Name: In Vitro Polimerización de la F-actina en endosomas tempranos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Aprende a reconstituir la polimerización de F-actina en endosomas tempranos mediante ensayo in vitro basado en microscopía. Este método permite manipulaciones bioquímicas para estudiar la dinámica del actina en células HeLa.

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Se recibió apoyo de la Fundación Nacional Suiza de ciencia; el programa Sinergia suizo; el polaco-suizo de investigación programa (PSPB-094-2010); el NCCR en Biología química; y LipidX de la iniciativa de SystemsX.ch suizo, evaluados por la Swiss National Science Foundation (a J. G.). O. M. fue apoyado por una beca a largo plazo de la EMBO (ALTF-516-2012).

1. soluciones y preparaciones Nota: todas las soluciones y buffers deben ser preparadas en agua destilada doble (dd) H 2 O. Porque varía el estado de hidratación de la sucrosa, la concentración final de todas las soluciones de sacarosa se determinará mediante un refractómetro.
Solución salina tamponada con fosfato <ol><li>Prepare sin cationes divalentes (PBS-): 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1.5 mM KH 2 PO 4 y 6,5 mM de Na 2 HPO 4. Ajustar el pH a 7.4. Esterilizar en autoclave (1 ciclo a 121 ° C durante 15 min) y almacenar a temperatura ambiente.</li>
	<li>Prepare solución de imidazol de 300 mM: 0,204 g de imidazol en 10 mL de ddH 2 O.Adjust el pH a 7,4 a 4 ° C con HCl. filtro esterilizar utilizando un 0.22 μm filtro de tamaño de poro y almacenar a 4 ° C.</li>
	<li>Prepare homogeneización buffer (HB; preparar aproximadamente 100 mL): sacarosa 250 mM de imidazol de 3 mM. Ajustar el pH a 7,4 a 4 ° C utilizando un medidor de pH. Filtro-esterilizar utilizando un filtro de tamaño de poro de 0,22 μm y almacenar a 4 ° C. complemento la HB antes de usar con un cóctel de inhibidores de la proteasa en concentraciones finales correspondiente a leupeptin 10 mM, 1 mM pepstatin A y 10 ng/mL aprotinina.</li>
	<li>Para los gradientes de flotación de paso, preparar el 62%, 39% y 35% sacarosa soluciones de imidazol de 3 mM, pH 7,4, como se describe a continuación. Precisamente determinar la concentración final de todas las soluciones de sacarosa utilizando un refractómetro de.
	<ol><li>Preparar 100 mL de la solución de sacarosa % 62 imidazol de 3 mM, pH 7,4. Disolver agitando 80,4 g de sacarosa en ddH 2 O pre-calentado a 35 ° C. Agregue 1 mL de solución stock de 300 mM imidazol y llenar hasta 100 mL con ddH 2 O. Ajuste el pH a 7,4 a 4 ° C. filtro esterilizar utilizando un 0,22 μm filtro de tamaño de poro y tienda a 4 ° C.</li>
		<li>Preparar 100 mL de solución 35% sacarosa imidazol de 3 mM, pH 7,4. Disolver agitando 40,6 g de sacarosa en ddH 2 O. Añadir 1 mL de solución stock de 300 mM imidazol y completar a 100 mL con ddH 2 O. ajustar el pH a 7,4 a 4 ° C. filtro esterilizar utilizando un 0.22 μm filtro de tamaño de poro y almacenar a 4 ° C.</li>
		<li>Preparar 50 mL de sacarosa al 39% de imidazol de 3 mM, pH 7,4. Diluir la solución de sacarosa de 62% con la solución de sacarosa de 35%. Almacenar a 4 ° C.</li>
	</ol></li> <li>3 g del paraformaldehido (PFA) se disuelven por agitación en 100 mL de PBS-pre warmed a 60 ° C mientras que la adición de 1 M NaOH gota a gota, ajustar el pH final de 7.4 con NaOH. Filtro-esterilizar utilizando un filtro de tamaño de poro de 0,22 μm y almacenar a -20 ° C. 
	PRECAUCIÓN: 3% PFA es un reactivo tóxico.</li>
