Name: Un Marco Metodológico Unificado para la Investigación de Schwannoma Vestibular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Aprende a procesar muestras de schwannoma vestibular humano para cultivo primario y análisis de secreciones tumorales. Este método minimamente manipulativo preserva la viabilidad celular y permite probar candidatos terapéuticos directamente.

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Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Sordera y otros trastornos de la comunicación subvenciones R01DC015824 (KMS) y T32DC00038 (apoyo JES y SD), el Departamento de Defensa W81XWH-14-1-0091 (KMS), la Fundación Bertarelli (KMS) , La Fundación Nancy Sayles Day (KMS), el Lauer Tinnitus Research Center (KMS) y la Fundación Barnes (KMS).

<ol><li>Babu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vestibular+schwannomas+in+the+modern+era%3A+epidemiology%2C+treatment+trends%2C+and+disparities+in+management%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Vestibular schwannomas in the modern era: epidemiology, treatment trends, and disparities in management.</a> J Neurosurg. 119 (1), 121-130 (2013).</li>
<li>Gal, T. J., Shinn, J., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+epidemiology+and+management+trends+in+acoustic+neuroma%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Current epidemiology and management trends in acoustic neuroma.</a> Otolaryngol Head Neck Surg. 142 (5), 677-681 (2010).</li>
<li>Propp, J. M., McCarthy, B. J., Davis, F. G., Preston-Martin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Descriptive+epidemiology+of+vestibular+schwannomas%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Descriptive epidemiology of vestibular schwannomas.</a> Neuro Oncol. 8 (1), 1-11 (2006).</li>
<li>Stangerup, S. E., Tos, M., Thomsen, J., Caye-Thomasen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((True+incidence+of+vestibular+schwannoma%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">True incidence of vestibular schwannoma?</a> Neurosurgery. 67 (5), 1335-1340 (2010).</li>
<li>Tos, M., Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P., Tos, T., Thomsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+real+incidence+of+vestibular+schwannoma%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">What is the real incidence of vestibular schwannoma?</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 130 (2), 216-220 (2004).</li>
<li>Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+natural+history+of+vestibular+schwannomas%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngol+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and natural history of vestibular schwannomas.</a> Otolaryngol Clin North Am. 45 (2), 257-268 (2012).</li>
<li>Mahaley, M. S., Mettlin, C., Natarajan, N., Laws, E. R., Peace, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+patterns+of+care+of+brain+tumor+patients+in+the+United+States%3A+a+study+of+the+Brain+Tumor+Section+of+the+AANS+and+the+CNS+and+the+Commission+on+Cancer+of+the+ACS%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Analysis of patterns of care of brain tumor patients in the United States: a study of the Brain Tumor Section of the AANS and the CNS and the Commission on Cancer of the ACS.</a> Clin Neurosurg. 36, 347-352 (1990).</li>
<li>Carlson, M. L., Link, M. J., Wanna, G. B., Driscoll, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+sporadic+vestibular+schwannoma%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngol+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Management of sporadic vestibular schwannoma.</a> Otolaryngol Clin North Am. 48 (3), 407-422 (2015).</li>
<li>Dilwali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporadic+vestibular+schwannomas+associated+with+good+hearing+secrete+higher+levels+of+fibroblast+growth+factor+2+than+those+associated+with+poor+hearing+irrespective+of+tumor+size%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Sporadic vestibular schwannomas associated with good hearing secrete higher levels of fibroblast growth factor 2 than those associated with poor hearing irrespective of tumor size.</a> Otol Neurotol. 34 (4), 748-754 (2013).</li>
<li>Caye-Thomasen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+and+VEGF+receptor-1+concentration+in+vestibular+schwannoma+homogenates+correlates+to+tumor+growth+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">VEGF and VEGF receptor-1 concentration in vestibular schwannoma homogenates correlates to tumor growth rate.</a> Otol Neurotol. 26 (1), 98-101 (2005).</li>
<li>Koutsimpelas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+VEGF%2FVEGF-R+axis+in+sporadic+vestibular+schwannomas+correlates+with+irradiation+and+disease+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22ORL+J+Otorhinolaryngol+Relat+Spec%22%5BJournal%5D)">The VEGF/VEGF-R axis in sporadic vestibular schwannomas correlates with irradiation and disease recurrence.</a> ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 74 (6), 330-338 (2012).</li>
<li>Dilwali, S., Roberts, D., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+VEGF-A+and+cMET+signaling+in+human+vestibular+schwannomas+and+schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Interplay between VEGF-A and cMET signaling in human vestibular schwannomas and schwann cells.</a> Cancer Biol Ther. 16 (1), 170-175 (2015).</li>
<li>Dilwali, S., Kao, S. Y., Fujita, T., Landegger, L. D., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsteroidal+anti-inflammatory+medications+are+cytostatic+against+human+vestibular+schwannomas%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Nonsteroidal anti-inflammatory medications are cytostatic against human vestibular schwannomas.</a> Transl Res. 166 (1), 1-11 (2015).</li>
<li>Dilwali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+validation+of+anti-nuclear+factor-kappa+B+therapy+to+inhibit+human+vestibular+schwannoma+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Preclinical validation of anti-nuclear factor-kappa B therapy to inhibit human vestibular schwannoma growth.</a> Mol Oncol. 9 (7), 1359-1370 (2015).</li>
<li>Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+Factors+from+Human+Vestibular+Schwannomas+Can+Cause+Cochlear+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage.</a> Sci Rep. 5, 18599(2015).</li>
<li>Blakeley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+drug+treatments+for+neurofibromatosis+type+2-associated+vestibular+schwannoma%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Development of drug treatments for neurofibromatosis type 2-associated vestibular schwannoma.</a> Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 20 (5), 372-379 (2012).</li>
