Name: Una nueva técnica de trasplante de grasa mamaria para visualizar la generación de vasos de células madre endoteliales vasculares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: Aprende una técnica de trasplante de grasa mamaria para evaluar células madre endoteliales vasculares in vivo mediante preparación de montaje total y microscopía. Este método permite estudiar angiogénesis y regeneración vascular.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31530045 y 31371500 a YAZ, 31401245 a QCY), el Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (2014CB964800), la Academia China de Ciencias (XDB19000000 a YAZ) y el chino Sociedad de Biología Celular (Early Career Fellowship to QCY).

Los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Bioquímica y Biología Celular de Shanghai, Academia China de Ciencias bajo el protocolo aprobado SIBCB-NAF-15-002-S335-003. 1. Aislamiento de VESCs de la Glándula Mamaria de Ratón <ol><li> Cosecha de glándulas mamarias y digestión de tejidos. <ol><li> Utilizar ratones reportero virgen maduro Actin-GFP de 8 semanas de edad, con pesos comprendidos entre 20 y 25 g, como donantes de tejidos. Nota: Las células originadas del donante pueden ser fácilmente rastreadas por la expresión de GFP. </li><li> Preparar el medio base de la digestión del tejido que consiste en 5% de suero bovino fetal (FBS), 1% pen / strep y HEPES 25 mM en RPMI1640. Filtrar la mezcla a través de un filtro de 0,22 μm para esterilizar y precalentarlo a 37 ° C en un baño de agua. </li><li> Sacrificar a los ratones en una cámara de CO 2 . Disecar el cuarto par de glándulas mamarias inguinales haciendo primero una piel vertical iNcisión en la línea media inferior del abdomen usando un bisturí (o tijeras quirúrgicas). Suavemente pelar la piel a un lado para exponer la glándula mamaria inguinal con fórceps. Obtener la cuarta glándulas mamarias inguinales de ambos lados y cortarlos en trozos finos en una placa de Petri de 6 cm usando tijeras. <ol><li> Mida el peso total del tejido fino y colóquelo en un tubo de 50 ml. Nota: Asegúrese de que la mecha de tejido resultante sea menor de 1 mm 3 de tamaño para cada pieza. Un rendimiento típico es de aproximadamente 5.000 VESC por animal. </li></ol></li><li> Preparar el medio base de la digestión en un tubo centrífugo tapado de 50 ml con un volumen de 10 ml por 1 g de picado de tejido. Añadir la colagenasa Tipo 3 a la concentración de 300 unidades por 10 ml de medio base de digestión para constituir el tampón de digestión. Mezcle uniformemente y añádalo al picado de tejido. </li><li> Coloque horizontalmente el tubo de centrífuga de 50 ml en una plataforma oscilante y ajuste la velocidad a 100 rpm y la temperatura a 37 ° C. AgitarEl tejido mamario durante 2 h. Compruebe y agite manualmente el tubo cada 20 min para asegurar una digestión adecuada. Nota: El propósito de la digestión del tejido antes de FACS es preparar una solución de una sola célula de tejido sólido. Por lo tanto, al final de la digestión, el contenido debe ser una solución gruesa sin piezas de tejido visibles. </li></ol></li><li> Preparación de la solución de una sola célula. <ol><li> Después de la digestión, recargar el tubo de centrífuga de 50 ml con PBS estéril precalentado e invertir el tubo para que se mezcle uniformemente. Centrifugar el tubo a 200 xg durante 5 min para obtener un sedimento celular. </li><li> Elimine el sobrenadante y deslice el fondo del tubo para aflojar el sedimento celular. Añadir 3 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos (véase la tabla de materiales) e incubar en una campana de cultivo de tejidos a temperatura ambiente (RT) durante 5 minutos para eliminar los glóbulos rojos. </li><li> Añadir 10 ml de PBS estéril e invertir el tubo para mezclar uniformemente. Centrifugar el contenido de tejido a 200 xg durante 5 min y el discoY el sobrenadante. Añadir en 3 ml de tripsina precalentada al 0,05% y almacenar el tubo a 37 ° C durante 5 minutos para digerir aún más el tejido restante. </li><li> Añadir 3 ml de IMDM pre-calentado y luego agregar 100 μl de solución de DNasa I (0,25 mg de DNasa I diluida en 1 ml de PBS). Guarde el tubo a 37 ° C para romper los filamentos de ADN. Pasar la mezcla de tejidos a través de un filtro de células de 70 μm para obtener la solución celular. Enjuague el filtro dos veces con 2 mL de PBS + 5% de FBS para neutralizar la digestión enzimática. </li><li> Centrifugar la mezcla de células a 200 xg durante 5 minutos para sedimentar las células. Deseche el sobrenadante y resuspenda el sedimento celular en 1 ml de PBS + 5% de FBS para la tinción del anticuerpo. </li></ol></li><li> FACS basado en Procr + VESC aislamiento. <ol><li> Sujetar la mezcla celular obtenida de tejido mamario donante a la tinción de anticuerpos siguiendo los protocolos de rutina publicados 8 . Nota: Se utilizaron los siguientes anticuerpos: anti-ratónCD110-PCC1 anti-ratón CD110 (PECAM1) -PECY7, CD105-APC anti-ratón (todas ellas usadas a una concentración de 1 μg / mL), CD201 (Procr) -biotina anti-ratón (utilizada a una concentración de 2,5 Μg / ml) y estreptavidina-v450 (utilizada a una concentración de 0,5 μg / ml). <ol><li> Después de la tinción del anticuerpo, recargar las células con PBS + FBS al 5% y luego centrifugar