Microscopía fotoacústica de resolución óptica y acústica conmutable para In Vivo Imágenes de vasos sanguíneos de pequeños animales

El objetivo general de este procedimiento es demostrar un sistema de microscopía fotoacústica conmutable de resolución acústica y óptica para la obtención de imágenes de la vasculatura sanguínea en animales pequeños in vivo. La microscopía fotoacústica es una modalidad de imagen in vivo de rápido crecimiento que combina óptica y ultrasonido, proporcionando profundidad de imagen más allá de la trayectoria óptica con alta resolución. Este trabajo es un sistema microscópico fotoacústico de resolución óptica conmutable capaz de obtener imágenes de mayor resolución a poca profundidad, así como imágenes de tejidos profundos de menor resolución de la misma muestra in vivo.

El Dr. Mohesh Moothanchery, investigador de mi laboratorio, y Arunima Sharma, estudiante de doctorado de mi laboratorio, demostrarán el procedimiento. En primer lugar, construya un sistema láser sintonizable de nanosegundos a partir de un láser Nd:YAG de estado sólido bombeado por diodos y un láser difuminable con un rango de 559 a 576 nanómetros. Ajuste el láser difuminable a 570 nan.

Monte en una mesa óptica un tanque acrílico con una ventana de imagen de polietileno de siete centímetros en el piso del tanque. Fije una platina de imagen a un poste óptico debajo de la ventana de imagen. Sobre el tanque, monte una jaula óptica que contenga el sistema de imágenes AR-OR-PAM en una placa de conmutación sujeta a una etapa de traducción motorizada de tres ejes controlada por computadora.

Para configurar el sistema para AR-PAM, utilice un prisma de ángulo derecho montado en una etapa de rotación continua motorizada para dirigir el haz a través de un filtro de densidad neutra variable a un cable de fibra multimodo con un acoplador de fibra de 25 NA. Conecte la salida de fibra a una etapa de traducción XY en el sistema de imágenes. Dirija el haz a través de una lente convexa plana a 25 milímetros de la salida y, a continuación, a través de una lente cónica para crear un haz en forma de anillo.

Enfoque el haz en forma de anillo en un condensador óptico alrededor de un transductor ultrasónico de 50 megahercios con una lente acústica montada en la salida del transductor. A continuación, para configurar el sistema para OR-PAM, gire el primer prisma de ángulo recto 90 grados para dirigir el rayo láser a través de un iris, un filtro de densidad neutra variable, una lente de condensador y un orificio de alfiler establecido a 75 milímetros de la lente del condensador. Utilice un acoplador de fibra monomodo de 1 NA y una fibra monomodo para enviar el haz a la etapa de traducción Z en el sistema de imágenes.

Dirija el haz a través de una lente doble acromática montada a 50 milímetros de la salida de fibra. Desvíe el haz con un espejo elíptico cinemático y controlable a una segunda lente doble acromática en un tubo de lente. Enfoca el haz en un prisma de ángulo recto separado por una capa de aceite de silicona de un prisma romboidal, con una lente acústica y un transductor ultrasónico de 50 megahercios, que forma el cabezal de escaneo OR-PAM.

Antes de comenzar la alineación del sistema, llene los tanques de acrílico con agua desgasificada. A continuación, utilice la platina motorizada de tres ejes para mover el conjunto de escaneo sobre el tanque. Baje el conjunto hasta sumergir las lentes acústicas de ambos sistemas.

Encienda el láser. Conecte los transductores de ultrasonido a dos amplificadores de ganancia fija de 25 decibelios. Coloque el cabezal de escaneo AR-PAM sobre la ventana de imagen.

Coloque un portaobjetos de vidrio envuelto en cinta aislante negra en la platina de imágenes y levántelo para que la diapositiva entre en contacto con la ventana de imagen. Ajuste la lente cónica hasta que la amplitud de la señal fotoacústica generada por el portaobjetos alcance un máximo, lo que indica que las lentes ópticas y acústicas son confocales. A continuación, cambie manualmente al sistema OR-PAM.

Ajuste la lente doble acromática hasta que las lentes ópticas y acústicas sean confocales, como se indica maximizando la amplitud de la señal fotoacústica de la diapositiva cubierta con cinta. Para determinar la resolución lateral de cada sistema, primero coloque 1 mililitro de una solución diluida de nanopartículas de oro de 100 nanómetros en agua en un cubreobjetos. Coloque el portaobjetos en la platina de imagen.

y eleve la etapa hasta que la solución de nanopartículas entre en contacto con la ventana de imagen. Conecte el láser y el cabezal de escaneo al sistema AR-PAM. Configure el software del instrumento para un escaneo AR-PAM y realice un solo escaneo ráster.

Repita este proceso para el sistema OR-PAM. A continuación, retire el portaobjetos y limpie la ventana de imagen con un hisopo con alcohol. Ajuste las funciones de dispersión de puntos determinadas a partir de las imágenes adquiridas a una curva gaussiana.

El ancho completo a la mitad del máximo es la resolución lateral para el sistema de escaneo correspondiente. A continuación, para determinar la profundidad máxima de la imagen en el tejido, primero inserte una placa de metal afilada envuelta en cinta negra en una pequeña sección de tejido de pollo en un ángulo poco profundo. Coloque el pañuelo en el tanque de agua debajo del cabezal del escáner.

Obtenga una única imagen B-scan para cada sistema. Mida la profundidad debajo de la superficie del tejido en la que la cinta negra ya no es claramente discernible. Antes de la toma de imágenes, asegúrese de que la ventana de imágenes de polietileno y la etapa de imágenes de animales estén limpias.

Luego, obtenga un ratón hembra de 25 gramos y cuatro semanas de edad para el procedimiento de diagnóstico por imágenes después de anestesiar al ratón. Elimina el vello de la superficie de la oreja con crema depilatoria. Aplique ungüento ocular estéril en los ojos del ratón para evitar la sequedad y bloquear los rayos láser dispersos.

Coloque el ratón en una platina de imagen con la placa para posicionar la oreja a mí imagen. Controle la condición fisiológica del ratón con un oxímetro de pulso sujeto a la cola o la pata del ratón. Aplique gel de ultrasonido en el oído que se va a obtener la imagen.

Levante lentamente la platina de imagen para que el oído entre suavemente en contacto con la ventana de imagen de polietileno. Adquiera escaneos rasterizados AR-PAM y OR-PAM de la oreja del ratón, monitoreando el estado fisiológico del mouse en todo momento. Permita que el mouse se recupere por completo después de la toma de imágenes.

El sistema de vasculatura sanguínea de un ratón se fotografió in vivo con un sistema AR-OR-PAM conmutable. Los vasos sanguíneos de más de 45 micrómetros de grosor eran claramente visibles en la imagen AR-PAM. Los capilares individuales de unos cinco micrómetros de ancho se resolvieron con imágenes OR-PAM.

El sistema combinado AR-OR-PAM tiene una resolución lateral de aproximadamente cuatro micras. Y en el punto, imágenes de cuatro mm para el OR-PAM y una resolución lateral de aproximadamente 45 micrómetros y 7,8 mm para el AR-PAM. El sistema combinado conmutable AR-OR-PAM permite la obtención de imágenes sin mover la muestra entre diferentes sistemas de imagen.

El sistema desarrollado se puede utilizar para la obtención de imágenes preclínicas. Las principales aplicaciones preclínicas incluyen imágenes de androgénesis, microambientes tumorales, microcirculaciones, respuesta a fármacos, función cerebral, biomarcadores y actividades génicas.