<li>Schroeder, R. D., Angelo, L. S., Kurzrock, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF2%2Fmerlin+in+hereditary+neurofibromatosis+2+versus+cancer%3A+biologic+mechanisms+and+clinical+associations%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">NF2/merlin in hereditary neurofibromatosis 2 versus cancer: biologic mechanisms and clinical associations.</a> Oncotarget. 5 (1), 67-77 (2014).</li>
<li>Schularick, N. M., Clark, J. J., Hansen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+human+vestibular+schwannomas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary culture of human vestibular schwannomas.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li>
<li>Dilwali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+human+Schwann+and+schwannoma+cells%3A+improved+and+simplified+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Primary culture of human Schwann and schwannoma cells: improved and simplified protocol.</a> Hear Res. , 25-33 (2014).</li>
<li>Brown, C. M., Ahmad, Z. K., Ryan, A. F., Doherty, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+receptor+expression+in+sporadic+vestibular+schwannomas%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Estrogen receptor expression in sporadic vestibular schwannomas.</a> Otol Neurotol. 32 (1), 158-162 (2011).</li>
<li>Cioffi, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-21+overexpression+contributes+to+vestibular+schwannoma+cell+proliferation+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-21 overexpression contributes to vestibular schwannoma cell proliferation and survival.</a> Otol Neurotol. 31 (9), 1455-1462 (2010).</li>
<li>Doherty, J. K., Ongkeko, W., Crawley, B., Andalibi, A., Ryan, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ErbB+and+Nrg%3A+potential+molecular+targets+for+vestibular+schwannoma+pharmacotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">ErbB and Nrg: potential molecular targets for vestibular schwannoma pharmacotherapy.</a> Otol Neurotol. 29 (1), 50-57 (2008).</li>
<li>Aguiar, P. H., Tatagiba, M., Samii, M., Dankoweit-Timpe, E., Ostertag, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comparison+between+the+growth+fraction+of+bilateral+vestibular+schwannomas+in+neurofibromatosis+2+%28NF2%29+and+unilateral+vestibular+schwannomas+using+the+monoclonal+antibody+MIB+1%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurochir+%28Wien%29%22%5BJournal%5D)">The comparison between the growth fraction of bilateral vestibular schwannomas in neurofibromatosis 2 (NF2) and unilateral vestibular schwannomas using the monoclonal antibody MIB 1.</a> Acta Neurochir (Wien). 134 (1-2), 40-45 (1995).</li>
<li>Cattoretti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+against+recombinant+parts+of+the+Ki-67+antigen+%28MIB+1+and+MIB+3%29+detect+proliferating+cells+in+microwave-processed+formalin-fixed+paraffin+sections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies against recombinant parts of the Ki-67 antigen (MIB 1 and MIB 3) detect proliferating cells in microwave-processed formalin-fixed paraffin sections.</a> J Pathol. 168 (4), 357-363 (1992).</li>
<li>Hung, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+study+of+human+vestibular+nerve+schwannoma+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry study of human vestibular nerve schwannoma differentiation.</a> Glia. 38 (4), 363-370 (2002).</li>
<li>Archibald, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+expression+in+vestibular+schwannomas%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">B7-H1 expression in vestibular schwannomas.</a> Otol Neurotol. 31 (6), 991-997 (2010).</li>
<li>Landegger, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+AAV+vector+enables+safe+and+efficient+gene+transfer+to+the+mammalian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear.</a> Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).</li>
<li>Zinn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Silico+Reconstruction+of+the+Viral+Evolutionary+Lineage+Yields+a+Potent+Gene+Therapy+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector.</a> Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).</li>
<li>Kim, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulforaphane%2C+a+natural+component+of+broccoli%2C+inhibits+vestibular+schwannoma+growth+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Sulforaphane, a natural component of broccoli, inhibits vestibular schwannoma growth in vitro and in vivo.</a> Sci Rep. 6, 36215(2016).</li>
<li>Soares, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+derived+from+human+vestibular+schwannomas+associated+with+poor+hearing+damage+cochlear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells.</a> Neuro Oncol. 18 (11), 1498-1507 (2016).</li>
<li>Lysaght, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+of+human+perilymph%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteome of human perilymph.</a> J Proteome Res. 10 (9), 3845-3851 (2011).</li>
<li>Caye-Thomasen, P., Borup, R., Stangerup, S. E., Thomsen, J., Nielsen, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deregulated+genes+in+sporadic+vestibular+schwannomas%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Deregulated genes in sporadic vestibular schwannomas.</a> Otol Neurotol. 31 (2), 256-266 (2010).</li>
<li>Schulz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+nerve+microenvironment+for+schwannoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">The importance of nerve microenvironment for schwannoma development.</a> Acta Neuropathol. 132 (2), 289-307 (2016).</li>
<li>Torres-Martin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+profiling+in+vestibular+schwannomas+shows+critical+deregulation+of+microRNAs+and+upregulation+in+those+included+in+chromosomal+region+14q32%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Global profiling in vestibular schwannomas shows critical deregulation of microRNAs and upregulation in those included in chromosomal region 14q32.</a> PLoS One. 8 (6), e65868(2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este manuscrito describe un marco metodológico unificado para la investigación VS, que describe el procesamiento simultáneo de especímenes humanos VS y GAN para aplicaciones de investigación aguas abajo. A medida que la investigación VS entra en la era de la medicina de precisión, la preparación de la misma muestra en formas capaces de responder a numerosas preguntas de investigación permitirá el descubrimiento de los conocimientos moleculares, celulares, genéticos y proteómicos específicos de cada paciente. <p clas...