a 200 g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células con 1 mL de PBS + 5% de FBS. Filtrar a través de un tamiz celular de 40 μm. Colocar en hielo hasta la clasificación FACS. </li></ol></li><li> Proceda a realizar la clasificación basada en FACS para aislar Procr + VESC. <ol><li> Analizar la muestra sin color y cada control de un solo color para determinar el voltaje de cada color. Calcular los parámetros de compensación para evitar la auto-fluorescencia o la tinción de fondo. Establecer la plantilla para el gating y la clasificación adecuada para las poblaciones de células deseadas. </li><li> Para establecer la jerarquía de clasificación FACS, primero elimine los desechos deTodos los eventos y luego desechar los dobletes o grupos de células adhesivas activando con ancho. Gate-out células de linaje de sangre y luego usar CD31 + y CD105 + para definir las poblaciones endoteliales. Nota: Las células Procr + se aislaron de CD31 + CD105 + ECs en comparación con un control de FMO. Un gráfico de análisis FACS representativo se muestra en la Figura 1 . Una población VESC aislada con FACS debe suspenderse en IMDM + 50% FBS y almacenarse en hielo hasta su posterior procesamiento. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Ensayo de formación de vasos VESC in vivo usando el cojín de grasa mamaria <ol><li> Preparar las EC primarias para el trasplante. <ol><li> Completar las células FACS-clasificadas con 10 ml de PBS + FBS al 5% y luego centrifugar a 200 xg durante 5 min para sedimentar las células hasta el fondo. </li><li> Aspirar el líquido con cuidado, contar el número de células utilizando un hemocitómetro, y resuspender el sedimento celular con la mezcla de matriz de membrana basal (consiPicadura de matriz de membrana basal al 50% y PBS con FBS al 20%, suplementado con rmVEGF 100 ng / mL y heparina 60 U / mL) para alcanzar una concentración de trabajo de 15.000 células / 15 μl. Nota: La mezcla de la matriz de la membrana basal siempre debe almacenarse en hielo. </li><li> Diluya en serie las células clasificadas y contadas para alcanzar las concentraciones de entrada requeridas en un microtubo de 1,5 ml, asegurándose de que los volúmenes finales de inyección no excedan de 15 μL en total. Añadir 0,1% de azul tripán a cada tubo para una mejor visualización del contenido durante el trasplante. Pipete bien para mezclar. Guarde los tubos en hielo hasta su uso. Nota: Se puede lograr una generación de buques con un mínimo de 100 VESCs. </li></ol></li><li> Transplantar EC primarias a la almohadilla de grasa mamaria. <ol><li> Desinfecte los instrumentos quirúrgicos y la bancada. Si se usan los mismos instrumentos en múltiples animales, se puede usar un esterilizador de talón para la desinfección. </li><li> Anestesiar 3 semanas de edad BALB / c desnuda micE utilizando el protocolo anestésico recomendado por el veterinario de su institución y el IACUC. Coloque cada ratón en posición supina, con la espalda en la mesa de operaciones. Inmovilice sus extremidades con cinta adhesiva. </li><li> Sumerja un hisopo de algodón en solución antiséptica a base de yodo. Limpie el área entera del abdomen del ratón a fondo para esterilizar la superficie de la piel antes de la cirugía. </li><li> Mantenga y levante la piel del abdomen del ratón con fórceps. Utilice un bisturí quirúrgico para realizar una pequeña incisión vertical de 1 cm. Haga dos cortes de aproximadamente 0,5 a 1 cm de longitud, cada uno hacia la pata trasera, para lograr una incisión invertida, con forma de Y. <ol><li> Use fórceps y un hisopo de algodón para separar suavemente la piel del abdomen y pin la piel de lado para exponer las glándulas mamarias inguinales. Coloque el ratón debajo de un estereoscopio y ajuste la ampliación a 2.0X. Asegúrese de ajustar el foco para que la almohadilla de grasa mamaria se ve claramente y se puede operar. </li></ol></li><li> Coloque un 27G 1/2 &quot;needlE en hielo para precalentar. Aplique una jeringa de 1 ml con una mezcla de matriz de membrana basal con antelación para eliminar posibles burbujas de aire atrapadas en la región de fijación de la aguja. Pipetear 15 μL de solución mezclada sobre la tapa del tubo de microcentrífuga y luego aspirar todo el volumen en la jeringa con cebado. </li><li> Mantenga la almohadilla de grasa mamaria delante del ganglio linfático inguinal, usando pinzas finas, y levántela ligeramente para facilitar la inyección. Inserte suavemente alrededor de 1/4 de la aguja de la jeringa en la almohadilla de grasa. <ol><li> Suelte las pinzas de la almohadilla de manía para agarrar y estabilizar la aguja de la jeringa. Inyecte lentamente la solución para evitar fugas de líquido. Mantenga durante unos segundos para asegurarse de que la mezcla celular se solidifica para minimizar la fuga al sacar la aguja. </li></ol></li><li> Cierre la solapa de la piel con suturas absorbibles. Suturar la aleta de la piel usando sutura de monofilamento no reactivo de tamaño 5-0 y cerrar las heridas con nudos tipo cirujano, cada nudo aproximadoDistancia de 0,3 cm. Alternativamente, cierre la piel con grapas heridas. </li><li> Coloque los ratones operados en una jaula separada para su recuperación. Coloque una lámpara de calefacción sobre la jaula para evitar que los ratones anestesiados sufren de hipotermia. Coloque papel blando y algodón en el fondo de la jaula para mantener a los ratones calientes después de la cirugía. <ol><li> Observe cuidadosamente a los ratones hasta que todos los receptores estén completamente despiertos. Durante los próximos días, aplique analgésicos posquirúrgicos de manera preventiva a todos los animales o según las instrucciones del veterinario de la instalación. Aplicar antibióticos según el protocolo animal aprobado si ocurre infección de la herida. Si la herida quirúrgica se cerró con grapas heridas, retire los clips de la herida 10 días después de la cirugía, cuando la herida esté completamente cerrada. