Fácil manipulación de arquitecturas en Hidrogeles basados en proteínas para aplicaciones de la cultura de célula

El objetivo general de esta metodología es crear hidrogeles macroporosos con diferentes tamaños de poro para aplicaciones de cultivo celular. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del cultivo celular en 3D, como la viabilidad principal de un nuevo material de hidrogel para aplicaciones de cultivo celular en 3D. La principal ventaja de esta metodología es que ofrece una gama de técnicas para optimizar y ajustar un material novedoso a los requisitos de diferentes tipos de células.

Para comenzar, diluya un miligramo del péptido RGD o un péptido adhesivo celular equivalente en 100 microlitros de agua estéril para obtener la solución de 10 miligramos por mililitro. A continuación, retire la parte inferior de una placa de 96 pocillos y reemplácela con una envoltura de plástico de extracción. Mezcle 100 microlitros de solución madre de BSA y 100 microlitros de solución madre de THPC en la placa de 96 pocillos para obtener 200 microlitros de hidrogel.

Mezcle los componentes pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos cinco veces para garantizar un hidrogel uniforme después de la polimerización. Coloque la placa de 96 pocillos a temperatura ambiente durante unos 10 minutos hasta que todos los hidrogeles estén debidamente polimerizados. Después de la polimerización, retire con cuidado y lentamente la envoltura de plástico del fondo de la placa.

Exprima los hidrogeles de la placa de 96 pocillos con una pequeña puñalada y transfiéralos a tubos de 1,5 mililitros con PBS estéril pH 7,4. Almacene los hidrogeles en solución salina tamponada con fosfato a cuatro grados centígrados durante varios meses. Para liofilizar los hidrogeles, primero llene los tubos de 1,5 mililitros con 500 microlitros de agua desionizada estéril y retire las tapas.

Transfiera los hidrogeles a los tubos de reacción de 1,5 mililitros con pinzas. Envuelva bien los tubos de 1,5 mililitros con una película de parafina, utilizando al menos tres capas para cada vial. Use una aguja para perforar pequeños agujeros en la película para permitir la liberación de gas de los tubos.

Para garantizar que el agua y el hidrogel se congelen completamente, transfiera el vial a una solución de nitrógeno líquido durante cinco minutos. Inmediatamente después de retirarlos del nitrógeno líquido, transfiera los viales al liofilizador para evitar que el material se descongele. Como paso de congelación alternativo, mantenga los viales a menos 20 grados centígrados durante la noche para congelar lentamente los hidrogeles.

Inmediatamente después de retirarlos de menos 20 grados centígrados, transfiera los viales al liofilizador para evitar que el material se descongele. Después de 24 horas y la evaporación completa del agua dentro y alrededor del hidrogel, descongele el material retirándolo del liofilizador. Para la lixiviación de partículas, mezcle los componentes del hidrogel como antes.

Después de mezclar, agregue inmediatamente el cloruro de sodio hasta que se produzca la saturación. Agregue sal hasta que se puedan ver cristales de sal en la solución como un precipitado blanco. El tamaño de los poros se puede alterar moliendo los cristales de sal antes de su uso.

Transfiera la placa de 96 pocillos a un agitador y agite hasta que se lleve a cabo la polimerización. Después de unos 10 minutos, retire los hidrogeles de la placa como antes. Incubar los hidrogeles durante al menos 24 horas a temperatura ambiente en agua estéril en un rotador para eluir toda la sal de la plantilla de hidrogel.

Almacene los hidrogeles a cuatro grados centígrados en PBS durante varios meses. Para una formación suave, prepare los hidrogeles como se describe. A continuación, retire un hidrogel de la solución con una pinza.

Retira el exceso de agua con papel muy absorbente y colócalo encima de un bloque de hielo seco. Congela el hidrogel durante 30 segundos y retíralo con cuidado del bloque. No dañe el hidrogel.

Use con cuidado una espátula para rasparlo del bloque. Transfiera el hidrogel a un tubo de 1,5 mililitros y séquelo durante la noche a 37 grados centígrados. Prepare una solución madre de rodamina B, así como diluciones en serie como se describe en el protocolo de texto.

Retire el hidrogel de la solución almacenada y transfiéralo a un tubo de 1,5 mililitros con una solución de 0,01 miligramos por mililitro de rodamina B. Tiñe el hidrogel durante la noche en la solución de rodamina B a temperatura ambiente. Al día siguiente, transfiera el hidrogel que se va a visualizar a 10 mililitros de PBS y lave durante al menos tres horas.

Corta pequeñas rodajas del hidrogel con una cuchilla. Luego transfiera el hidrogel a un portaobjetos microscópico de ocho pocillos y cúbralo con PBS. Usando un microscopio de escaneo láser confocal, visualice el hidrogel a una longitud de onda de 514 nanómetros.

Filtre estérilmente todas las soluciones madre con un filtro de 0,45 micras. Comience la preparación del hidrogel e incluya el péptido adhesivo celular antes de la polimerización del hidrogel. Después de mezclar los componentes, pipetee inmediatamente la mezcla en un portaobjetos microscópico de ocho pocillos hasta que el fondo esté completamente cubierto.

Transfiera las células a un medio de cultivo celular DMEM estéril precalentado suplementado con suero fetal bovino, estreptomicina de penicilina y solución de aminoácidos no esenciales. Después de contar las células con una cámara de recuento de Neubauer, pipetee cuidadosamente 200 microlitros del número deseado de células en la superficie del hidrogel. Cubra el portaobjetos microscópico de ocho pocillos con una tapa y transfiéralo a una incubadora.

Después de al menos cuatro horas de unión celular, lavar las células dos veces con 200 microlitros de PBS de cultivo celular estéril. A continuación, fije las celdas con 200 microlitros de formaldehído al 3,7% durante 10 minutos a temperatura ambiente y lave dos veces con PBS. Permeabilizar las células con 200 microlitros de Triton X al 0,1% durante cinco minutos antes de lavar dos veces más con PBS.

Teñir las células con toluidina rodamina mezclando cinco microlitros de caldo metanólico con 195 microlitros de PBS y añadiéndolo a las células a temperatura ambiente. Tiña las células durante 20 minutos en la oscuridad antes de lavarlas dos veces con PBS. Investigue las propiedades de adhesión celular utilizando un microscopio confocal a 514 nanómetros.

Analice las propiedades del hidrogel como se describe en el protocolo de texto. Como se muestra aquí, los hidrogeles polimerizados y teñidos no tienen arquitecturas distintivas. Después de liofilizar los hidrogeles a diferentes temperaturas, el tamaño promedio de los poros dentro del hidrogel se puede extender hasta 60 micras.

La lixiviación salina da como resultado redes uniformes con tamaños de poro de aproximadamente 10 micras. El tamaño se puede ajustar aún más moliendo cristales de sal antes de su uso. El uso de un enfoque de congelación en gradiente en un bloque de hielo seco conduce a la formación de canales con un diámetro de aproximadamente 20 micras y una longitud de varios cientos de micras.

Antes de la funcionalización con la fracción adhesiva de la célula, las células no pueden adherirse a la superficie del hidrogel y muestran una morfología redonda. Solo después de proporcionar al material el péptido adhesivo de la célula, las células encuentran puntos focales de adhesión que permiten una adhesión adecuada de la célula a un material. Esto es crucial para el uso de materiales novedosos en aplicaciones de cultivo celular en 3D.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo manipular la arquitectura de un hidrogel con métodos simples. Este método se puede aplicar a la mayoría de los sistemas de hidrogel novedosos para aprender sobre el uso en cultivos celulares y optimizar la arquitectura del hidrogel en función del uso previsto.