Los schwannomas vestibulares (SV) son los neoplasmas más comunes del ángulo cerebelopontino, diagnosticados en 1 de cada 100.000 individuos. Aunque no metastásicos, estos tumores afectan gravemente la calidad de vida del paciente 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Los individuos afectados comúnmente viven con pérdida de audición, tinnitus, y una sensación de plenitud auditiva. Los síntomas se vuelven cada vez más debilitantes a medida que el tumor crece, causando problemas de equilibrio, parálisis facial y deterioro de otras funciones del nervio craneal. Complicaciones potencialmente mortales debido a la compresión del tronco encefálico también puede resultar 7 . Las opciones de manejo para VS se limitan esencialmente a la espera vigilante de tumores estáticos y radioterapia estereotáctica o resección quirúrgica de tumores en crecimiento <sUp class = &quot;xref&quot;&gt; 8. La extirpación quirúrgica de estos tumores en los hospitales afiliados a la investigación presenta la oportunidad de adquirir y analizar el tejido tumoral fresco recogido durante las cirugías del paciente. Una aproximación quirúrgica específica a la VS, la resección translabyrinthine, puede incluso ofrecer el acceso al epitelio sensorial humano valioso del oído interno y del perilymph. Debido a que los VSs surgen de un nervio sensorial periférico ( es decir, el nervio vestibular), es importante comparar las observaciones asociadas con VS con las derivadas de un nervio control adecuado, como el gran nervio auricular humano (GAN). Los GAN sanos se sacrifican regularmente durante las parotidectomías o disecciones del cuello y pueden utilizarse como modelos robustos para la fisiología sana de las células de Schwann 9 . Debido a que no hay fármacos aprobados por la FDA para el tratamiento o la prevención de VS esporádicos, es imperativo que los investigadores elucidar el mecanismo molecular subyacenteDe la enfermedad para identificar objetivos terapéuticos. Las proteínas que se ha demostrado que juegan un papel en la patogenia VS incluyen merlin, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), ciclooxigenasa 2 (COX-2), factor nuclear kappa B (NF-κ B), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa) , Receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), y moléculas de señalización relacionadas 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Recientes avances han ampliado y mejorado los protocolos para la recolección, procesamiento, cultivo, y la investigación posterior de primaria schwannomas vestibulares humanos y tejidos nerviosos saludables [ 18 , 19] . Sin embargo, la mayoría de los protocolos existentes están diseñados paraDe dichos tejidos para una única solicitud de investigación posterior ( es decir, cultivo celular solo). Este artículo presenta un marco metodológico unificado para el procesamiento simultáneo de una única muestra primaria VS o GAN humana para múltiples aplicaciones aguas abajo: cultivo específico de tipo celular, extracción de proteínas, preservación de ARN, recolección de secreción tumoral y fijación de tejido. Este trabajo también detalla la colección quirúrgica y el procesamiento de líquido cefalorraquídeo humano (LCR) y perilinfa durante la resección translaviríntica VS, ya que estos tejidos estrechamente relacionados pueden servir como fuentes importantes de biomarcadores para VS. Finalmente, este protocolo presenta pasos para la transducción viral de células VS humanas primarias en cultivo como una aplicación novedosa de este tejido para uso en terapia génica.