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Preparación de tejidos de montaje completo para la observación microscópica <ol><li> Cosecha de tejidos <ol><li> A las 2 - 4 semanas después de la implantación, anestesiar al receptor BALB / cNude con una inyección intraperitoneal de 2,5% de agente anestesiante a una dosis de 0,12 ml por 20 g de peso corporal, como en el paso 2.2.2. Nota: El crecimiento positivo de los vasos puede detectarse 2 - 4 semanas después del trasplante celular. </li><li> Etiquetar la circulación sistémica del receptor con una inyección de vena de cola de colorante isolectina-647 a una dosis de 50 μg / 25 g de peso corporal, resuspendido en 50 μl de PBS estéril. Permita un período de reposo de 5 - 10 min. Sacrificar a los ratones usando CO 2 . </li><li> Diseccionar el área de tejido mamario donde las células se inyectaron inicialmente después de la etapa 2.2.4; Use tijeras quirúrgicas. Utilizando una cuchilla quirúrgica, cortar el tejido en aproximadamente 3 a 4 mm 3 cubos en una placa de Petri de 6 cm. </li></ol></li><li> La digestión y preparación del tejido para la tinción de anticuerpos. <ol><li> Digerir los trozos de tejido en un tubo de centrífuga de 15 ml llena con 10 ml de medio de base de digestión precalentada (etapa 1.1.2) suplementado con colagenasa III(300 U por 10 ml). </li><li> Coloque el tubo de centrífuga de 15 ml horizontalmente sobre una plataforma mecedora con la velocidad ajustada a 100 rpm y la temperatura ajustada a 37 ° C durante aproximadamente 1 h para aflojar la estructura del tejido y para eliminar excesivo tejido adipocito. Nota: Los adipocitos tienden a producir autofluorescencia lo que podría resultar en un fondo fluorescente ruidoso. Al final de la digestión, las piezas de tejido deben tener un aspecto suave y turbio. El período óptimo de digestión depende del tamaño de las piezas de tejido cortadas y por lo tanto debe ajustarse en consecuencia para obtener los mejores resultados. Dado que la vasculatura tisular ya ha sido etiquetada con Isolectina marcada con fluorescencia, todos los procedimientos siguientes deben llevarse a cabo protegidos de la luz. </li><li> Lave las piezas de tejido con PBS a RT durante 10 min. Fijar el tejido de montaje completo colocando cuidadosamente las piezas en una placa de Petri de 6 cm a medio llenar con PFA al 4% (pH 7,2-7,4) para preservar la fluorescencia. Coloque la placa de PetriSobre una plataforma mecedora y agitar suavemente el tejido durante 30 min a RT. Nota: PFA es carcinógeno y debe manejarse con precaución. </li><li> Eliminar el PFA restante y lavar el tejido fijo tres veces con tampón de lavado de montaje completo (tween al 0,1% en PBS), con un intervalo de 10 min entre cada lavado. </li></ol></li><li> Coloración del anticuerpo del tejido de montaje completo. <ol><li> Diluir el anticuerpo primario en tampón de tinción de anticuerpos en un tubo de centrífuga de 2 ml. Incubar el tejido con el anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C. Nota: Como anticuerpos primarios se utilizaron anti-CD31 de rata (concentración: 10 μg / ml) o cadherina anti-VE de rata (concentración de CD144 / Cdh5: 2,5 μg / ml). Tanto CD31 como VE-cadherina son marcadores de superficie celular usados ​​para reconocer el endotelio. Se prepara un tampón de tinción de anticuerpos 5x con ácido maleico 500 mM, pH 7,5; NaCl 750 mM; Y el tween del 0,5% (v / v) se disuelve en PBS. A~nadir solamente en un volumen de suero apropiado (5%) al preparar una nueva solución de trabajo 1x9 . </li><li> Eliminar el tampón de tinción de anticuerpos y lavar el tejido de montaje completo tres veces con tampón de lavado, con un intervalo de 10 minutos. Incubar el tejido con anticuerpos secundarios (véase la Tabla de Materiales ) más DAPI a RT durante 4 h en una plataforma oscilante o durante una noche a 4ºC. Nota: Utilizar DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol) a una concentración final de 5 μg / mL para visualizar los núcleos. </li><li> Lavar el tejido de montaje completo con tampón de lavado 3 veces durante 10 minutos cada uno. Incubar las piezas de tejido en 80% de glicerol o 80% de sacarosa durante la noche para deshidratar el tejido para una mejor preservación. </li><li> Coloque las piezas de tejido individuales en una diapositiva de vidrio y eliminar el exceso de buffer de deshidratación. Cubra el tejido con medio de montaje, coloque un cubreobjetos, y suavemente exprimir el tejido para establecerlo. </li><li> Realizar adquisición de imágenes microscópicas confocales. Para las glándulas mamarias de todo el montaje, adquirir