	<li>Solución madre de preparar 1 M KCl. 3,73 g de KCl se disuelven por agitación en 50 mL de ddH 2 O. filtro esterilizar utilizando un filtro de tamaño de poro de 0,22 μm y almacenar a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar 50 X concentrado solución madre que contiene 0,625 M Hepes pH 7.0 y 75 mm MgOAc 2 Dec 2 O. alícuota y tienda a -20 ° C.</li>
	<li>Preparar medio de montaje. Mezclar revolviendo 2,4 g de poly(vinyl alcohol) M w ~ 31.000 (PVA) con 6 g de glicerol. Añadir 6 mL de ddH 2 O y dejar durante al menos 2 h a temperatura ambiente. Agregar 12 mL de 0,2 M Tris-Cl (pH 8,5) y calor aproximadamente de 53 ° C con agitación ocasional hasta que se disuelva el PVA.</li>
	<li>Clarificar la solución por centrifugación a 5.000 x g durante 20 min a temperatura ambiente. Recoger el sobrenadante y añadir 2,5% (w/v) 1, 4 - Diazabiciclo-[2.2.2] octano (DABCO) para prevenir el fotoblanqueo durante la detección de fluorescencia. Vortex para cerca de 30 s para disolver. Alícuotas en tubos de plástico de 1,5 mL y conservar a -20 ° C.</li>
</ol> 2. Cultura de la célula <ol><li>cultura HeLa células Dulbecco &#39; s Modified Eagle suplementado con suero fetal de 10%, 10% no esenciales aminoácidos, 10% L-glutamina y 1% de penicilina-estreptomicina. Mantener a 37 ° C en un incubador de 5% CO 2.</li>
	<li>Transfectar las células 24 h antes del experimento con GFP RAB5 10, utilizando el reactivo de transfección comerciales según el fabricante &#39; instrucciones s.</li>
	<li>Cuando sea necesario, preparar fracciones endosomal y citosol de las células agotadas de una proteína de interés (es decir, utilizando RNAi o CRISPR/Cas9) o overexpressing forma wildtype o mutante de la proteína de interés.</li>
</ol> 3. Endosomal fracción preparación Nota: este protocolo describe la sencilla preparación de fracciones subcelulares que contienen endosomas y otras membranas de luz. Si es necesario, fracciones endosome purificada también pueden ser usado 11. Preparar 2 platos de Petri (10 cm de diámetro exterior; 57 cm 2) de las células confluentes que expresan GFP RAB5 como material de partida. El número total de células de HeLa confluentes en placas 2 Petri corresponde aproximadamente a 2.5 x 10 7 células. Cuando sea necesario, los endosomas también pueden prepararse de las células agotadas de una proteína de interés (es decir, utilizando RNAi o CRISPR/Cas9) o overexpressing forma wildtype o mutante de la proteína de interés, siempre expresando GFP RAB5.
 PRECAUCIÓN: todos los pasos del Protocolo de fraccionamiento deben realizarse en hielo.
<ol><li>Colocar las cajas Petri sobre una placa de metal mojada en un cubo de hielo plano y lavar inmediatamente las células dos veces con 5 mL de PBS helada-.</li>
	<li>Quitar todos los PBS - desde el último lavado y añadir 3 mL de PBS-helada por plato. Células no deben secarse durante la manipulación: si es necesario, coloque el cubo de hielo en una plataforma oscilante para cubrir adecuadamente las células con líquido de.</li>
	<li>Eliminar mecánicamente las células en PBS de los platos de Petri con un policía de goma flexible (es decir, raspador de celular caseros). Raspar las células de los platos primero en un rápido movimiento circular alrededor del exterior del plato, seguido de un movimiento hacia abajo en el centro del plato. Raspe suavemente para obtener &#34; hojas de &#34; de las células adjuntas. Transferir suavemente las células usando una pipeta Pasteur de plástico con una abertura amplia para un tubo de polipropileno de 15 mL cónico en hielo.</li>