<table><tbody><tr><td>BioCoat Poly-D-Lisina/Laminina 12 mm #1 Cubreobjetos de vidrio alemán</td><td>Corning</td><td>354087</td><td>O prepare cubreobjetos con Corning Laminin (CB-40232) y Cultrex Poly-L-Lisine (3438-100-01)</td></tr><tr><td>CELLSTAR 15 mL Tubos de Centrífuga, Fondo Cónico, Graduación, Greiner Estéril</td><td>Bio-One</td><td>188161</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 50 mL Tubos de Centrífuga, Fondo Cónico, Graduación, Estéril</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Placa de cultivo celular, 60 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa de Clostridium histolyticum,</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1639</td><td></td></tr><tr><td>Costar 24 pocillos transparentes Placas de pocillos múltiples tratadas con TC, estériles</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glucosa alta, piruvato, sin glutamina, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #3, Dumoxel</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-30</td><td>Autoclave antes de usar</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #5, punta estándar, autoclave Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>antes de usar</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino, calificado, regiones aprobadas por el USDA, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10437-028</td><td>Alícuota en tubos de 50 mL y almacenamiento en -20 grados; C congelador</td></tr><tr><td>Hialuronidasa de Testículos Bovinos, Tipo I-S, Polvo Liofilizado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP Unidad de Filtro de Jeringa, 0.22 &micro; m, polietersulfona, 33 mm, estéril</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído, grado reactivo, cristalino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Antes de usar: Establecer Procedimientos Operativos Estándar basados en protocolos disponibles en línea</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td>Autoclave antes de usar</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL), 100 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP Tabletas Inhibidoras de la Fosfatasa</td><td>Roche</td><td>04906845001</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Tabletas Inhibidoras de la Proteasa Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>88666</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas y puntas de pipeta, 5/10/25 mL</td><td>Variable</td><td>Variable</td><td></td></tr><tr><td>Triturador de homogeneización de plástico para microtubos de 1,5/2,0 mL E</td><td>& K Scientific</td><td>EK-10539</td><td></td></tr><tr><td>Agujas PrecisionGlide, 27 G x 1 1/2 pulgadas</td><td>BD</td><td>301629</td><td></td></tr><tr><td>Tampón RIPA</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-115</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater (solución de estabilización de ARN)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM7021</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga con cierre seguro, polipropileno, 0,5 ml</td><td>Autoclave de 022363719 Eppendorf</td><td></td><td>antes de usar</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga Safe-Lock, polipropileno, 1,5 mL</td><td>Autoclave Eppendorf</td><td></td><td>022363204 antes de usar</td></tr><tr><td>solución salina - Inyección de cloruro de sodio al 0,9%, bacteriostático, 20 mL</td><td>Hospira</td><td>0409-1966-05</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de bisturí - #15</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>Schuknecht Tubo de succión calibre 24</td><td>Bausch + Lomb</td><td>N1698 42</td><td>Útil para el abordaje quirúrgico (además de los instrumentos quirúrgicos otológicos comunes) y p. ej. un marcador quirúrgico azul</td></tr><tr><td>Contenedor de muestras, OR estéril, 4OZ</td><td>Medline</td><td>DYND30331H</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000-C Microscopio estereoscópico</td><td>Zeiss</td><td>000000-1106-133</td><td></td></tr><tr><td>Combinación de jeringa/aguja, punta Luer-Lok, 5 mL, 22 g x 1 pulg.</td><td>BD</td><td>309630</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de tuberculina solamente, punta deslizante, 1 mL</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de tuberculina solamente, punta deslizante, 3 mL</td><td>BD</td><td>309656</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador ultrasónico, serie 4710, sonda CV18</td><td>Cole-Parmer</td><td>CP25013</td><td></td></tr></tbody></table>