imágenes utilizando un 40X con NA = 1.3 objetiVe Adquirir escaneos de azulejos de pilas Z con una resolución de sección óptica de 1.024 x 1.024 y una separación de capas de 1.0 - 1.2 μm. Nota: Para capturar la señal de luz de fluorescencia correcta, el divisor de haz de filtro debe ajustarse a triple dicroico (TD) 488/553/638, con el ajuste de ganancia en PMT Gain 600-800. Se utilizarán las siguientes fuentes de excitación / emisión: mGFP, con máximos de excitación / emisión de 488/509 nm; MTomato con máximos de excitación / emisión de 532/588 nm; Alexa-647, con máximos de excitación / emisión de 594/665; Y DAPI, con máximos de excitación / emisión de 350/470. </li></ol></li></ol> 4. Rastreo de linaje utilizando un modelo de ratón modificado genéticamente <ol><li> Detectar Procr + VESC usando el modelo de ratón. <ol><li> Utilice la cepa de ratones knock-in Procr CreERT2-IRES-tdTomato / + (denominada Procr CreERT2 ). Nota: En este modelo de ratón, un casete CreERT2-IRES-tdTomato <sSe inserta después del primer codón ATG de Procr 11 . <ol><li> Cross Procr CreERT2 ratones con el Rosa26 mTtomatomGFP (denominado R26 mTmG ) reportero cepa para rastrear el destino de la endógena Procr + CE in vivo [ 11] . Identifique todas las ECs endógenas de Procr + marcadas y sus descendientes usando expresión de GFP. </li></ol></li><li> Administrar la solución de tamoxifeno 11 (10 mg de tamoxifeno disuelto en 1 ml de aceite de cacahuete + etanol al 10% para formar una solución madre de 10 mg / ml) intraperitonealmente a una dosis de 4 mg / 25 g de peso corporal durante la etapa puberal Viejos) para rastrear el destino del desarrollo de las CE de Procr +. </li><li> Analizar la eficiencia de formación de clones de las células marcadas mediante inmunoticción de montaje completo después de las etapas de preparación delineadas en el paso 3. Obtener almohadillas de grasa mamaria de ratones tratados después de un corto plazo (2 días) y períodos de tiempo prolongados (hasta 10 meses). Vea la Figura 3 . </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Los ensayos de angiogénesis representan un buen enfoque experimental para estudiar la dinámica vascular. La vasculatura retiniana del ratón, que se desarrolla postnatalmente, ha demostrado ser un modelo atractivo para estudiar la angiogénesis [ 12] . A pesar de ser relativamente accesible, la manipulación real dentro del lecho vascular de la retina es bastante difícil. Hasta ahora, el trasplante in vivo mejor descrito ha sido el ensayo de tapón, que encierra células dentro de una masa de...

Durante el desarrollo y la homeostasis, el crecimiento vascular y la remodelación se llevan a cabo fielmente de acuerdo con el crecimiento y la reparación del órgano. La angiogénesis describe la generación de nuevos vasos a partir de vasos sanguíneos preexistentes y se considera una fuerza principal que media en estos cambios vasculares dinámicos. Cada vaso sanguíneo está revestido interiormente con una capa de células endoteliales (ECs), y parecen ser la base de la arquitectura de los vasos. Durante mucho tiempo, el mecanismo a través del cual se repone el pool de EC durante la homeostasis permaneció incierto, y se discutieron si la rotación vascular es el resultado de la proliferación madura de la EC o es la contribución de las actividades vasculares de la madre / progenitor. Debido a la falta de evidencia fisiológica directa, la existencia y la identidad celular de las células madre endoteliales vasculares (VESCs) también permanecieron controversiales. Uno de los métodos más comunes utilizados para verificar el comportamiento de las células madre es a través del transplanTación de células madre putativas en ratones receptores. Este método mide el potencial stemness de células madre candidatas in vivo. El trasplante se aplicó por primera vez al estudio de las células madre de la médula ósea 1 , lo que contribuyó al establecimiento de las características jerárquicas del sistema hematopoyético 2 . En el campo endotelial, un tapón de matriz de membrana basal ( por ejemplo, matrigel) insertado subcutáneamente bajo la piel de flanco ha sido un ensayo de angiogénesis in vivo estándar usado para dirigir las capacidades de formación de vasos de ECs trasplantadas. Múltiples métodos experimentales, incluyendo la formación de colonias en sistemas de cultivo 3D y el trasplante, han sugerido potencial de EC progenitor / VESC poblaciones 3 , 4 , 5 , 6 . Sin embargo, dado que las CE incrustadas en la matriz de la membrana basal están relativamente separadas deEl tejido circundante, esto no proporciona el ambiente de nicho óptimo requerido para explorar completamente el potencial angiogénico de las células trasplantadas. Como resultado, los vasos formados dentro del tapón de la matriz son predominantemente capilares y son funcionalmente no medibles. La glándula mamaria se desarrolla postnatalmente, con el crecimiento más robusto que se produce durante la pubertad y el embarazo. En la etapa puberal, el epitelio mamario experimenta una rápida expansión, para ocupar toda la almohadilla de grasa mamaria, acompañada de la remodelación eficiente de las estructuras vasculares circundantes. Así, la glándula mamaria ofrece un excelente modelo para el estudio de la angiogénesis. Proporciona