Protocolo de análisis de reloj para análisis de imagen: Plugins de ImageJ

El objetivo general de estos protocolos de escaneo circular es permitir la caracterización rápida de la intensidad promedio de píxeles dentro, a lo largo del borde de, y/o en el exterior de regiones de interés seleccionadas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave y a enseñar a los analistas de imágenes sobre la intensidad promedio de píxeles dentro de regiones de interés específicas. Las principales ventajas de la técnica de escaneo circular aquí son que puede utilizarse para caracterizar rápidamente la intensidad promedio de píxeles desde la órbita en una o múltiples regiones de interés.

Para el análisis estándar de escaneo de reloj, en el menú Archivo, dentro del programa ImageJ adecuado, seleccione Abrir para abrir un archivo de imagen de interés. Por ejemplo, aquí se analizará una sección de tejido con neuronas marcadas para una proteína de interés. Seleccione una herramienta de dibujo adecuada y delimite la región de interés.

Seleccione Plugins y Escaneo de reloj en el menú Archivo para abrir el protocolo estándar de escaneo de reloj, ventana emergente de opciones. También se abrirá la ventana del administrador de la región de interés, con el contorno agregado automáticamente. En la ventana de opciones del plugin, use las barras de desplazamiento para cambiar las coordenadas x e y en el centro de la región de interés, según corresponda.

Dependiendo de cuánta región de fondo fuera del objeto debe cubrirse mediante el escaneo, utilice la barra de desplazamiento de límite de escaneo para ajustar los límites de escaneo. Seleccione los cuadros de verificación de radio real, sustracción de fondo, transformada polar y/o gráfico con desviación estándar según sea apropiado para el experimento. A continuación, haga clic en Aceptar para ejecutar el complemento.

Una vez finalizado el análisis, utilice el comando de lista para acceder a los datos numéricos y realizar un análisis adicional. Para el análisis de escaneo del reloj en múltiples regiones, abra un archivo de imagen que contenga varias regiones de interés. Por ejemplo, aquí se analizará un panel de cuadros capturados dentro de la misma sección de tejido, tal como se acaba de demostrar.

Haga clic en Analizar, luego en Herramientas y después en Administrador de región de interés, y utilice la herramienta de dibujo adecuada para delinear cada región de interés. La herramienta de línea segmentada es útil para seleccionar regiones de interés asimétricas y para excluir la señal de fondo. Haga clic en Agregar en la ventana del Administrador de región de interés para añadir cada región de interés al administrador a medida que se selecciona.

en el menú Plugins, seleccione Multi Clock Scan para abrir la ventana emergente de opciones del protocolo y restablezca el límite de escaneo, según sea necesario. Verifique la gráfica con la desviación estándar y/o reste las casillas de fondo, según lo requiera el experimento. Luego, haga clic en Aceptar para ejecutar el protocolo, lo que generará dos ventanas de gráficos de salida.

Para el análisis de escaneo de reloj de una pila de imágenes, abra una pila de imágenes de interés. Aquí, se analizará una pila de imágenes de un ganglio de la raíz dorsal aislado, marcado con un fluoróforo sensible al calcio que fue capturado antes y después de la estimulación con electrodo intracelular. Delinee la región de interés dentro de la pila de imágenes.

Agregue la pila de imágenes seleccionada al administrador de regiones de interés, como se acaba de demostrar, y seleccione Escaneo múltiple por sectores para abrir la ventana emergente de opciones del protocolo. Restablezca el límite de escaneo según sea necesario y active la casilla de trazado con desviación estándar y/o sustracción de fondos, según convenga al experimento. A continuación, haga clic en Aceptar para ejecutar el protocolo, generando dos ventanas de resultados gráficos.

En este análisis representativo de una sección de tejido de neuronas marcadas con fluorescencia, se trazó una región de interés a través de la señal brillante para la proteína de interés, y se realizó un análisis estándar de barrido circular para recopilar barridos radiales de intensidad de píxeles desde el centro de la región de interés hasta el límite de barrido delineado. Los barridos radiales se normalizaron al radio de la región de interés en la dirección del barrido. Se calculó un promedio para producir un perfil integral de intensidad de píxeles radiales, lo que reveló que la mayor parte de la proteína de interés se midió en la membrana plasmática de la célula.

Dado que para este análisis se seleccionó el gráfico con desviación estándar, las líneas verticales de desviación estándar indicaron las intensidades entre píxeles de los perfiles individuales de escaneo radial a una distancia determinada del origen del escaneo. En este análisis, se escanearon múltiples regiones de interés dentro de la muestra de tejido neuronal, como se acaba de demostrar, generando un perfil integral de intensidad de píxeles para cada objeto escaneado en el orden en que se agregaron al administrador de regiones de interés. Y, un perfil promedio de intensidad de píxeles para cada región de interés seleccionada.

Por lo tanto, estas barras de desviación estándar representan la variabilidad entre escaneos integrales de objetos individuales, y no entre escaneos radiales individuales. Aquí se realizó un análisis de una pila de imágenes de una neurona aislada del ganglio de la raíz dorsal, capturada en diferentes momentos, antes y después de la estimulación, mediante un electrodo intracelular. Al final del análisis, se mostró un perfil integral de intensidad de píxeles de las instancias individuales del objeto de interés en diferentes imágenes dentro de la pila, así como un perfil promedio de intensidad de píxeles para todas las instancias del objeto.

Además, el análisis de la desviación estándar de una pila de imágenes escaneadas con el método "clock scan" demuestra la variabilidad de los datos entre los escaneos integrales a lo largo de toda la pila de imágenes. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir las intensidades de píxeles utilizando complementos de escaneo circular. Nuestro objetivo al desarrollar estos complementos fue hacer que este tipo de análisis de imágenes esté libremente disponible para todos los investigadores.

Consideramos que el protocolo de escaneo por reloj se utilizará en muchas áreas de investigación, incluyendo, entre otras, aplicaciones de imagen biológica, química y física. A medida que continuemos desarrollando y operando estos complementos de escaneo por reloj, agradeceremos cualquier comentario y sugerencia de las partes interesadas sobre cómo mejorar estas herramientas.