capacidad de diferenciación en linajes adipogénicos, osteogénicos y condrogénicos. Las culturas de CMM sanas sometidas a un acondicionamiento hipóxico muestran neuroesferas mayores tanto en número como en tamaño. La pureza de la red neuronal del ganglio de la raíz dorsal puede confirmarse mediante la expresión del marcador neuronal Tuj-1 y la ausencia concomitante del marcador de células de Schwann S100.

Después de 14 días en co-cultivo con neuronas del ganglio de la raíz dorsal, las células similares a las células de Schwann adquieren las características y propiedades funcionales de células de Schwann maduras comprometidas con su linaje. Una vez dominado, el subpoblación de progenitores neurales puede expandirse en células mesenquimatosas de la médula ósea (BMSC) humanas o de rata en 10 días, si la técnica de expansión celular se realiza adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar confirmar que la muestra de BMSC posee progenitores neurogénicos positivos para nestina y que todos los progenitores hematopoyéticos positivos para CD45 han sido eliminados.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo obtener CMMO, enriquecer la subpoblación de progenitores neurales y dirigir la diferenciación de los progenitores neurales hacia células de Schwann comprometidas en su linaje, para su uso en la mejora del crecimiento axonal pos traumático y la remielinización. Tras este procedimiento, se pueden obtener glía mielinizantes, como las células de Schwann maduras, para su utilización en el desarrollo de terapias para lesiones y enfermedades desmielinizantes del sistema nervioso periférico y central.