Preparación a mediano plazo de Drosophila Extractos de embriones para experimentos proteómicos

El objetivo general de este experimento es proporcionar un enfoque sencillo y económico para recolectar embriones de drosófila a mediana escala. Y la preparación de extractos de proteínas que se pueden utilizar en aplicaciones proteómicas posteriores, como la espectrometría de masas de purificación por afinidad. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la señalización celular y la biología del desarrollo.

Por ejemplo, cómo las interacciones específicas de proteínas llevan a cabo la comunicación celular durante el desarrollo del organismo. La principal ventaja de esta técnica, es que es un método fácil y económico para generar una lisis de embriones de Drosophila. Que se puede utilizar para aplicaciones posteriores como la purificación por afinidad de proteínas.

Tradicionalmente, los investigadores recolectaban embriones de Drosophila en jaulas de población muy grandes. Pero presentamos un procedimiento fácil de usar para recolectar embriones en jaulas de tamaño mediano que se pueden configurar fácilmente en cualquier laboratorio. Después de preparar recipientes de cinco litros y cortar cuadrados de malla de nailon de 25 por 25 centímetros, de acuerdo con el protocolo de texto, coloque la malla sobre el recipiente y presione hacia abajo con la tapa.

Asegúrese de que la malla esté apretada y que la tapa no esté inclinada. La jaula ya está lista para ser poblada de moscas. Después de la preparación de frascos de plástico de un litro y cuadrados de malla de nailon de 18 por 18 centímetros, coloque la malla sobre el borde superior del frasco y enrosque la tapa para apretar.

Asegúrese de que la malla esté apretada y que la tapa no esté inclinada. Amplificar las líneas de mosca transgénicas portadoras de la proteína tipificada de interés. Y transfiera las botellas cada dos días hasta que se acumulen de 25 a 30 botellas por cada línea de mosca.

Amplifique un stock de control de manera similar. A continuación, caliente los platos de jugo de manzana a temperatura ambiente. Luego, con un dedo enguantado, esparce un poco de pasta de levadura húmeda en el centro de los platos.

Haciendo un círculo de aproximadamente seis centímetros para un plato de 15 centímetros. Y un círculo de cuatro centímetros para un plato de 10 centímetros. Después de anestesiar a las moscas y transferirlas a las jaulas preparadas con la malla hacia abajo, cubra las jaulas con platos de jugo de manzana.

Deja que las moscas se despierten. A continuación, dale la vuelta a las jaulas e incuba las moscas a temperatura ambiente durante dos o tres días. Cambie las placas dos veces al día, volteando la jaula boca abajo y, mientras sostiene la placa en la jaula, retire la cinta de la placa.

Golpee suavemente toda la jaula en el banco y cambie rápidamente el plato viejo por uno nuevo, tratando de no permitir que las moscas escapen. Permita que las moscas pongan embriones en platos de jugo de manzana fresco durante la noche o durante cualquier otro período de tiempo deseado. A la mañana siguiente, marque y pese los contenedores de malla para la recolección de embriones.

Uno para cada línea de mosca utilizada. Prepare 1x tampón de lisis en un tubo de 50 mililitros utilizando reactivos previamente fabricados, añadiendo 40 mililitros de agua a 10 mililitros de tampón de lisis concentrado 5x en un tubo de 50 mililitros. Añadir 50 microlitros de un molar de DTT a una concentración final de un mili molar.

Mezclar bien y dividir la solución entre dos tubos de 50 mililitros. A uno de los tubos agregue una tableta inhibidora de la proteasa. Y coloque el tubo en un rotador a cuatro grados centígrados durante 30 minutos.

Mientras la tableta se disuelve, comience a recolectar los embriones marcando las placas de jugo de manzana en las jaulas, con los genotipos de las líneas de mosca utilizadas. Y cambia los platos por otros frescos. Agregue suficiente agua para cubrir cada plato de jugo de manzana.

Luego, con un pincel suave, desaloje suavemente los embriones de la placa. Vierte los embriones en el recipiente de malla previamente pesado y marcado y escurre el exceso de agua. A continuación, seca brevemente la malla con papel toalla para eliminar el exceso de agua.