un marco metodológico unificado para la investigación de schwannoma vestibular

A Unified Methodological Framework for Vestibular Schwannoma Research

Los schwannomas vestibulares son las neoplasias más comunes del ángulo cerebelopontino, constituyendo un 6-8% de todos los crecimientos intracraneales. Aunque estos tumores causan pérdida auditiva neurosensorial en hasta el 95% de los individuos afectados, los mecanismos moleculares subyacentes a esta pérdida auditiva siguen siendo esquivos. Este artículo describe los pasos establecidos en nuestro laboratorio para facilitar la recolección y procesamiento de varias muestras de tejido humano primario para aplicaciones de investigación en aguas abajo integrantes del estudio de schwannomas vestibulares. Específicamente, este trabajo describe un marco metodológico unificado para la recolección, procesamiento y cultivo de células de Schwann y schwannoma de muestras quirúrgicas. Esto se integra con los pasos de procesamiento paralelos ahora considerados esenciales para la investigación actual: la recolección de secreciones tumorales y nerviosas, la preservación del ARN y la extracción de proteínas de tejidos recolectados, la fijación de tejido para la preparación de secciones,D la exposición de las células humanas primarias a los virus adeno-asociados para su aplicación a la terapia génica. Además, este trabajo destaca el enfoque quirúrgico translabyrinthine para recoger este tumor como una oportunidad única para obtener epitelio sensorial humano desde el oído interno y perilymph. Se proporcionan consejos para mejorar la calidad experimental y se destacan las trampas comunes.

Las células VS humanas primarias en cultivo, como se establece en la sección 5, pueden tratarse como modelos informativos para procesos asociados a enfermedades en muchas aplicaciones de investigación posteriores ( Figura 1 ). Las células sanas de Schwann cultivadas en la sección 6 proporcionan un punto de comparación directo e instructivo. Como se describe a continuación, los datos extensos de VSs y GANs procesados ​​de acuerdo con este marco metodológico u...

El objetivo de este protocolo es describir la recolección y el procesamiento de muestras quirúrgicas humanas para múltiples aplicaciones de aguas abajo en schwannoma vestibular y la investigación con células de Schwann.