espacio, matriz y estímulos angiogénicos ricos a partir del epitelio mamario en crecimiento y por lo tanto es un sitio de injerto ideal para evaluar el potencial angiogénico de células exógenas. Además, la almohadilla de grasa mamaria permite que los vasos exógenos formados se integren con el sistema de circulación del huésped, permitiendo además fY que representan una ventaja sobre el trasplante subcutáneo. Aunque los ensayos de cultivo y trasplante in vitro son una manera eficaz de investigar las propiedades de regeneración de una población celular, se sabe que tales ensayos pueden estimular la plasticidad cuando las células son retiradas de sus hábitats nativos y pueden ser inducidos cuando las células se desconectan de Su entorno fisiológico 7 . Por lo tanto, obtener la evidencia directa in vivo del destino celular es el enfoque clave para avanzar en la comprensión actual del comportamiento de las poblaciones endoteliales. El mapeo genético del destino ( es decir, el rastreo del linaje in vivo ) es imprescindible para la identificación de VESCs y para la investigación de sus propiedades en el sistema corporal, ya que puede revelar el comportamiento in vivo de las células madre en su contexto fisiológico y la stemness real puede ser juzgado. Lineage traciNg proporciona evidencia directa de la persistencia a largo plazo ( es decir, auto-renovación) de los VESC candidatos y su capacidad para producir tipos celulares para el tejido de origen ( es decir, la potencia de diferenciación). Este protocolo describe una nueva técnica de trasplante de grasa mamaria y un método de seguimiento de linaje para observar la capacidad de generación de vasos de VESCs. Estas técnicas superan las deficiencias de los ensayos disponibles actualmente y proporcionan una nueva forma de evaluar óptimamente las propiedades de las células madre de los VESC. Estos enfoques son herramientas eficientes que pueden usarse para evaluar el comportamiento y las propiedades formadoras de vasos de las poblaciones endoteliales, así como para determinar la alteración de la potencia de las células vasculares en un ambiente patológico.

<table><tbody><tr><td>0.05% Tripsina-Etileno Diamina Ácido tetraacético (EDTA) (1x)</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>25300-062</td><td>0.05% Tripsina</td></tr><tr><td>0.22 y micro; m Unidad de filtrado</td><td>Merck Millipore Ltd.</td><td>SLGP033RB</td><td>0,22 y micro; m Filtro</td></tr><tr><td>2-Metilbutanol-2, ReactivoPlus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24, 048-6</td><td>Tert Alcohol Amílico</td></tr><tr><td>222, Tribrometanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402-25g</td><td>222, Tribrometanol</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>70 &micro; m Filtro de celdas</td><td>BD FAL</td><td>352350</td><td>70 &micro; m Filtro de células</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio de adhesión</td><td>CITOGLAS 188105</td><td></td><td>Portaobjetos de vidrio</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD105 APC</td><td>eBioscience</td><td>17-1051-82, clon MJ7/18</td><td>para uso de analusis FACS en 1 y micro; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD201 Biotina</td><td>eBioscience</td><td>13-2012-82</td><td>para el uso de analusis FACS en 2.5 y micro; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD31 PE-Cyanina 7</td><td>eBioscience</td><td>25-0311-82, clon 390</td><td>para uso de analusis FACS en 1 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>BD FACSJazz Clasificador de células</td><td>BD Biosciences</td><td>655489</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma</td><td>100190332</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa tipo 3</td><td>Worthington-Biochem</td><td>#LS004183</td><td>Colagenasa III</td></tr><tr><td>Microscopía confocal</td><td>Leica</td><td>sp8</td><td>Confocal</td></tr><tr><td>Desoxirribonucleasa I del páncreas bovino</td><td>Sigma</td><td>D2463-5VL</td><td>Dnase I</td></tr><tr><td>Burro anti-Rata Cy3</td><td>Jackson ImmunResearch</td><td>712-165-150</td><td>Anticuerpo secundario, uso a 0,5 y micro; g/mL</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont</td><td>WPI 500342</td><td></td><td>Froceps</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont - Puntas Micro-Romanas FST</td><td></td><td>11253-20</td><td>Pinzas</td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td>FBS</td></tr><tr><td>FITC Ms CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119</td><td>BioLegend</td><td>78022</td><td>Cóctel de linaje sanguíneo para análisis FACS, uso a 25 y micro; L por prueba</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G6279</td><td>Glicerol</td></tr><tr><td>Iscov's Modificado Medio de Dulbecco</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>12440-053</td><td>IMDM</td></tr><tr><td>Isolectina GS-IB4 de Griffonia Simplicifolia, Alexa Fluora&nbsp; 647</td><td>Invitrogen</td><td>Z32450</td><td>Isolectina-647</td></tr><tr><td>Matrigel&nbsp; Matriz (factor de crecimiento reducido)</td><td>BD</td><td>356231</td><td>Matrigel</td></tr><tr><td>Cepa de ratón (Actina-GFP)</td><td>Jax Laboratories</td><td>3773</td><td>Actina-GFP</td></tr><tr><td>Cepa de ratón (C57BL/6)</td><td>SLAC</td><td>C57BL/6</td><td>C57BL/6</td></tr><tr><td>Cepa