Predicción de la silenciación génica a través del control espaciotemporal de la liberación de siRNA de Nanocarriers poliméricos fotosensibles

El objetivo general de estos métodos es no poder predecir las eficiencias de silenciamiento génico mediado por ARN interferente pequeño y facilitar el control sobre los niveles de expresión de proteínas resultantes, de una manera espacial y temporal. Este método puede dilucidar la estructura, la función, las relaciones y los estímulos, los vehículos de entrega que responden. Obtener un mejor control sobre la unión frente a la liberación puede desbloquear plataformas traducibles y descubrimiento de fármacos, así como tecnologías de medicina regenerativa.

Las principales ventajas de esta técnica son que los cambios en la expresión génica se pueden controlar y predecir sobre la base de un simple análisis de liberación de siRNA y modelado cinético. Aunque estos métodos emplean nuevos polímeros fotosensibles, este conjunto de ensayos se puede adaptar fácilmente para probar la amplia variedad de otros sistemas que responden a estímulos. Para comenzar, prepare una solución de siRNA de 32 microgramos por mililitro, agregando siRNA a una solución HEPES de 20 micromolares a pH seis.

A continuación, prepare una solución polimérica añadiendo polímeros polyAPN BMA en bloque mPEG disueltos a una solución HEPES de 20 milimolares a pH seis. Para lograr una concentración de 220 microgramos por mililitro, esta concentración dará como resultado una relación N a P de cuatro, lo que significa que habrá cuatro veces más grupos amina en el polímero que grupos fosfato en el siRNA. A continuación, agregue la solución de polímero gota a gota a un volumen igual de la solución de siRNA, mientras mezcla suavemente en una máquina de vórtice.

Continúe en vórtice durante 30 segundos después de la adición del polímero. A continuación, incube las muestras en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos. Agregue la solución STS a cada solución de nanoportadores gota a gota mientras mezcla suavemente en una máquina de vórtice.

Continúe en vórtice durante 30 segundos después de la edición de SDS. Centrifugar las muestras a 3.000 g durante cinco segundos, luego incubar las muestras en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos. Calibre y ajuste un láser UV con un filtro de 365 nanómetros a una intensidad de 200 vatios por metro cuadrado.

A continuación, corte un agujero en una junta de goma, coloque la junta de goma en un portaobjetos de vidrio lavado y seco. Pipetee la solución SDS de nanoportadores en el portaobjetos de vidrio dentro del orificio de la junta de goma. Cargue un exceso de solución en el portaobjetos de vidrio, evitando el contacto con la junta de goma.

Coloque la segunda corredera de vidrio encima de la junta de la corredera. Para evitar la generación de burbujas de aire, coloque primero un extremo de la corredera hacia abajo y luego, baje lentamente el otro extremo. Coloque clips de carpeta a cada lado de la cámara de vidrio para mantenerla cerca.

Irradiar las muestras durante el período de tiempo deseado, utilizando el láser UV con el filtro de 365 nanómetros a una intensidad de 200 vatios por metro cuadrado. Retire los clips de la carpeta y abra la cámara. A continuación, pipetee 25 microlitros de las muestras SDS de nanoportadores irradiadas en tubos de microcentrífuga.

Incubar las soluciones en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos. Agregue cinco microlitros de la solución tampón de carga a 25 microlitros de cada muestra de SDS de nanoportadores. Incubar las muestras en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10 minutos.

A continuación, cargue 30 microlitros de cada muestra de SDS de nanoportadores en un gel de agarosa al 2%, previamente teñido con bromuro de etidio. Deje correr el gel en la oscuridad a 100 voltios durante 30 minutos. Obtenga una imagen del gel, utilizando un sistema de imágenes en gel con filtros de bromuro de etidio.

Guarde los archivos de imagen de gel y proceda a la cuantificación de la intensidad de flexión como se describe en el protocolo de texto. Retire los trozos de papel de un espaciador adhesivo de doble cara para exponer la superficie adhesiva. Coloque el espaciador en un cubreobjetos de vidrio.

Pipetee la solución SDS de nanoportadores en el cubreobjetos. Luego, coloque un portaobjetos de vidrio prelavado en la parte superior del cubreobjetos con el orificio del espaciador adhesivo, centrado alrededor de la muestra. Empuje el portaobjetos de vidrio para asegurarse de que el portaobjetos de vidrio y el portaobjetos de la cubierta estén bien adheridos y formen un sello.