	<li>Centrifugar durante 5 min a 175 x g a 4 ° C.</li>
	<li>Suavemente Quite el sobrenadante (SN) y añadir 1-3 mL de HB a la pelotilla. Utilizando una pipeta Pasteur de plástico con una abertura amplia, suavemente pipeta hacia arriba y hacia abajo una vez para resuspender las células.</li>
	<li>Centrífuga para 7-10 min a 1.355 x g y 4 ° C. suavemente Quite el SN.</li>
	<li>Realizar homogeneización celular. 
	Nota: Las condiciones deben ser suaves para que las membranas del plasma de las células se rompen, pero los endosomas permanecen intactos.
	<ol><li>Agregar un volumen conocido de HB con inhibidores de la proteasa en cada pellet celular (aproximadamente 100 μL por pellets celulares). Usando una micropipeta de 1.000 μl, suavemente pipeta hacia arriba y hacia abajo hasta que las células son suspendidas. No introducir burbujas de aire.</li>
		<li>Preparar una jeringa de tuberculina de 1 mL con una aguja de 22G, previamente enjuagada con HB y libre de aire o burbujas.</li>
		<li>Llene la jeringa con la suspensión de células relativamente lentamente (para evitar la creación de burbujas de aire), coloque la punta biselada de la aguja contra la pared del tubo y expulsar de la suspensión de células rápidamente al corte de las membranas del plasma de las células adjuntas.</li>
		<li>Tomar una pequeña alícuota de homogeneizado (aproximadamente 3 μL) y diluir en 50 μl de HB en un portaobjetos de vidrio. Mezclar y cubrir con un cubreobjetos de vidrio. Inspeccione el homogeneizado bajo un microscopio de contraste de fase, equipado con un 20 X o 40 X objetivo. 
		Nota: En condiciones óptimas, la mayoría de las células se rompen, pero no son núcleos, que aparecen como gris oscuro y alrededor de estructuras, ( figura 1).</li>
		<li>Repita el paso 3.7.3 y 3.7.4 hasta la mayoría de las células se rompen, generalmente, son necesarias 3-6 golpes arriba y abajo a través de la aguja. Mantener una pequeña alícuota (10-30 μL) de homogeneizado para determinación de proteínas.</li>
	</ol></li> <li>Homogeneizado de centrifugadora durante 7 min a 1.355 x g y 4 ° C. 
	Nota: después de la centrifugación, el sedimento (definido como el pellet nuclear; NP) contiene los núcleos y el sobrenadante (definido como el sobrenadante postnuclear; PNS) contiene el citosol y los organelos lanzados sobre homogeneización y en suspensión libre.</li>
	<li>Recoger cuidadosamente el PNS. Mantenga pequeñas alícuotas (10-30 μL) de la PNS y NP para determinación de proteínas y deseche el NP.</li>
	<li>Ajustar el PNS a 40.6% sacarosa diluyendo la solución de sacarosa de 62% con PNS usando una relación de 1:1.1 de PNS:62% de sacarosa. Mezclar suavemente pero a fondo, sin crear burbujas de aire. Compruebe la concentración de sacarosa utilizando el refractómetro.</li>
	<li>Colocar el PNS en 40,6% de sacarosa en la parte inferior de un tubo de ultracentrifugación. Recubierto con 2,5 mL de la solución de sacarosa de 35% y la llena el tubo de centrífuga con HB. 
	Nota: Las soluciones de sacarosa deben ser en capas para que las interfaces son claramente visibles.</li>
	<li>Ultracentrífuga los gradientes por 1 h a ̴165, 000 x g y 4 ° C.</li>
	<li>Retire cuidadosamente la capa blanca de lípidos en la parte superior del gradiente. A continuación, recoger la interfaz que contiene endosomas, entre la HB y el 35% de sacarosa, utilizando una micropipeta de 200 μL con una punta cortada. 
	Nota: Las fracciones endosomal puede ser utilizadas directamente en el ensayo de polimerización en vitro la actinia o puede ser alícuotas en hielo, flash-congeladas en nitrógeno líquido y almacenados a -80 ° C.</li>
