Desarrollo de cuerpos embrionarios libres de suero derivados de HiPSC para la interrogación de cultivos de células madre tridimensionales usando ensayos fisiológicamente relevantes

El objetivo general de este protocolo para los cuerpos embrioides libres de suero iPSC humano en 3D es proporcionar un sistema in vitro que se aproxime al desarrollo cortical temprano humano, que pueda utilizarse para el descubrimiento de fármacos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las células madre, como por ejemplo, cómo las neuronas derivan de las iPSC y forman redes funcionales en el tejido 3D. La principal ventaja de esta técnica es que nos permite modelar aspectos del desarrollo cortical en una placa, a partir de tejido humano que contiene la genética de individuos enfermos, por lo que el sistema sirve como una plataforma basada en células para el cribado de fármacos que es escalable y se puede utilizar para estudiar muchos trastornos neurobiológicos diferentes.

Aunque este método puede proporcionar información sobre los trastornos neurobiológicos o del desarrollo neurológico, también se puede aplicar a otros sistemas, como los que se centran en modelos de función neuroinmune o información neuronal. Para este protocolo, comience con el establecimiento de células fetales. Para establecer este cultivo, coloque 600.000 células fetales en cada pocillo de una placa de seis pocillos, con 300 mililitros de medio por pocillo.

Después de cultivar las células fetales durante 48 horas, reemplace el medio. Incubar las placas durante una hora, mientras se preparan las células madre. Descongele las células madre en un baño de agua a 37 grados centígrados.

Una vez descongeladas, transfiera las células a un tubo cónico de 15 mililitros y llene el tubo hasta cinco mililitros con medio de cultivo, agregado gota a gota. A continuación, centrifugar suavemente las células durante cuatro minutos, aspirar el sobrenadante y volver a suspender suavemente el pellet en un mililitro de medio de células madre con inhibidor de ROCK. Después de cuantificar la densidad celular, coloque 300.000 células madre en las células alimentadoras.

A continuación, cultive y expanda los cultivos, seleccionando periódicamente las células sanas, después de la expansión y congelando las células para su respaldo. Cultive las colonias de células madre en placas estándar hasta que alcancen un 50% a 70% de confluencia. A continuación, utilice un tratamiento enzimático suave y una trituración suave con la punta de pipeta de un mililitro para recolectar las hiPSC para la diferenciación de células neuroprecursoras.

Centrifugar suavemente la suspensión, aspirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en medio iPSC humano de cinco mililitros. Luego, transfiera la suspensión celular a una placa de cultivo celular de cinco centímetros recubierta de gelatina al 0,1% e incube la placa durante una hora. Después de una hora, transfiera las células no adherentes a un tubo de centrífuga de 15 mililitros.

A continuación, enjuague suavemente la placa con tres mililitros de medio y transfiérala al mismo tubo. A continuación, repita el paso de resuspensión con centrifugación suave, luego, determine la densidad de celdas y coloque las celdas en una placa inferior en V de baja adherencia de 96 pocillos a 9,000 celdas por pocillo. Ahora, gira el plato durante tres minutos y comienza a cultivar las células.

Durante los próximos 14 días, cada dos días, reemplace la mitad de un medio con uno nuevo y diferenciador. Después de dos semanas de cultivo de las células, prepare placas de seis pocillos con insertos de cultivo celular de 40 micras y un mililitro de medio DM1. Incube estas placas durante al menos cuatro horas antes de agregar las células cultivadas.

A continuación, utilizando una punta de pipeta de boca ancha de 200 microlitros, recoja agregados celulares de dos semanas de antigüedad con un valor aproximado de 20 microlitros de medio. Transfiera de cuatro a seis agregados a cada inserto con una solución mínima, elimine cualquier exceso. Durante este paso, es importante trabajar rápidamente y con mano firme, mientras se retira el medio alrededor de los SFEB, es posible que vea que los SFEB se mueven a través de la solución debido a la tensión superficial.

Está bien reposicionarlos después de quitar el medio. Una vez que todos los agregados estén cargados en los insertos, cambie el medio a un mililitro de DM2 y continúe cultivando las celdas cada dos días. Reemplace tres cuartas partes del medio con medio nuevo.