de ratón&nbsp; (BALB/c desnudo)</td><td>SLAC</td><td>BALB/c desnudo</td><td>Ratones desnudos</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>PFA</td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>5140-122</td><td>Pluma/Fosfato estreptocócico</td></tr><tr><td>solución salina tamponada (pH7.2) 1x</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>c20012500BT</td><td>PBS</td></tr><tr><td>PRIM1640</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>c11875500CP</td><td>PRIM1640</td></tr><tr><td>Reactivo antidecoloración ProLong Gold</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td>Medio de montaje</td></tr><tr><td>Rat anti CD144</td><td>BD Biosciences</td><td>550548</td><td>para análisis de montaje completo, anti-VE-Cadherin / Cdh5 antibdy para unión estrecha endotelial, uso a 2.5 y micro; g/mL</td></tr><tr><td>Rata anti CD31-biotina</td><td>BD Biosciences</td><td>553371</td><td>para analusis de montaje entero, anticuerpo anti-CD31/PECAM1 para molécula de adhesión de la superficie endotelial, uso en 10 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>Tampón de lisis de glóbulos rojos</td><td>Sigma</td><td>R7767-100ML</td><td>Tampón de lisado de glóbulos rojos</td></tr><tr><td>Recto/Afilado-Romo/10cm</td><td>FST</td><td>14028-10</td><td>Tijeras finas</td></tr><tr><td>Estreptavidina eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-4317-82</td><td>para uso en análisis FACS a 0,5 y micro; g/mL</td></tr><tr><td>Tamoxifeno</td><td>Sigma 101551374</td><td></td><td>TAM</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-250ML</td><td>TritonX</td></tr><tr><td>Seda Trenzada Recubierta de Cera (Tamaño 5-0 USP (1 Métrico), 18 pulgadas (45 cm) NEGRO en Aguja C-1)</td><td>Sutura COVIDIEN</td><td>S1173</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Escápulos desechables estériles</td><td>Swann Morton</td><td>#10</td><td>Bisturí</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Yifeng Medical</td><td>20160101</td><td>solución antiséptica</td></tr></tbody></table>

una nueva técnica de trasplante de grasa mamaria para visualizar la generación de vasos de células madre endoteliales vasculares

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Las células endoteliales son los bloques fundamentales de la arquitectura vascular y median el crecimiento vascular y la remodelación para asegurar el desarrollo adecuado de los vasos y la homeostasis. Sin embargo, los estudios sobre la jerarquía del linaje endotelial siguen siendo esquivos debido a la falta de herramientas para obtener acceso, así como para evaluar directamente su comportamiento in vivo . Para abordar esta deficiencia, se ha desarrollado un nuevo modelo de tejido para estudiar la angiogénesis utilizando la almohadilla de grasa mamaria. La glándula mamaria se desarrolla principalmente en las etapas posnatales, incluyendo la pubertad y el embarazo, durante los cuales la proliferación robusta del epitelio se acompaña de un extenso remodelado vascular. Las almohadillas de grasa mamaria proporcionan espacio, matriz y estímulos angiogénicos ricos a partir del epitelio mamario en crecimiento. Además, las almohadillas de grasa mamaria están situadas fuera de la cavidad peritoneal, haciéndolas un sitio de injerto fácilmente accesible para evaluar el potencial angiogénico de las células exógenas. Este trabajo también describe unaNt utilizando ratones reporteros fluorescentes para etiquetar específicamente la población diana de células madre endoteliales vasculares (VESCs) in vivo . Este método de rastreo de linaje, junto con la posterior microscopía de montaje completo de tejidos, permite la visualización directa de células diana y sus descendientes, a través de los cuales se puede cuantificar la capacidad de proliferación y el compromiso de diferenciación puede ser asignado al destino. Usando estos métodos, recientemente se ha identificado una población de receptor B bipotente (Procr) que expresa VESCs en múltiples sistemas vasculares. Procr + VESCs, que dan lugar tanto a nuevas CE como a pericitos, contribuyen activamente a la angiogénesis durante el desarrollo, la homeostasis y la reparación de lesiones. En general, este manuscrito describe un nuevo trasplante de almohadillas de grasa mamaria y técnicas de rastreo de linaje in vivo que pueden usarse para evaluar las propiedades de células madre de VESCs.

Mamario VESCs Aislamiento: Para aislar la población endotelial para el ensayo de trasplante consecuente, las glandulas mamarias maduras (de 8 semanas de edad) fueron cosechadas como material donante. Las células endoteliales se aislaron usando una técnica de clasificación de células basada en anticuerpos. Gráficos representativos de la FACS análisis de la población VESC en 8 semanas de edad C57BL / 6 glándulas mamarias ECs se mue...

Este trabajo demuestra un nuevo enfoque para evaluar la proliferación, la diferenciación y el potencial de formación de vasos de células madre endoteliales vasculares (VESCs) a través de trasplante de almohadillas de grasa mamaria seguido de preparación de tejido de montaje completo para la observación microscópica. También se presenta una estrategia de seguimiento de linaje para investigar el comportamiento de VESCs in vivo .

