Métodos para la extracción de endosimbiontes de la mosca blanca Bemisia tabaci

El objetivo general de este experimento es extraer endosimbiontes de insectos diminutos para futuros experimentos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave desde el punto de vista de la entomología y la macrobiología, ya que la mayoría de los endosimbiontes no se pueden cultivar in vitro. El método muestra que aislar cantidades adecuadas de bacterias para experimentos posteriores es muy importante.

La principal ventaja de esta técnica es que podemos aislar convenientemente los endosimbiontes bacterianos de la mosca blanca. Esto también se puede aplicar al aislamiento de endosimbiontes de otros insectos como pulgones, saltamontes y trips. Para empezar, recoja una mosca blanca adulta individual y homogénela en 30 microlitros de tampón de lisis.

Incubar el homogeneizado a 65 grados centígrados durante una hora. Luego 100 grados centígrados durante 10 minutos. Usando ADN de mosca blanca y cebadores de citocromo oxidasa 1 mitocondial, prepare reacciones de PCR de 25 microlitros utilizando los siguientes reactivos.

A continuación, ejecute las reacciones de PCR utilizando el programa que se muestra aquí. A continuación, utilice un kit de extracción de gel de ADN siguiendo el protocolo recomendado para limpiar el producto PCR. A continuación, realice el análisis de secuencia de acuerdo con el protocolo de texto.

Para amplificar genes específicos de cada endosimbionte dentro de la mosca blanca, se lleva a cabo una PCR en el ADN de la mosca blanca. De acuerdo con un protocolo publicado anteriormente, someta la muestra amplificada a electroforesis y secuenciación en gel de agarosa para determinar las especies bacterianas dentro de la mosca blanca e identificar el gen específico de cada bacteria. Para diseccionar y purificar el bacterioma de la mosca blanca, agregue 100 microlitros de 1x solución de PBS en un portaobjetos de microscopio.

Luego, recoja ninfas del tercer o cuarto estadio de las hojas de algodón. Y sumergirlos en la PBS. Bajo un microscopio, use agujas entomológicas finas para extraer los bacteriomas del cuerpo de la mosca blanca.

Tenga cuidado al aislar el bacterioma, ya que es pequeño y frágil. Corta suavemente un agujero en un lado de la ninfa y presiona ligeramente el otro lado para dejar salir los bacteriomas. A continuación, monte un microcargador de 20 microlitros en una pipeta de 0,5 a 10 microlitros y extraiga el bacterioma individual del PBS en el microcargador.

Lave el bacterioma para eliminar la contaminación de otros tejidos de la mosca blanca pipeteando el bacterioma en el PBS y extrayéndolo. Repite el lavado tres veces. Se recomienda encarecidamente repetir el lavado para eliminar la mayor cantidad de contaminación posible.

Pipetear inmediatamente el bacterioma lavado en un tubo de centrífuga que contenga 60 microlitros de PBS. Filtre con jeringa el bacterioma ensamblado a través de una membrana filtrante de cinco micrómetros. Repita la filtración varias veces para mover completamente el líquido mezclado a través de la membrana.

Para amplificar el filtrado, prepare el tampón D2 que se utilizará con el protocolo recomendado para la amplificación de ADN genómico de sangre o células con algunas modificaciones. Agregue directamente 1,5 microlitros de filtrado a un tubo de centrífuga seguido de 1,5 microlitros de tampón D2. Mezclar bien e incubar la muestra en hielo durante 10 minutos. A continuación, añada 1,5 microlitros de solución de parada.

Agregue 15 microlitros del tampón de reacción y un microlitro de ADN polimerasa y mezcle suavemente. Incubar la mezcla a 30 grados centígrados durante 16 horas, seguido de 65 grados centígrados durante tres minutos. Realice la PCR directamente sobre el filtrado amplificado utilizando cebadores específicos diseñados para bacterias para confirmar las especies bacterianas.

También realice una PCR para confirmar si hay contaminación del genoma del huésped mediante el uso de cebadores para los genes de mosca blanca beta-actina y EF1 de acuerdo con el método publicado anteriormente. Por último, realizar la secuenciación del metagenoma según el protocolo de texto. En esta figura, se muestra el algodón para la cría de moscas blancas y varias etapas de desarrollo de las moscas blancas.

Incluyendo un adulto y ninfas de primer, segundo y cuarto estadio. Aquí se muestra el análisis FISH de los endosimbiontes Portiera y Hamiltonella dentro de la ninfa del cuarto estadio de MEAM1. Se observa la superposición de las dos bacterias y ambas están confinadas a los bacteriocitos de la mosca blanca.

Aquí se muestran las imágenes de microscopía electrónica de transmisión del endosimbionte Portiera de la mosca blanca, lo que indica que Portiera puede perder su pared celular. Después de secuenciar y limpiar los datos de contaminación para adaptadores y duplicaciones, se adquirió el genoma completo del simbionte obligado Portiera. El resultado es un genoma circular de 358.232 pares de bases.

Además, se obtuvo un borrador del genoma de Hamiltonella que incluía 138 contigs que se ensamblaron en 89 andamios basados en relaciones finales pareadas. Una vez dominada esta técnica se puede realizar en 20 horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe mantener las muestras alejadas de la contaminación de las bacterias ambientales.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros análisis como la secuencia de AR y el bacterioma de masa para responder a preguntas adicionales como la expresión génica del endosimbionte y el metabolismo. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores del campo de la entomología y la microbiología exploraran la función de los endosimbiontes en insectos o artrópodos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo extraer simbiontes de bacteriomas de insectos.

No olvide que trabajar con algunos de los reactivos puede ser peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes al realizar este procedimiento.