Modulación reversible mediada por luz de la vía de la proteína quinasa activada por mitógeno durante la diferenciación celular y Xenopus Desarrollo embrionario

El objetivo general de este experimento es utilizar la luz para controlar la vía de señalización de la proteína quinasa activada por mitógenos en células intactas y en embriones de Xenopus. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología celular y del desarrollo, como cómo las modulaciones temporales de la actividad de la quinasa regulan la autodeterminación durante la diferenciación celular y el desarrollo embrionario. La principal ventaja de esta técnica es que la actividad de la proteína quinasa activada por mitógenos puede controlarse de forma reversible en células intactas y en organismos pluricelulares, como los embriones en desarrollo.

Este método puede proporcionar información sobre la cinética de señalización durante el desarrollo embrionario de Xenopus. También se puede aplicar a otros sistemas de modelos como el socotra, el pez cebra o el ratón. Hoy, un estudiante graduado de mi laboratorio, Vishnu Krishnamurthy, demostrará el procedimiento.

Y Aurora Turgeon, una post-estrella en mi laboratorio, demostrará todos los procedimientos involucrados en los embriones de Xenopus. En primer lugar, ensamble el dispositivo de cultivo celular colocando una cámara de PDMS estéril esterilizada en autoclave en un cubreobjetos estéril recubierto de PLL en una placa de Petri de 60 mm. A continuación, utilice 0,5 ml de tripsina al 0,25% para separar las células pHK21 de un pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos.

Después de contar la densidad celular con el hemocitómetro, siembre la cámara con 20, 000 células en 200 microlitros de medio de cultivo celular. 24 horas después de la siembra de células, transfecte las células con 50 a 100 nanogramos de CRY2-mCherry-Raf1 2A2CIBMG de plásmido PCaA X según el protocolo del fabricante. Tres horas después de la transfección, cambie el medio a 200 microlitros de medio de cultivo fresco y permita que las células se recuperen durante la noche incubando el cultivo en una incubadora de 37 grados Celsius y cinco por ciento de dióxido de carbono.

Al día siguiente, comience la inducción optogenética y la obtención de imágenes reemplazando primero el medio de cultivo celular con 200 microlitros de medio independiente del dióxido de carbono. A continuación, configure el protocolo de adquisición de datos. Seleccione el canal FITC de excitación nonométrica 488 para la estimulación optogenética y el canal CRITC de excitación de 561 nanómetros para rastrear la localización celular de la proteína marcada con mCherry.

Mida la potencia de la luz azul colocando un medidor de potencia cerca de la ventana del objetivo. Una potencia total de dos microvatios es suficiente para inducir la asociación CIBN CRY2-PHR. Configure una adquisición de marca de tiempo con el intervalo de cinco segundos.

Y el tiempo total de adquisición de dos minutos. Aplique el material de coincidencia de índices adecuado en la ventana del objetivo. Coloque la cámara celular en la platina del microscopio y utilice el modo de campo claro para enfocar las células de la superficie del cubreobjetos utilizando los oculares.

A continuación, mueva la platina del microscopio para localizar una célula transfectada bajo luz verde. Grabe una serie de imágenes con marca de tiempo en los canales FITC y CITC. La imagen de muestra básica muestra CIBNGPCAAX localizado en la membrana plasmática.

Esta es una instantánea de CRY2 mCherry raf1 antes de la simulación de luz azul, mientras que esta imagen muestra una instantánea de CRY2 mCherry raf uno después de diez pulsos de estimulación de luz azul. Haga la matriz de LED insertando LED azules tonales en dos placas de prueba y conectándolas con resistencias limitadoras de corriente. Coloque las placas de pan en una caja de aluminio.

Inserte dos cables metálicos para conectar las placas a la fuente de alimentación. Asegúrese de que la longitud del cable sea suficiente cuando la caja de luz se coloque dentro de una incubadora de dióxido de carbono. A continuación, coloque un difusor de luz transparente para que actúe como cubierta de la caja de luz.