Una nueva técnica de trasplante de grasa mamaria para visualizar la generación de vasos de células madre endoteliales vasculares

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

El objetivo general de este experimento es evaluar el potencial de proliferación, diferenciación y formación de vasos de las células madre endoteliales vasculares mediante una técnica de trasplante en la almohadilla de grasa mamaria, seguida de la preparación de tejido en montaje completo para la observación microscópica. Este método proporciona una nueva forma de evaluar óptimamente las propiedades de células madre de las células madre endoteliales vasculares in vivo. La principal ventaja de esta técnica es que durante la pubertad, la glándula mamaria ofrece un entorno angiogénico ideal para la generación y la integración de vasos recién formados.Esto permite la evaluación funcional de células endoteliales trasplantadas. Las implicaciones de esta técnica no se limitan a la evaluación de la función endotelial, sino que pueden extenderse a la evaluación del efecto de factores angiogénicos sobre el remodelado vascular localizado.Estas aproximaciones son herramientas eficientes que pueden aplicarse a múltiples disciplinas, incluyendo estudios de la población de endotelio en el entorno tumoral y de alteraciones en la potencia celular. Quien demostrará el procedimiento será Wenqian Song, una estudiante de posgrado de nuestro laboratorio. Después de preparar el medio basado en digestión de tejido y sacrificar ratones virgenes maduros de ocho semanas de edad con el reportero Actin-GFP según el protocolo descrito, use un escalpelo para diseccionar el cuarto par de glándulas mamarias inguinales realizando primero una incisión cutánea vertical en la línea media abdominal inferior.Pese el tejido picado y colóquelo en un tubo de 50 mililitros. Para preparar el tampón de digestión, agregue 300 unidades de colagenasa tipo tres por cada 10 mililitros de medio de digestión. Mezcle uniformemente y añádalo al tejido picado.Horizontalmente, coloque el tubo de centrífuga de 50 mililitros sobre una plataforma oscilante y ajuste la velocidad a 100 rpm y la temperatura a 37 grados Celsius. Agite el tejido mamario durante dos horas. Después de la digestión, complete el tubo de centrífuga de 50 mililitros con PBS estéril precalentado e invierta el tubo para mezclar uniformemente.Luego, centrifugue el tubo a 200 veces g durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y golpee suavemente el fondo del tubo para desagregar el sedimento celular. A continuación, agregue tres mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos e incube el tubo a temperatura ambiente durante cinco minutos para eliminar los glóbulos rojos.Añada 10 mililitros de PBS estéril e invierta el tubo para mezclar uniformemente. Luego, después de centrifugar el tejido y descartar el sobrenadante, añada tres mililitros de tripsina al 0,05 % precalentada e incube el tubo a 37 grados Celsius durante cinco minutos para digerir aún más el tejido restante. A continuación, añada tres mililitros de IMDM precalentado y luego añada 100 microlitros de solución de DNasa I.Incube el tubo a 37 grados Celsius para descomponer los filamentos de ADN. Luego pase la mezcla de tejido a través de un filtro celular de 70 micrones para obtener la solución celular. Utilice dos mililitros de PBS más 5 %FBS para enjuagar el filtro dos veces y neutralizar la digestión enzimática.Centrifugar la mezcla celular a 200 veces g durante cinco minutos. Desechar el sobrenadante y resuspender el botón celular en un mililitro de PBS con 5 %FBS para la tinción con anticuerpos. Después de la tinción con anticuerpos, completar el volumen de las células con PBS con 5 %FBS y luego centrifugar la muestra a 200 veces g durante cinco minutos.Luego, tras desechar el sobrenadante, use un mililitro de PBS más 5 %FBS para resuspender las células. Filtre la suspensión a través de un filtro celular de 40 micrones. A continuación, realice la clasificación basada en FACS para aislar las células madre endoteliales vasculares positivas para el receptor de proteína C según el protocolo descrito en el texto.Complete las células clasificadas por FASC con 10 mililitros de PBS más 5 %FBS y luego centrifugue las muestras a 200 × g durante cinco minutos para sedimentar las células en el fondo del tubo. Después de aspirar cuidadosamente el líquido, utilice un hemocitómetro para contar el número de células y re suspenda el sedimento celular con una mezcla de matriz de membrana basal hasta alcanzar 15 000 células por 15 microlitros. Diluya seriamente las células clasificadas y contadas para alcanzar las concentraciones requeridas en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros, asegurándose de que los volúmenes finales de inyección no excedan los 15 microlitros.Luego, agregue azul de tripan al 0,1 % a cada tubo para una mejor visualización del contenido durante el trasplante. Pipetee cuidadosamente para mezclar y mantenga los tubos en hielo hasta su uso. Para trasplantar células endoteliales primarias o CE en la almohadilla de grasa mamaria, coloque a cada ratón en posición supina con su espalda sobre la mesa de operaciones.Luego, utilice cinta adhesiva para inmovilizar las extremidades. Sumerja un hisopo de algodón en una solución antiséptica a base de yodo. Limpie cuidadosamente toda el área abdominal del ratón para esterilizar la superficie de la piel antes de la cirugía.A continuación, use pinzas para sostener y levantar la piel del abdomen del ratón. Luego, con un escalpelo quirúrgico, realice una pequeña incisión vertical de un centímetro. Haga dos cortes de aproximadamente 0,5 a un centímetro de longitud cada uno en dirección hacia la pata trasera para obtener una