	<li>Determinar la concentración de proteína de las fracciones PNS y endosomal. 
	Nota: Esta concentración debe ser al menos 100 μg/mL. Aproximadamente 2.5 x 10 células 7 en 2 placas de Petri son necesarios para obtener un PNS con al menos 100 μg/mL (véase la nota anterior).</li>
</ol> 4. Preparación del citosol Nota: preparar 2 placas de Petri (10 cm de diámetro; 57 cm 2) de confluentes células HeLa como material de partida. Cuando sea necesario, también pueden prepararse el citosol de las células agotadas de una proteína de interés (es decir, utilizando RNAi o CRISPR/Cas9) o overexpressing un tipo salvaje o una forma mutante de la proteína de interés. En cuanto al Protocolo de fraccionamiento del endosome, todas las medidas deben realizarse en hielo.
<ol><li>Repita los pasos 3.1-3.8.</li>
	<li>Colocar el PNS en un tubo de centrífuga y ultracentrífuga durante 45 minutos a ̴250, 000 x g y 4 ° C.</li>
	<li>Con cuidado quitar la capa blanca en la parte superior y recoger el SN (fracción citosol) sin perturbar el pellet del microsoma. Mantener una alícuota de la fracción para determinación de proteínas de citosol. 
	Nota: El citosol puede ser utilizado directamente en el ensayo de polimerización en vitro la actinia o puede ser alícuotas en hielo, flash-congeladas en nitrógeno líquido y almacenados a -80 ° C.</li>
	<li>Determinar la concentración de proteína de cytosol. 
	Nota: Debe ser por lo menos 3 mg/mL.</li>
</ol> 5. Análisis medición Endosome-dependiente de la polimerización de la actina In Vitro Nota: polimerización de la actina Endosome-dependiente se puede realizar mediante dos enfoques alternativos. En primera aproximación, los materiales son mezclados en un tubo de ensayo, fijo y transferidos a un cubreobjetos y analizados. En el segundo enfoque, descrito aquí, el ensayo puede llevarse a cabo directamente en la cámara de proyección de imagen puede fijo y analizado sin perturbación mecánica ( figura 2). En este segundo enfoque, la mezcla de ensayo no se transfiere de un tubo de ensayo a un cubreobjetos y así permanece imperturbable, disminuyendo el peligro de las redes de la F-actina físicamente ser perturbado durante la transferencia. Además, este segundo enfoque es compatible con un time-lapse análisis de la polimerización de la actina F. Cabe señalar que no hay diferencia en el análisis de la polimerización de la actina F se observó con cualquiera de los dos enfoque. 
Nota: Uso corte de puntas en el protocolo de.
<ol><li>En un tubo de ensayo <ol><li>suavemente mezcla helada purificada GFP RAB5 endosomas (paso 3) con el citosol (paso 4) en una proporción de 1:10 (la concentración de proteína) en un tubo de ensayo cónico helado de 1,5 mL. 
		Nota: Un experimento típico se lleva a cabo con aproximadamente 40-50 μl.</li>
		<li>Ajustar la mezcla de reacción fría a concentraciones finales de 125 mM KCl (con la solución madre de KCl de 1 M), 12,5 mM Hepes y 1,5 mM de MgOAc 2 (con el 50 x solución madre). Luego, ajustar la mezcla con inhibidores de la proteasa a concentraciones finales de leupeptin 10 mM y 1 mM pepstatin A 10 ng/mL aprotinina. Mezclar suavemente todos los componentes de.</li>
		<li>Colocar el tubo de ensayo que contiene la mezcla de reacción a 37 ° C, sin agitación e incubar durante el tiempo deseado. 
		Nota: Por lo general, tardará aproximadamente 3 minutos para detectar la polimerización de la actina en endosomas y 30 min para la formación de una extensa red.</li>