Un Marco Metodológico Unificado para la Investigación de Schwannoma Vestibular

Vestibular schwannomas are the most common neoplasms of the cerebellopontine angle, making up 6-8% percent of all intracranial growths. Though these ...

El objetivo general de este procedimiento es procesar una muestra de schwannoma vestibular humano recibida del quirófano para el cultivo primario de células y la recolección de secreciones tumorales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación del schwannoma vestibular, como la mejor manera de recibir, almacenar y procesar una muestra tumoral primaria humana destinada a su uso en múltiples ensayos biomoleculares. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza un método de cultivo con manipulación mínima para propagar células primarias humanas de schwannoma vestibular.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia para el schwannoma vestibular porque los candidatos terapéuticos prometedores pueden probarse directamente en células cultivadas. Comience transfiriendo el recipiente que contiene la muestra recién obtenida de schwannoma vestibular o del nervio auricular mayor desde el hielo utilizado para el transporte desde el quirófano hacia una cabina de flujo laminar en el laboratorio. Utilice pinzas estériles para transferir cuidadosamente la muestra al primero de tres tubos de 1,5 mililitros llenos con 1,4 mililitros de PBS exterior.Cierre cada tubo una vez que contenga la muestra y agite suavemente para lavar. Coloque la muestra en una placa de Petri seca de 60 milímetros y use pinzas para eliminar todos los tejidos muertos en las áreas con vasos sanguíneos prominentes. Utilice pinzas o una hoja de bisturí para dividir la muestra en piezas separadas para la conservación de ARN, extracción de proteínas, recolección de secreciones, fijación y cultivo celular.Transfiera el fragmento de la muestra designado para el cultivo celular a una nueva placa de cultivo de 60 milímetros que contenga de cinco a ocho mililitros de medio DMEM F12 suplementado frío. Coloque el fragmento de schwannoma vestibular o del nervio auricular mayor designado para la recolección de secreciones en un tubo vacío de 1,5 mililitros. Comience pipeteando 500 microlitros de DMEM sin suplementar con FBS en dos tubos de 1,5 mililitros.El primer tubo se utilizará para recolectar las secreciones tumorales y el segundo tubo servirá como control emparejado. Coloque uno de los tubos que contiene DMEM sobre una balanza digital calibrada. Pese la balanza, coloque el trozo de especimen designado para la recolección de secreciones dentro del tubo y péselo.Observe el resultado, que representará el peso del tejido por separado. Bajo una campana de flujo laminar, ajuste el volumen de DMEM en el tubo a 100 microlitros por cada 10 miligramos de la muestra. Coloque el tubo que contiene la muestra de tejido y su control apareado en el incubador.Incube durante al menos 72 horas para recolectar cantidades biológicamente útiles de secreciones tumorales o nerviosas. Después de la incubación durante 72 horas, utilice una pipeta de un mililitro para retirar el medio que contiene la secreción del espécimen. Para evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación, alícuote el medio en nuevos tubos según el análisis posterior planeado.Almacene el fragmento original del tejido, las secreciones y el DMEM control en un congelador a menos 80 grados Celsius hasta que se inicien las aplicaciones posteriores. Comience el procedimiento de cultivo utilizando una pinza en cada mano para separar el tejido del schwannoma vestibular en fragmentos de aproximadamente un milímetro cúbico. Luego aspire el medio y los fragmentos tumorales con una pipeta serológica de 10 milímetros y transfiera todo el contenido a un tubo cónico de 15 mililitros.Centrifugar durante tres minutos a 1000G a 25 grados Celsius. Durante la centrifugación, prepare el medio de desintegración combinando 4,7 mililitros de medio DMEM F12 suplementado con 250 microlitros de colagenasa y 50 microlitros de hialuronidasa en una placa de cultivo de 60 milímetros. Después de la centrifugación, los fragmentos tumorales formarán un sedimento en el fondo del