Para decorionar los embriones, llene hasta la mitad una placa de Petri de seis centímetros con lejía al 50%. Luego prepare dos placas de Petri más grandes con agua. Sumerja el recipiente de malla con embriones, en lejía al 50% durante 90 segundos.

Golpee suavemente la malla durante la incubación un par de veces, para suspender los embriones en la solución de lejía. Al final de la incubación, use agua para lavar el recipiente de malla en cada uno de los dos platos, durante unos 10 segundos. A continuación, utilice 18,2 megaohmios de agua en una botella con atomizador, para enjuagar bien el recipiente de malla, incluidos los lados y el exterior.

No se debe detectar ningún olor a lejía después de un lavado a fondo. Seca el recipiente de malla con toallas de papel. A continuación, pesa el recipiente de malla, con los embriones y resta el peso del recipiente vacío.

Registre el peso resultante de los embriones. Para preparar el extracto embrionario, agregue un mililitro de Tampón de Lisias con inhibidores de proteasa, a un homogeneizador de vidrio Dounce y manténgalo en hielo. A continuación, transfiera los embriones del contenedor de malla al homogeneizador.

Use un mililitro de tampón de lisis para lavar los embriones restantes en la malla. Y agregue los embriones y el tampón al material en el homogeneizador. A continuación, deje que los embriones se asienten hasta el fondo del homogeneizador y aspire cuidadosamente el sobrenadante.

A continuación, agregue Lysis Buffer con inhibidores de la proteasa al homogeneizador, con el objetivo de obtener de cinco a seis mililitros de Lysis Buffer por gramo de embriones. A continuación, inserte un mortero suelto para homogeneizar los embriones con cuatro a seis golpes. Durante los primeros golpes, habrá más resistencia.

Trate de mover el mortero con un movimiento continuo, para evitar salpicar la solución. Luego cambie a un mortero ajustado. Y homogeneizar los embriones con ocho a 10 golpes.

Incubar el homogénido en hielo durante 20 minutos. A continuación, transfiera el homogéneo a tubos de microcentrífuga. Y centrifugar a 13, 000 tiempo G y cuatro grados centígrados durante 15 minutos.

Mientras evita los gránulos en la capa lipídica superior, transfiera los sobrenadantes a tubos de microcentrífuga nuevos en hielo. Después de repetir la concentración, use una punta de un mililitro para recoger cuidadosamente los sobrenadantes. Y transfiéralos a jeringas refrigeradas de 10 mililitros, con filtros de 045 micrómetros adjuntos.

Empuje toda la solución en tubos de microcentrífuga de dos mililitros etiquetados sobre hielo. Congele las muestras en nitrógeno líquido y guárdelas a menos 80 grados centígrados. O úselo inmediatamente para experimentos de purificación de proteínas.

Utilizando el protocolo descrito en este vídeo, se prepararon lisados a partir de embriones de Drosophila que expresan de forma ubicua la proteína EGFP-ERK, bajo el control del promotor arm-odillo. La expresión de la proteína fue confirmada por Western Blotting para la proteína ERK total para detectar simultáneamente los niveles de EGFP-ERK endógeno y transgénico, migrando a 42 kilodaltons y 69 kilodaltons respectivamente. Se detectó una sola banda, correspondiente a ERK endógena no marcada, en la línea de control amarilla y blanca, lo que confirma una extracción exitosa de ERK y EGFP-ERK de los embriones.

Para probar si el protocolo de extracción es adecuado para la purificación posterior de la proteína marcada, los extractos de las moscas amarillas, blancas y arm-EGFP-ERK, se sometieron a purificación por afinidad, utilizando perlas de agarosa GFP. La tinción de plata de las muestras ejecutadas en un gradiente SDS-PAGE, muestra una purificación exitosa de la proteína de cebo EGFP-ERK. Además de EGFP-ERK, el carril experimental contenía bandas adicionales, no observadas en la muestra de control, lo que sugiere que la purificación recuperó las proteínas que interactúan potencialmente con ERK.

Una vez dominado, la recolección de embriones y los pasos de extracción, se pueden realizar en aproximadamente dos horas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar realizar los pasos de extracción en hielo. Y utilizar inhibidores de la proteasa para minimizar la degradación de proteínas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo configurar jaulas de población de Drosophila a mediana escala. Y hacer extractos de proteínas de células enteras a partir de embriones.