incisión en forma de Y invertida.Utilice pinzas y un hisopo de algodón para separar suavemente la piel del abdomen y sujete la piel hacia los lados para exponer las glándulas mamarias inguinales. Luego, coloque el ratón bajo un estereoscopio y ajuste el aumento a 2X. Coloque una aguja de calibre 27 de 1/2 pulgada sobre hielo para preenfriarla.Después de cebear la jeringa, pipetee 15 microlitros de solución de matriz de membrana basal sobre la tapa del tubo de microcentrifugado y luego aspire todo el volumen hacia la jeringa cebada. Para asegurar la inyección completa del contenido celular, verifique que no quede aire atrapado en la aguja después del cebado y de la toma de las células. Utilizando pinzas finas, sostenga la almohadilla grasa mamaria frente al ganglio linfático inguinal y levántela ligeramente para facilitar la inyección.Luego, inserte suavemente aproximadamente 1/4 de la aguja de la jeringa en el pabellón adiposo. Suelte la pinza del pabellón adiposo para agarrar y estabilizar la aguja de la jeringa. Inyecte lentamente la solución para prevenir fugas de líquido.Luego, mantenga la aguja en su lugar durante unos segundos para asegurarse de que la mezcla celular se solidifique y así minimizar las fugas al retirar la aguja. Utilice suturas absorbibles de tripa 5-0 para cerrar y coser el colgajo de piel y cierre las heridas con nudos al estilo quirúrgico, colocando cada nudo aproximadamente a 0,3 centímetros de distancia. Para obtener el tejido, marque la circulación sistémica del receptor mediante una inyección en la vena de la cola con el colorante Isolectin 647 en PBS.Permita un período de reposo de cinco a diez minutos. Después de sacrificar los ratones según el protocolo descrito, utilice tijeras quirúrgicas para diseccionar la zona del tejido mamario donde se inyectaron inicialmente las células. En una placa de Petri de seis centímetros, use una hoja quirúrgica para cortar el tejido en cubos de aproximadamente tres a cuatro milímetros cúbicos.Luego, para digerir los fragmentos de tejido, transfiéralos a un tubo de 15 mililitros lleno con 10 mililitros de medio de digestión precalentado suplementado con colagenasa tres. Coloque el tubo de centrífuga de 15 mililitros horizontalmente sobre una plataforma oscilante a 100 rpm y 37 grados Celsius durante aproximadamente una hora para aflojar la estructura del tejido y eliminar el tejido adipocitario en exceso. A continuación, use PBS para lavar el tejido a temperatura ambiente durante 10 minutos.Luego, para preservar la fluorescencia, fije el tejido en montaje completo colocando cuidadosamente los fragmentos en una placa de Petri de seis centímetros semillena con PFA al 4%. Coloque la placa de Petri sobre una plataforma oscilante y agite suavemente el tejido durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar el tejido e incubarlo en el anticuerpo primario diluido según el protocolo descrito en el texto, retire el tinte y use tampón de lavado para lavar el tejido tres veces durante 10 minutos cada una.Luego, incube el tejido con el anticuerpo secundario más DAPI a temperatura ambiente durante cuatro horas en una plataforma agitadora o durante la noche a cuatro grados Celsius. Después de lavar la muestra según el protocolo descrito en el texto, transfiera el tejido a glicerol al 80 % o a sacarosa al 80 % durante la noche para deshidratarlo y lograr una mejor conservación. Monte el tejido y realice microscopía confocal según el protocolo descrito en el texto.Aquí se muestra un resultado representativo del aislamiento celular mediante FACS. Se excluyeron las linajes sanguíneos y se utilizaron células CD31 positivas y CD105 positivas para definir las células endoteliales, seguido del enriquecimiento de células madre endoteliales positivas para el receptor de proteína C. Esta imagen de microscopía confocal representa el colchón de grasa mamaria del receptor en el sitio de trasplante.Los vasos sanguíneos formados a partir de células endoteliales positivas para el receptor de proteína C trasplantadas se han integrado y han contribuido a la vasculatura mamaria del hospedador. En esta figura se muestra la vasculatura mamaria del receptor. La inyección intravenosa de isolectina en ratones receptores reveló que las células endoteliales positivas para el receptor de proteína C formaron vasos funcionales con luz definida.Una vez dominado, el procedimiento de trasplante puede realizarse en menos de cinco minutos si se lleva a cabo correctamente. Al intentar el procedimiento, es importante que recuerde monitorear cuidadosamente a los animales receptores después de la cirugía. Se deben proporcionar procedimientos de cuidado adecuados si se observan signos de estrés o infección.Tras seguir el procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el rastreo de linaje celular para examinar el comportamiento de células diana durante diversos procesos biológicos in vivo. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología vascular exploraran el potencial de subpoblaciones del endotelio en condiciones fisiológicas y patológicas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar el trasplante de la almohadilla de grasa mamaria y la preparación de tejidos en montaje completo para investigar la capacidad de formación de vasos de poblaciones endoteliales y también para evaluar la funcionalidad de los vasos formados.

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Una nueva técnica de trasplante de grasa mamaria para visualizar la generación de vasos de células madre endoteliales vasculares (Video) | JoVE Journal

Una nueva técnica de trasplante de grasa mamaria para visualizar la generación de vasos de células madre endoteliales vasculares

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