tubo cónico.Aspire con cuidado y deseche el sobrenadante. A continuación, agregue dos mililitros de medio de desintegración recién preparado que contenga enzima al paladar tumoral. Pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces para movilizar el tejido y luego transfiéralo a la placa de cultivo de 60 milímetros.Coloque la placa de cultivo en el incubador durante 18 horas. Al día siguiente, caliente el medio DMEM F12 suplementado con 10 %FBS y 1 %penicilina-estreptomicina en un baño de agua a 37 grados celsius. Retire la placa que contiene el cultivo de schwannoma vestibular del incubador y trasládela a la cabina de flujo laminar. Utilizando una aguja de calibre 22 acoplada a una jeringa de seis mililitros, aspire el medio que contiene el cultivo y transfiéralo a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros.Centrifugar durante cinco minutos a 1000G a 37 grados Celsius. Mientras tanto, utilice pinzas estériles para colocar el número requerido de cubreobjetos de vidrio recubiertos con polidilicina y laminina en una placa de cultivo de 24 pocillos. A partir de un tumor en forma de cubo de un centímetro de lado, se pueden cultivar entre 24 y 32 pocillos, por lo que para la mayoría de los tumores más pequeños, planificar entre ocho y 16 pocillos de células en cultivo es adecuado.Tras la centrifugación, deseche el sobrenadante y re-suspenda el sedimento celular en medio precalentado, utilizando un mililitro de suspensión celular por pocillo previsto. Utilice una pipeta serológica de cinco mililitros para aspirar dos mililitros de la suspensión celular y deposite un mililitro en cada pocillo de la placa de 24 pocillos. Continúe aspirando y depositando el medio que contiene células tumorales, aspirando de a dos mililitros y depositando un mililitro en cada pocillo previsto, hasta que la suspensión de células tumorales se haya dividido equitativamente entre todos los pocillos preparados.Coloque la placa de 24 pocillos en el incubador a 37 grados celsius durante la noche. Revise la placa al día siguiente; si se observa debris significativo en el fondo de los pocillos, cambie cuidadosamente el medio en cada pocillo por medio de cultivo DMEM F12 suplementado nuevo, teniendo cuidado de no desalojar las células adherentes. Si no hay debris, regrese la placa al incubador y cambie el medio por primera vez el día cinco y cada tres días a partir de entonces.Esta imagen de campo brillante ilustra el patrón típico de organización de las células de schwannoma vestibular en cultivo. Estas imágenes de inmunofluorescencia de un cultivo primario humano de schwannoma vestibular se tomaron tras 48 horas de exposición a ink 80 que expresa GFP, mostrado en verde. La fluorescencia roja procede de la inmunomarcación con faloíquina F-actina, que marca el citoesqueleto, y la fluorescencia azul es DAPI, que marca el núcleo.El recuadro es una imagen con mayor aumento de una región de la imagen con menor aumento. Al realizar este procedimiento, es importante recordar anotar los momentos en que se colocan la muestra de secreción y la muestra de cultivo en el incubador, para asegurar que los pasos posteriores se sigan tras los periodos de incubación correctos. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la transducción viral, la fijación, la inmunofluorescencia, el tratamiento con fármacos y la extracción de ARN para responder preguntas adicionales, como la forma en que se expresan diferentes virus en las células o cómo cambia la expresión génica tras el tratamiento con fármacos.Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la investigación del schwannoma vestibular exploraran la forma en que las células humanas primarias responden a diferentes fármacos en pacientes vivos que han sido sometidos a cirugía.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Se describe un método para medir los reflejos oculares vestibulo tridimensionales (3D VOR) en humanos utilizando un período de seis grados de libertad (6DF) simulador de movimiento. La ganancia y la desalineación de la VOR angular 3D proporcionan una medida directa de la calidad de la función vestibular. Se proporcionan datos representativos sobre los sujetos...