Después de 14 días de cultivo, comience a agregar el medio DM3 a los cultivos. Continúe el cultivo durante 16 días más para cultivar los SFEB. A continuación, separe suavemente los SFEB del inserto, utilizando una punta de pipeta de boca ancha de 200 microlitros.

Transfiera los SFEB a placas de 12 pocillos, cargando de cuatro a ocho por pocillo. Luego, tíñelos como contorno en el protocolo de texto. Para preparar los 12 pozos y los ocho platos, primero lávelos tres veces con agua estéril.

Luego, lávelos una vez con etanol al 75% y una vez más con etanol al 100%. Luego, hornee las placas a 50 grados centígrados durante cuatro o cinco horas boca abajo, para completar el proceso de esterilización. Después de hornear, agregue 500 microlitros de solución de PEI al 0,2% a cada pocillo y deje reposar el plato a temperatura ambiente durante una hora.

A continuación, aspire el PEI y lave los pocillos cuatro veces con el agua destilada estéril y séquelos al aire durante la noche. Al día siguiente, prepare laminante fresco en medio L15 y agregue 10 microlitros al centro de cada pocillo. Luego, agregue agua destilada a los depósitos circundantes para evitar la evaporación e incube la placa durante una hora a 37 grados centígrados.

Asegúrese de hacer girar el laminante en el centro de los electrodos, teniendo cuidado de no exceder el espacio de los electrodos de conexión a tierra, si se excede este espacio, las neuronas crecerán sobre los electrodos de conexión a tierra, causando artefactos de ruido y afectando la fidelidad de la grabación. Ahora, agregue un SFEB preparado en cada pocillo, usando una succión suave con una pipeta de diámetro ancho. Luego, agregue 200 microlitros de DM2 a cada pocillo y cultive la placa durante la noche.

Más tarde, para registrar la actividad neuronal, coloque una placa en el lector de placas. Precaliéntalo a 37 grados centígrados. A continuación, utilice el software para registrar 10 minutos de actividad de cada pozo.

El cultivo de SFEB utiliza el método descrito, produciendo tejido con características morfológicas que se asemejan a una zona subventricular cortical de desarrollo temprano repleta de neuronas Tuj1 positivas extensas, así como neuroprogenitores. Se observaron numerosas rosetas corticales en desarrollo en las capas externas y en las capas internas de los cuerpos. El borde exterior de los cuerpos se asemeja a una placa cortical en desarrollo que contiene neuronas postmitóticas, esto está respaldado por la expresión de Brn2, un marcador de neuro progenitores y las capas corticales externas más ventralizadas.

Las capas externas también contienen células Reelin positivas que pueden ser células gratzel casuales o sus progenitores. Los cuerpos también expresaron marcadores consistentes con el origen mixto de los inmenantes codales y ganglionares mediales. Basado en la expresión de los marcadores TF2 y Nkx2.1 cocidos.

Los SFEBs cultivados producen interneuronas positivas tanto en CalR como en CalB. Así como, neuronas excitadoras VGLUT positivas y progenitores neurales glutamatérgicos Tbr1 positivos. De acuerdo con otros informes, el 61% de las células de los cuerpos eran positivas para VGLUT y el 43% eran positivas para Tbr1.

Las grabaciones MEM realizadas desde los cuerpos, se pueden tomar durante largos períodos de tiempo y las grabaciones mostraron el desarrollo de la ruptura del nivel de la red cortical. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo cultivar SFEB a partir de iPSC humanas, caracterizar el contenido de neurula de las rosetas corticales punitivas en desarrollo con NSFEB. y realizar ensayos neurofisiológicos en SFEBs en maduración.

En general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades porque se necesita tiempo y práctica para desarrollar el campo científico necesario para el comportamiento de las iPSC y la iPSC para llegar a las neuronas en cultivo. Las células cultivadas deben ser monitoreadas diariamente. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como las imágenes de calcio, para responder preguntas adicionales, como por ejemplo, qué podrían hacer los tratamientos farmacológicos a las oscilaciones de la red cortical.