Por último, calibre la potencia de salida de cada LED en un rango de entradas de voltaje. Utilice una potencia de cero coma dos milivatios por centímetro cuadrado para el ensayo de diferenciación de células PC12 de 24 horas. Coloque la matriz de LED en una incubadora a 37 grados centígrados suplementada con un cinco por ciento de dióxido de carbono.

Conéctelo a la fuente de alimentación usando los cables metálicos y ajuste la potencia del LED a cero punto cero dos milivatios por centímetro cuadrado. Coloque la placa de 12 pocillos que contiene las células PC12 transfectadas en la ventana de la matriz de LED. Alinee la placa de modo que cada pozo esté completamente iluminado.

Aplicar iluminación de luz continua durante 24 horas. Para crear una imagen de las celdas diferenciadas, configure la adquisición de datos de instantánea única. Utilice 200 milisegundos para los canales GFP y TexasRed.

Capture imágenes de las células transfectadas en los canales GFP y TexasRed, y guarde los archivos para el análisis de datos. Comience este procedimiento fabricando agujas para la microinyección de ARN tirando de los capilares de vidrio con un extractor capilar. Retire la capa de gelatina de los embriones tratándolos con cisteína al tres por ciento diluida en 0.2 XMMR durante 15 minutos.

Transfiera los embriones a una solución de polisacarosa al tres por ciento y XMMR de punto cero y cinco para microinyección. Inyecte con precisión 500 picogramos a un nanogramo de ARN CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX en cada embrión. A continuación, cultive los embriones microinyectados en la solución de microinyección a temperatura ambiente.

Cuando los embriones alcancen la etapa de gástrula media, transfiéralos a una solución MMR 0.2x y continúe cultivando hasta la etapa deseada de desarrollo. A continuación, coloque la placa de 12 pocillos en la matriz de LED construida en casa para el tratamiento de la luz azul. Coloque un espejo encima de la placa de 12 pocillos para garantizar una iluminación completa de luz azul de los embriones.

Recolectar los embriones para análisis histológico, Western blot o de expresión génica después de la exposición a la luz azul durante el tiempo deseado. Esta imagen muestra instantáneas multicanal de células PC12 transfectadas con CRY2-2A-2CIBN después de 24 horas de estimulación con luz azul en el punto cero de dos milivatios por centímetro cuadrado. Se ven tanto los reporteros de GFP como los de mCherry.

Los círculos marcan las celdas diferenciadas y los cuadrados marcan las celdas indiferenciadas. Aquí, las células se trataron de la misma manera que las de la imagen anterior, excepto que no se utilizó estimulación con luz azul. No se observa ninguna diferenciación.

Estas células muestran resultados representativos después de la transfección con raf1 GFPCaaX, un raf1 constitutivamente activo. Los círculos y rectángulos marcan celdas diferenciadas e indiferenciadas respectivamente. Este histograma muestra las proporciones de diferenciación de las células PC12 transfectadas con CA-Raf1, cotransfectadas con CRY2, mCherry, raf1 y CIBN, GFP, Caax, y transfectadas individualmente con CRY2A, 2CIBN.

Solo las células expuestas a la luz azul mostraron una diferenciación significativa. Esta imagen muestra la morfología de embriones normales de Xenopus sin inyección de ARNm y sin tratamientos de luz. Esta imagen muestra embriones inyectados con ARNm CRY2 2A2CIBN y sometidos a estimulación con luz azul.

La activación de raf1 mediante el tratamiento de embriones inyectados con luz azul en CRY2 2A2CIBN induce estructuras ectópicas en forma de cola en la región de la cabeza. Siguiendo este procedimiento, se pueden responder preguntas adicionales, como por ejemplo cómo la activación específica de la etapa de la vía de la proteína quinasa activada por mitógenos regula la expresión génica. Este método optogenético puede generalizarse para controlar otras vías de señalización con mecanismos de activación similares.