Tridimensional vestibular Ocular Pruebas Reflex Con un Seis Grados de Plataforma Movimiento Libertad

Vestibular schwannomas (VS) son tumores no malignos de células (SC) origen Schwann, asociadas a mutaciones en el gen supresor de tumores NF2. Se presenta un protocolo reproducible, eficiente para la enseñanza primaria humanos VS cultivo celular que permite la manipulación experimental molecular y celular y el análisis y recapitula la naturaleza heterogénea de la enfermedad humana.

Cultivo primario de Human vestibular schwannomas

Para evaluar los cambios morfológicos de los nervios craneales tales como la pérdida de nervios estructuras o inflamación de los nervios craneales en la enfermedad de Menière (MD) o en las personas sanas en vivo, un protocolo de evaluación ha sido desarrollado utilizando la proyección de imagen de resonancia magnética (MRI) . Se realizó confirmación adicional basada en MRI de MD.

En Vivo Análisis morfométrico de los nervios craneales de humanos usando resonancia magnética en la enfermedad orejas y oídos de la audiencia Normal de Menière

Se presenta un nuevo método de rehabilitación para reequilibrar el sistema vestibular en pacientes con respuestas asimétricas, que consiste en rotaciones unidireccionales hacia el lado más débil. Al modificar directamente la vía vestibular en lugar de mejorar los aspectos multisensoriales de la compensación, la asimetría se puede normalizar dentro de 1-2 sesiones y mostrar efectos duraderos.

Uso de rotaciones unidireccionales para mejorar la asimetría del sistema vestibular en pacientes con disfunción vestibular

La percepción de la gravedad está comúnmente determinada por la vertical visual subjetiva en la posición vertical de la cabeza. La evaluación adicional en inclinaciones de la cabeza de 15o y 30o en el plano de balanceo garantiza un mayor contenido de información para la detección de percepciones graviceptivas deterioradas.

Evaluación de la percepción gravocetiva estática en el roll-plane utilizando el paradigma vertical visual subjetivo

En este artículo, describimos la configuración experimental, el material y los procedimientos para evaluar los movimientos oculares reflexivos, la percepción del automovimiento y las tareas cognitivas bajo estimulación vestibular magnética, así como la orientación anatómica de los órganos vestibulares, en un escáner de tomografía por resonancia magnética (7T-MRT) de 7 Teslas.

Medición de la influencia de la estimulación vestibular magnética en el nistagmo, la percepción del automovimiento y el rendimiento cognitivo en un MRT 7T

En este trabajo describimos una técnica para la extracción de órganos terminales vestibulares humanos en condiciones fisiológicas durante la laberintectomía y su análisis mediante inmunotinción.

Extracción de órganos terminales vestibulares en condiciones fisiológicas durante la laberintectomía

La metodología exploró las contribuciones visuales y vestibulares a la estabilización de la mirada durante las rotaciones optocinéticas y de todo el cuerpo. Las estimulaciones se llevaron a cabo a través de ensayos visuales, vestibulares y visuovestibulares. La ganancia de movimiento ocular torsional y las frecuencias de nistagmo sirvieron como indicadores para la transmisión subcortical de información de movimiento sensorial específica hacia la respuesta reflexiva del tronco encefálico para...

Uso del seguimiento ocular para evaluar la importancia relativa de la entrada visual y vestibular para el procesamiento del movimiento subcortical en el plano de balanceo

El manejo del cáncer de pulmón recurrente aislado en un campo previamente irradiado es un desafío. En este trabajo describimos una inyección de cisplatino guiada por ecografía endobronquial (EBUS) para el tratamiento de pacientes con recurrencia localizada de cáncer de pulmón en un campo previamente radiado.

Endobronquial guiada por ultrasonografía inyección intratumoral de cisplatino para el tratamiento de los aislada mediastinal La recurrencia de cáncer de pulmón

Los ratones portadores del carcinoma de colon-26 (C26) representan un modelo clásico de caquexia por cáncer. El desgaste muscular progresivo se asocia con crecimiento tumoral, sobreexpresión de ubiquitina ligasas específicas del músculo y reducciones en el área de la sección transversal del músculo. También se observa pérdida de grasa. La caquexia se estudia de una manera dependiente del tiempo con una gravedad cada vez mayor de la emaciación.

El Colon-26 Carcinoma portadores de tumores de ratón como modelo para el estudio del cáncer de caquexia

Aprende a procesar muestras de schwannoma vestibular humano para cultivo primario y análisis de secreciones tumorales. Este método minimamente manipulativo preserva la viabilidad celular y permite probar candidatos terapéuticos directamente.

Un Marco Metodológico Unificado para la Investigación de Schwannoma Vestibular

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