		<li>En el tiempo deseado (es decir, 3 minutos o 30 minutos), detener la reacción colocando el tubo en hielo y añadir 1/10 (vol:vol) de la solución PFA 3% preenfriada.</li>
		<li>Añadir 0.3:10 (vol:vol) de 200 phalloidin unidades/mL (~6.6 μM) conjugado con el tinte rojo-naranja que mancha la actina polimerizada.</li>
		<li>Lugar 12 μL de la mezcla en 12 μL de medio de montaje de PVA en un portaobjetos de vidrio. Poner una tapa de coverslipon de vidrio 18 x 18 mm 2.</li>
		<li>Analizar la muestra con microscopía confocal.</li>
	</ol></li> <li>En la sala de proyección de imagen <ol><li>para hacer cámaras de proyección de imagen microscópicas, use plasma durante 1 min para limpiar un cubreobjetos redondo de 18 mm de diámetro y un diámetro de 35 mm redonda de Petri equipado con fondo de vidrio 20 mm (0.16-0.19 mm).</li>
		<li>Incubar las superficies limpiadas con 1% de β-caseína por 20 min minimizar la Unión a proteínas del cristal. Lave dos veces con imidazol de 3 mM.</li>
		<li>Agregar endosome citosol, en el mismo ensayo mezcla como en los pasos 5.1.1 y 5.1.2, al tubo de ensayo preenfriada 1,5 mL y complementar la mezcla de ensayo con 0,1 μg/μL rodamina-actinia.</li>
		<li>Ajustar el índice de refracción final de la mezcla a 1.375 (26,5% de sacarosa) con 39% sacarosa solución. 
		Nota: Por lo general, se agrega el mismo volumen; sin embargo, esto tiene que ser ajustado empíricamente vuelva a depender de la concentración de sacarosa de la fracción recogida, determinada con un refractómetro ya que la concentración de sacarosa puede cambiar ligeramente de un experimento a experimento.</li>
		<li>Coloque la mezcla en el plato pretratado de 35 mm (paso 5.2.1) y cubrir con el cubreobjetos de 18 mm pretratado (paso 5.2.1).</li>
		<li>Coloque la cámara a 37 ° C, sin agitar.</li>
		<li>Analizar la muestra mediante microscopía confocal de fluorescencia.</li>
	</ol></li></ol> 6. CA de la imagenquisition y análisis de la red de actina <ol><li>adquisición de la imagen <ol><li>adquirir las imágenes en un microscopio confocal invertido. 
		Nota: Ajustes de adquisición de imagen fueron optimizados para un invertido microscopio confocal con un objetivo de aceite de 63 X 1.25 NA. Ajustar la potencia del láser para lograr una buena relación señal a ruido (generalmente alrededor del 50%).</li>
	</ol></li> <li>Cuantificación de la red de actina <ol><li>analizar las imágenes fluorescentes. Utilice el software de código abierto CellProfiler (v2.1.1) 12 para medir la cantidad de actina por endosome (se puede utilizar software alternativo).
		<ol><li>En primer lugar, identificar los endosomas como objeto primario utilizando la señal GFP RAB5. Luego, cuantificar la F-actina asociada a endosomas individuales mediante la propagación de la señal de la actina (rojo-naranja tinte conjugado Phalloidin) como un objeto secundario.</li>
			<li>Promedio y normalizar la cantidad de material asociado para cada objeto a la condición control.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Actinia desempeña un papel crucial en el endosome membrana dinámica4,14. Hemos divulgado previamente que la polimerización y la nucleación de actina ocurren en endosomas tempranos, formando pequeños parches de F-actina o redes. Estas redes de F-actina son absolutamente necesarias para el transporte de membrana más allá de endosomas tempranos a lo largo de la vía de degradación. Interferir en cualquier paso de este proceso de nucleación y polimerización previene e...

