Un Marco Metodológico Unificado para la Investigación de Schwannoma Vestibular

El objetivo general de este procedimiento es procesar una muestra de schwannoma vestibular humano recibida del quirófano para el cultivo primario de células y la recolección de secreciones tumorales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación del schwannoma vestibular, como la mejor manera de recibir, almacenar y procesar una muestra tumoral primaria humana destinada a su uso en múltiples ensayos biomoleculares. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza un método de cultivo con manipulación mínima para propagar células primarias humanas de schwannoma vestibular.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia para el schwannoma vestibular porque los candidatos terapéuticos prometedores pueden probarse directamente en células cultivadas. Comience transfiriendo el recipiente que contiene la muestra recién obtenida de schwannoma vestibular o del nervio auricular mayor desde el hielo utilizado para el transporte desde el quirófano hacia una cabina de flujo laminar en el laboratorio. Utilice pinzas estériles para transferir cuidadosamente la muestra al primero de tres tubos de 1,5 mililitros llenos con 1,4 mililitros de PBS exterior.

Cierre cada tubo una vez que contenga la muestra y agite suavemente para lavar. Coloque la muestra en una placa de Petri seca de 60 milímetros y use pinzas para eliminar todos los tejidos muertos en las áreas con vasos sanguíneos prominentes. Utilice pinzas o una hoja de bisturí para dividir la muestra en piezas separadas para la conservación de ARN, extracción de proteínas, recolección de secreciones, fijación y cultivo celular.

Transfiera el fragmento de la muestra designado para el cultivo celular a una nueva placa de cultivo de 60 milímetros que contenga de cinco a ocho mililitros de medio DMEM F12 suplementado frío. Coloque el fragmento de schwannoma vestibular o del nervio auricular mayor designado para la recolección de secreciones en un tubo vacío de 1,5 mililitros. Comience pipeteando 500 microlitros de DMEM sin suplementar con FBS en dos tubos de 1,5 mililitros.

El primer tubo se utilizará para recolectar las secreciones tumorales y el segundo tubo servirá como control emparejado. Coloque uno de los tubos que contiene DMEM sobre una balanza digital calibrada. Pese la balanza, coloque el trozo de especimen designado para la recolección de secreciones dentro del tubo y péselo.

Observe el resultado, que representará el peso del tejido por separado. Bajo una campana de flujo laminar, ajuste el volumen de DMEM en el tubo a 100 microlitros por cada 10 miligramos de la muestra. Coloque el tubo que contiene la muestra de tejido y su control apareado en el incubador.

Incube durante al menos 72 horas para recolectar cantidades biológicamente útiles de secreciones tumorales o nerviosas. Después de la incubación durante 72 horas, utilice una pipeta de un mililitro para retirar el medio que contiene la secreción del espécimen. Para evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación, alícuote el medio en nuevos tubos según el análisis posterior planeado.

Almacene el fragmento original del tejido, las secreciones y el DMEM control en un congelador a menos 80 grados Celsius hasta que se inicien las aplicaciones posteriores. Comience el procedimiento de cultivo utilizando una pinza en cada mano para separar el tejido del schwannoma vestibular en fragmentos de aproximadamente un milímetro cúbico. Luego aspire el medio y los fragmentos tumorales con una pipeta serológica de 10 milímetros y transfiera todo el contenido a un tubo cónico de 15 mililitros.

Centrifugar durante tres minutos a 1000G a 25 grados Celsius. Durante la centrifugación, prepare el medio de desintegración combinando 4,7 mililitros de medio DMEM F12 suplementado con 250 microlitros de colagenasa y 50 microlitros de hialuronidasa en una placa de cultivo de 60 milímetros. Después de la centrifugación, los fragmentos tumorales formarán un sedimento en el fondo del tubo cónico.

Aspire con cuidado y deseche el sobrenadante. A continuación, agregue dos mililitros de medio de desintegración recién preparado que contenga enzima al paladar tumoral. Pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces para movilizar el tejido y luego transfiéralo a la placa de cultivo de 60 milímetros.

Coloque la placa de cultivo en el incubador durante 18 horas. Al día siguiente, caliente el medio DMEM F12 suplementado con 10 %FBS y 1 %penicilina-estreptomicina en un baño de agua a 37 grados celsius. Retire la placa que contiene el cultivo de schwannoma vestibular del incubador y trasládela a la cabina de flujo laminar. Utilizando una aguja de calibre 22 acoplada a una jeringa de seis mililitros, aspire el medio que contiene el cultivo y transfiéralo a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros.

Centrifugar durante cinco minutos a 1000G a 37 grados Celsius. Mientras tanto, utilice pinzas estériles para colocar el número requerido de cubreobjetos de vidrio recubiertos con polidilicina y laminina en una placa de cultivo de 24 pocillos. A partir de un tumor en forma de cubo de un centímetro de lado, se pueden cultivar entre 24 y 32 pocillos, por lo que para la mayoría de los tumores más pequeños, planificar entre ocho y 16 pocillos de células en cultivo es adecuado.

Tras la centrifugación, deseche el sobrenadante y re-suspenda el sedimento celular en medio precalentado, utilizando un mililitro de suspensión celular por pocillo previsto. Utilice una pipeta serológica de cinco mililitros para aspirar dos mililitros de la suspensión celular y deposite un mililitro en cada pocillo de la placa de 24 pocillos. Continúe aspirando y depositando el medio que contiene células tumorales, aspirando de a dos mililitros y depositando un mililitro en cada pocillo previsto, hasta que la suspensión de células tumorales se haya dividido equitativamente entre todos los pocillos preparados.

Coloque la placa de 24 pocillos en el incubador a 37 grados celsius durante la noche. Revise la placa al día siguiente; si se observa debris significativo en el fondo de los pocillos, cambie cuidadosamente el medio en cada pocillo por medio de cultivo DMEM F12 suplementado nuevo, teniendo cuidado de no desalojar las células adherentes. Si no hay debris, regrese la placa al incubador y cambie el medio por primera vez el día cinco y cada tres días a partir de entonces.

Esta imagen de campo brillante ilustra el patrón típico de organización de las células de schwannoma vestibular en cultivo. Estas imágenes de inmunofluorescencia de un cultivo primario humano de schwannoma vestibular se tomaron tras 48 horas de exposición a ink 80 que expresa GFP, mostrado en verde. La fluorescencia roja procede de la inmunomarcación con faloíquina F-actina, que marca el citoesqueleto, y la fluorescencia azul es DAPI, que marca el núcleo.

El recuadro es una imagen con mayor aumento de una región de la imagen con menor aumento. Al realizar este procedimiento, es importante recordar anotar los momentos en que se colocan la muestra de secreción y la muestra de cultivo en el incubador, para asegurar que los pasos posteriores se sigan tras los periodos de incubación correctos. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la transducción viral, la fijación, la inmunofluorescencia, el tratamiento con fármacos y la extracción de ARN para responder preguntas adicionales, como la forma en que se expresan diferentes virus en las células o cómo cambia la expresión génica tras el tratamiento con fármacos.

Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la investigación del schwannoma vestibular exploraran la forma en que las células humanas primarias responden a diferentes fármacos en pacientes vivos que han sido sometidos a cirugía.