Protocolo de análisis de reloj para análisis de imagen: Plugins de ImageJ

El objetivo general de estos protocolos de escaneo de reloj es permitir la caracterización rápida de la intensidad media de píxeles dentro, a lo largo del borde y/o fuera de las regiones de interés seleccionadas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave y enseñar a los analistas de imágenes sobre la intensidad media de los píxeles dentro de regiones específicas de interés. Las principales ventajas de la técnica de escaneo de reloj aquí son que se puede utilizar para caracterizar rápidamente la intensidad promedio de píxeles desde la órbita en una o varias regiones de interés.

Para el análisis de escaneo de reloj estándar, en el menú Archivo, en el programa ImageJ apropiado, seleccione Abrir para abrir un archivo de imagen de interés. Por ejemplo, aquí se analizará una sección de tejido con neuronas marcadas para una proteína de interés. Seleccione una herramienta de dibujo adecuada y delinee la región de interés.

Seleccione Plugins y escaneo de reloj en el menú Archivo para abrir el protocolo de escaneo de reloj estándar, ventana de opción emergente. También se abrirá la ventana del administrador de regiones de interés, con el contorno agregado automáticamente. En la ventana de opciones del plugin, utilice las barras de desplazamiento para cambiar las coordenadas x e y en el centro de la región de interés, según corresponda.

En función de la cantidad de la región del fondo fuera del objeto que deba cubrir el escaneo, utilice la barra de desplazamiento del límite de escaneo para ajustar los límites del escaneo. Seleccione las casillas de verificación radio real, restar fondo, transformación polar y/o trazar con desviación estándar según sea apropiado experimentalmente. A continuación, haz clic en Aceptar para ejecutar el plugin.

Una vez completado el análisis, utilice el comando list para acceder a los datos numéricos para un análisis más detallado. Para el análisis de escaneo de reloj de varias regiones, abra un archivo de imagen que contenga varias regiones de interés. Por ejemplo, aquí, se analizará un panel de fotogramas capturados dentro de la misma sección de tejido, como se acaba de demostrar.

Haga clic en Analizar, luego en Herramientas, luego en Administrador de regiones de interés y utilice la herramienta de dibujo adecuada para delinear cada región de interés. La herramienta de línea segmentada es útil para seleccionar regiones asimétricas de interés y para excluir el etiquetado de fondo. Haga clic en Agregar en la ventana Administrador de regiones de interés para agregar cada región de interés al administrador a medida que se selecciona.

en el menú Plugins, seleccione Multi Clock Scan para abrir la ventana emergente de opciones de protocolo y restablecer el límite de escaneo, según sea necesario. Marque la gráfica con desviación estándar y/o reste las casillas de fondo, según sea apropiado experimentalmente. A continuación, haga clic en Aceptar para ejecutar el protocolo, que generará dos ventanas de trazado de salida.

Para el análisis de escaneo de reloj de una pila de imágenes, abra una pila de imágenes de interés. Aquí, se analizará una pila de imágenes de un ganglio aislado de la raíz dorsal, marcado con un fluorescente sensible al calcio que se fotografió antes y después de la estimulación con electrodos intracelulares. Describa la región de interés dentro de la pila de imágenes.

Agregue la pila de imágenes seleccionada al administrador de la región de interés, como se acaba de demostrar, y seleccione Escaneo de reloj múltiple para abrir la ventana emergente de opciones de protocolo. Restablezca el límite de escaneo según sea necesario y verifique la gráfica con desviación estándar y/o reste las casillas de fondo, según sea apropiado experimentalmente. A continuación, haga clic en Aceptar para ejecutar el protocolo, generando dos ventanas de trazado de salida.

En este análisis representativo de una sección de tejido de neuronas marcadas con fluorescencia, se dibujó una región de interés a través de la señal brillante de la proteína de interés, y se realizó un análisis de escaneo de reloj estándar para recopilar escaneos de intensidad de píxeles radiales desde el centro de la región de interés hasta el límite de escaneo descrito. Los escaneos radiales se normalizaron al radio de la región de interés en la dirección del escaneo. Un promedio, para producir un perfil de intensidad de píxeles de radio integral, revelando que la mayor parte de la proteína de interés se midió en la membrana plasmática de la célula.

Como se seleccionó el gráfico con desviación estándar para este análisis, las líneas verticales de desviación estándar indicaron las intensidades entre píxeles de los perfiles de escaneo radial individuales a una distancia dada desde el origen del escaneo. En este análisis, se escanearon múltiples regiones de interés dentro de la muestra de tejido neuronal, como se acaba de demostrar, generando un perfil de intensidad de píxeles integral para cada objeto escaneado en la secuencia en que se agregaron al administrador de regiones de interés. Y un perfil de intensidad de píxel promedio para cada región de interés seleccionada.

Estas barras de desviación estándar, por lo tanto, representan la variabilidad entre escaneos integrales de objetos individuales, en lugar de escaneos radiales individuales. Aquí, se realizó un análisis de pila de imágenes de una neurona ganglionar aislada de la raíz dorsal capturada en diferentes momentos, antes y después de la estimulación, a través de un electrodo intracelular. Al final del análisis, se mostró un perfil de intensidad de píxel integral de las instancias individuales del objeto de interés en diferentes imágenes dentro de la pila, y un perfil de intensidad de píxel promedio para todas las instancias del objeto.

Además, el análisis de la desviación estándar de una pila de imágenes escaneadas con reloj demuestra la variabilidad de los datos entre las exploraciones integrales a lo largo de la pila de imágenes. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir las intensidades de los píxeles utilizando complementos de escaneo de reloj. Nuestro propósito al desarrollar estos complementos fue hacer que estos tipos de análisis de imágenes estuvieran disponibles de forma gratuita para todos los investigadores.

Creemos que el protocolo de escaneo de reloj se utilizará para las muchas áreas de investigación, incluidas, entre otras, las aplicaciones de imágenes biológicas, químicas y físicas. A medida que continuamos desarrollando y operando estos complementos de escaneo de reloj, apreciaremos cualquier comentario y sugerencia de las partes interesadas sobre cómo mejorar estas herramientas.