En células eucariotas superiores, las proteínas y los lípidos se internalizan en endosomas tempranos donde se produce la separación. Algunas proteínas y lípidos, que están destinados a ser reutilizados, se incorporado en las regiones tubulares de los endosomas tempranos y entonces transportados a la membrana plasmática o a la trans-Golgi network (TGN)1,2. Por el contrario, otras proteínas y lípidos se empaquetan selectivamente en regiones de los endosomas tempranos que presentan un aspecto multivesicular. Amplían estas regiones y, sobre la separación de membranas endosomal temprana, finalmente madura en endosomal libre portador vesículas o cuerpos multivesicular (VCE/MVBs), que son responsables de transporte de carga hacia finales de endosomas1, 2.
Actinia desempeña un papel crucial en el proceso de remodelación de la membrana asociado a capacidad clasificación endosomal y biogénesis del endosome. Clasificación a lo largo de las vías de reciclado a la membrana plasmática o al TGN de la proteína depende el retrómero complejo y las proteínas asociadas. Esta maquinaria de clasificación parece estar acoplado a la formación de las reciclaje túbulos a través de interacciones del retrómero complejo, con la avispa y cicatriz homólogo (colada) actina complejo y ramificado3,4,5 . Por el contrario, destinado para la degradación de moléculas, particularmente activación receptores de señalización, se clasifican en vesículas intraluminales (ILVs) por endosomal clasificación complejos necesarios para transporte (TRASVESTIS)2,6, 7. Aunque no se conoce el posible papel de la actina en el proceso de clasificación de TRASVESTIS-dependiente, F-actina desempeña un papel importante en la biogénesis de la versión cefálica externa/MVBs y en el transporte más allá de endosomas tempranos. En particular, hemos encontrado que anexina A2 une regiones enriquecidas con colesterol de principios endosome y junto con spire1, nuclea la polimerización de la actina F. La formación de la red de actina ramificada en endosomas requiere la actividad de ramificación de la proteína relacionada con la actina (ARP) 2/3 complejo, así como el ERM proteína moesina y la Unión de la actina proteína cortactina8,9.
Aquí, describimos un análisis basado en la microscopía en vitro que reconstituye la nucleación y polimerización de la actina F en membranas de endosomal temprana en tubos de ensayo. Este análisis se ha utilizado previamente para investigar el papel de la anexina A2 en nucleación de F-actina y moesina y cortactina en la formación de endosomal actina redes8,9. Con este protocolo en vitro , la compleja serie de reacciones que se producen en endosomas durante la polimerización de la actina se convierten en susceptible al análisis bioquímico y molecular de los pasos secuenciales del proceso, incluyendo la nucleación de la actinia, lineal polimerización, ramificación y reticulación.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Acros Organics</td><td>196770010</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>AppliChem</td><td>A1042</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Acros Organics</td><td>424370025</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>AppliChem</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de magnesio tetrahidrato</td><td>Fluka</td><td>63047</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotrietol (DTT)</td><td>AppliChem</td><td>A2948</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10125</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fluka</td><td>71690</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Merck Millipore</td><td>107687</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptina</td><td>Roche</td><td>11017101001</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatina</td><td>Roche</td><td>10253286001</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinina</td><td>Roche</td><td>10236624001</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehide</td><td>Polysciences. Inc</td><td>380</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555</td><td>Sondas moleculares</td> de faloidina <td>A34055</td><td></td></tr><tr><td>Actina rodamina</td><td>Citoesqueleto. Inc</td><td>APHR-A</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>poli(alcohol vinílico), Mw ~31 000</td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-2522</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>AppliChem</td><td>A1086</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-caseína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6905</td><td></td></tr><tr><td>Filtro 0.22 &mu; m</td><td>Millex</td><td>SL6V033RS</td><td></td></tr><tr><td>Platos redondos de 10 cm para cultivo celular</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>Plástico Pipeta Pasteur</td><td>Assistent</td><td>569/3 40569003</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polipropileno de 15 mL</td><td>TPP</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>Aguja hipodérmica 22G Negro 30mm</td><td>BD Microlance</td><td>300900</td><td></td></tr><tr><td>Estéril Luer-slip 1mL Jeringas sin aguja</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>Micro portaobjetos de vidrio</td><td>Assistent</td><td>2406</td><td></td></tr><tr><td>18 x 18 mm cubreobjetos de vidrio</td><td>Assistent</td><td>1000/1818</td><td></td></tr><tr><td>SW60 tubo de centrífuga</td><td>Beckman coulter</td><td>344062</td><td></td></tr><tr><td>TLS-55 tubo de centrífuga</td><td>Beckman reja</td><td>343778</td><td></td></tr><tr><td>200-&mu; L punta amarilla</td><td>Starlab</td><td>S1111-0706</td><td></td></tr><tr><td>1.000-&mu; L Azul Punta graduada</td><td>Starlab</td><td>S1111-6801</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de ensayo de 1,5 ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C 311-04-051</td><td></td></tr><tr><td>cubreobjetos redondos de 18 mm de diámetro</td><td>Assistent</td><td>1001/18</td><td></td></tr><tr><td>Plato redondo de 35 mm de diámetro con fondo de vidrio de 20 mm (0,16 - 0,19 mm)</td><td>Refractómetro In vitro Scientific</td><td>D35-20-1,5-N</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Carl Zeiss</td><td>79729</td><td></td></tr><tr><td>Limpiador de plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall WX80 Ultracentrífuga</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46900</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga de sobremesa</td><td>Rotor Beckman</td><td>TL-100</td><td></td></tr><tr><td>SW60</td><td>Reja Beckman</td><td>335649</td><td></td></tr><tr><td>Rotor TLS-55</td><td>Reja Beckman</td><td>346936</td><td></td></tr><tr><td>Microscopía confocal</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM-780</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD reactivo de transfección</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de ensayo de proteínas A</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0113</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de ensayo de proteínas B</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0114</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de ensayo de proteínas S</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0115</td><td></td></tr><tr><td>Raspador de células</td><td>Casero</td><td></td><td>Pieza de caucho de silicona de unos 2 cm, cortada en un ángulo muy agudo y unida a una barra metálica o sujeta con pinzas</td></tr><tr><td>Refractómetro</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medio Esencial Mínimo Eagle (MEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0643</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminoácidos No Esenciales (NEAA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de pH 691</td><td>Metrohm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td></td><td></td><td>NIH, Bethesda MD</td></tr></tbody></table>