Utilice un microscopio confocal con un objetivo apercromal sumergido en agua 40 veces, con una apertura numérica de 1,2 para las mediciones de FCS. Utilice el canal láser de excitación adecuado para recopilar al menos 30 mediciones de 10 segundos cada una, por muestra. A continuación, introduzca los datos de liberación de siRNA de FCS en un modelo cinético para predecir las respuestas de silenciamiento génico, como se detalla en el protocolo de texto.

Para preparar la administración de siRNA in vitro, primero agregue dos mililitros de suspensión celular a cada pocillo de la placa de seis pocillos. Deje que las células se adhieran y se recuperen durante 24 horas en la incubadora. Después de lavar las células con solución salina tamponada con fosfato, prepárelas para la transvección agregando 1,5 mililitros de suero y medio de transvección libre de antibióticos.

A continuación, agregue 25 microlitros de solución de nanoportadores, que contenga 30 picomoles de siRNA tp cada pocillo. Pipetea suavemente el medio hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Coloque las células en la incubadora durante tres horas.

Retire el medio de transvección y lave cada pocillo con PBS. Luego, agregue un mililitro de medio de crecimiento suplementado y coloque las células en la incubadora para que se recuperen durante 30 minutos. Para preparar las células para el tratamiento con un fotoestímulo, retire el medio de crecimiento suplementado.

Luego, agregue un mililitro de medio de transvección a cada pocillo. Después de calibrar el láser UV como se describe en el protocolo de texto, coloque las celdas en una placa caliente configurada a 37 grados centígrados. Retire la tapa de la placa de seis pocillos.

Irradiar las células desde arriba de la placa durante el tiempo deseado, utilizando el láser UV con un filtro de 365 nanómetros a una intensidad de 200 vatios por metro cuadrado. Retire el medio de transvección y agregue dos mililitros de medio de crecimiento suplementado. Coloque las células en la incubadora hasta su posterior análisis.

Para preparar una máscara fotográfica que bloquee completamente la luz de 365 nanómetros y minimice los reflejos, primero corte, perfore y/o mecanize la forma deseada en la máscara fotográfica. Pegue la máscara fotográfica a la parte inferior de la placa de seis pocillos, con el patrón centrado en el pocillo que contiene las celdas y el lado antirreflectante hacia la placa. Coloque dos soportes de anillo aproximadamente a 25 metros de distancia y separe una plataforma a cada soporte de anillo, de modo que las plataformas tengan la misma altura.

Suspenda la placa de la celda entre los dos soportes apoyando la placa en la parte superior de las plataformas. Irradiar las células desde debajo de la muestra durante el tiempo deseado, utilizando un láser UV con un filtro de 365 nanómetros, a una intensidad de 200 vatios por metro cuadrado. Retire el medio de transvección y agregue dos mililitros de medio de crecimiento suplementado.

Luego, coloque las células en la incubadora para que se recuperen durante al menos 24 horas. Obtenga imágenes de las células utilizando microscopía de fluorescencia como se describió anteriormente. Aquí se muestra un ejemplo de modelado cinético simple de la dinámica de silenciamiento de genes.

El modelo se ejecutó para predecir las concentraciones de ARNm, proteínas y ARNsi, en función del tiempo después de la liberación de siRNA fotoinducida. Las cantidades relativas de siRNA liberadas después de diferentes dosis de luz, se introdujeron como la concentración inicial de siRNA en el modelo cinético. Las predicciones del modelo resultante para los niveles de expresión de proteínas concordaron con los niveles de expresión determinados experimentalmente obtenidos a través de Western blot.

Para la visualización, las células que expresan GFP se trataron con siRNA dirigido a GFP y se colocó una fotomáscara anular en la placa antes de la irradiación para generar un patrón circular. Las células que se protegieron de la luz exhibieron una intensidad de fluorescencia que era indistinguible de las muestras de control no tratadas con siRNA y luz. Sin embargo, casi todas las células dentro del patrón circular no mostraron expresión de GFP, lo que indica una liberación eficiente de siRNA y eliminación de genes.

Además, el uso de la luz es un desencadenante de la expresión génica, que se puede controlar en escalas de longitud celular. En resumen, este método permite la determinación rápida de las condiciones de irradiación para controlar espacio-temporalmente la liberación de siRNA y predecir el silenciamiento génico a priori. El empleo de este protocolo ayudará a dilucidar las relaciones entre la estructura y la función que rigen la estabilidad y la eficacia de los nanoportadores.

Esta técnica puede permitir aplicaciones en medicina regenerativa que requieren control espacio-temporal sobre la expresión génica. Estas formulaciones también son muy adecuadas para el tratamiento de trastornos localizados como el cáncer de piel, así como trastornos dermatológicos.