in vitro polimerización de la f-actina en endosomas tempranos

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

Muchas funciones endosome temprano, especialmente carga proteínas clasificación y membrana deformación, dependen de los parches de cortos filamentos F-actina nucleadas en la membrana endosomal. Hemos establecido un ensayo basado en la microscopía en vitro que reconstituye la nucleación y polimerización de la actina F en membranas de endosomal temprana en tubos de ensayo, por lo que esta serie compleja de reacciones susceptibles de genética y bioquímica manipulaciones. Endosomal fracciones se preparan por flotación en gradientes de sacarosa de las células que expresan la proteína endosomal temprana RAB5 GFP. Fracciones citosólicas se preparan en cantidades separadas de las células. Endosomal y fracciones citosólicas pueden almacenarse congeladas en nitrógeno líquido, si es necesario. En el ensayo, las fracciones citosólicas y endosomal se mezclan, y la mezcla se incuba a 37 ° C en condiciones adecuadas (p. ej., fuerza iónica, reducir el medio ambiente). En el momento deseado, la mezcla de reacción se fija, y la F-actina se revela con phalloidin. Polimerización y la nucleación de la actinia se analizan por microscopía de fluorescencia. Aquí, Divulgamos que este ensayo puede utilizarse para investigar el papel de los factores que intervienen en la nucleación de la actina en la membrana, o en la posterior elongación, ramificación o entrecruzamiento de filamentos de actina F.

Para ganar penetraciones en la formación de parches de la F-actina en membranas endosome temprano, seguimos el protocolo que se indica en la figura 2. Brevemente, las células fueron transfectadas con GFP RAB5 y luego endosomas tempranos fueron elaboradas por fraccionamiento subcelular. Estos endosomas tempranos purificadas se incubaron con cytosol para actina así como otros factores posiblemente involucrados en la reacción. Al final de la incubación, la reacc...

Primeras funciones de endosome dependen de polimerización de la actina F. Aquí, describimos un análisis basado en la microscopía en vitro que reconstituye la nucleación y polimerización de la actina F en membranas de endosomal temprana en tubos de ensayo, por lo que esta serie compleja de reacciones susceptibles de Bioquímica y genética manipulaciones.

In Vitro Polimerización de la F-actina en endosomas tempranos

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

El objetivo general de este ensayo in vitro basado en microscopía es estudiar la polimerización de actina a partir de endosomas in vitro. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos del tráfico de membranas y la actina, como el papel de la actina en la vía ácida. Y la principal ventaja de esta técnica consiste en reconstituir la polimerización por nucleación de F-actina sobre membranas endosomales tempranas en tubo de ensayo.Esto hace que esta compleja serie de reacciones sea susceptible a mis manipulaciones químicas. Jorge Larios y Olivia Muriel del laboratorio demostrarán el procedimiento. Comience colocando placas con células HeLa sobre una placa metálica húmeda dentro de un recipiente plano con hielo.Y lave las células dos veces con cinco mililitros de PBS frío con hielo. Después de eliminar el PBS del último lavado, agregue tres mililitros de PBS frío con hielo por placa. Luego, use un raspador de goma flexible para desprender las células de las placas con un movimiento circular rápido alrededor del borde exterior de la placa.Seguido de un movimiento descendente en el centro del platillo. Raspar suavemente para obtener láminas de células adheridas. A con

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Describimos cómo técnicas de micro - y Fotomanipulación como FRAP y fotoactivación permiten la determinación de los parámetros de motilidad y la dinámica espacio-temporal de las proteínas a migración de las células. Lecturas experimentales incluyen la dinámica subcelular y facturación de los reguladores de la motilidad o subyacente del citoesqueleto de actina.

Técnicas de micromanipulación que permite el análisis de las dinámicas morfogenéticas y facturación de los reguladores citoesqueléticos

Divulgamos un ensayo simple, eficiente en el tiempo y de alto rendimiento basado en espectroscopia de fluorescencia para la cuantificación de filamentos de actina en muestras biológicas ex vivo de tejidos cerebrales de roedores y sujetos humanos.

Un Ensayo Basado En Espectroscopia De Fluorescencia Eficiente En El Tiempo Para Evaluar El Estado De Polimerización De Actina En Roedores Y Tejidos Cerebrales Humanos

Presentamos protocolos para ensayos microfluídicos de filamentos de actina simples, en combinación con microscopía de fluorescencia, que permiten monitorear con precisión filamentos de actina individuales en tiempo real mientras se exponen secuencialmente a diferentes soluciones de proteínas.

Uso de microfluídica y microscopía de fluorescencia para estudiar la dinámica de ensamblaje de filamentos y haces de actina única

Este protocolo describe la formación de bicapas lipídicas soportadas y la adición de filamentos citoesqueléticos y proteínas motoras para estudiar la dinámica de las redes citoesqueléticas reconstituidas y atadas a la membrana utilizando microscopía de fluorescencia.

Reconstitución de corticidades mínimas de actina atadas a la membrana en bicapas lipídicas soportadas

En este manuscrito, demostramos las técnicas experimentales para encapsular el citoesqueleto de actina F en vesículas lipídicas unilamelares gigantes (también llamadas liposomas), y el método para formar una capa de actina F que imita la corteza en la valva interna de la membrana liposómica.

In vitro Reconstitución del citoesqueleto de actina dentro de vesículas unilamelares gigantes

Este protocolo es una guía para visualizar actina dinámica y microtúbulos utilizando un ensayo de microscopía de fluorescencia interna total (TIRF) in vitro .

Visualización de la dinámica de acoplamiento de actina y microtúbulos in vitro mediante microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF)

Este artículo presenta protocolos para la ingeniería y caracterización de redes compuestas tridimensionales sintonizables de filamentos de actina coentrelazados y microtúbulos. Los compuestos experimentan una reestructuración activa y movimiento balístico, impulsado por motores de miosina II y quinesina, y están sintonizados por las concentraciones relativas de actina, microtúbulos, proteínas motoras y reticulantes pasivos.

Reconstitución y caracterización de compuestos de actina-microtúbulos con dinámica y mecánica accionada por motor sintonizable

Este protocolo describe cómo producir cometas de actina en las superficies de las perlas utilizando ingredientes proteicos disponibles comercialmente. Tales sistemas imitan las estructuras protrusivas que se encuentran en las células, y se pueden utilizar para examinar los mecanismos fisiológicos de la producción de fuerza de una manera simplificada.

Reconstitución de la motilidad basada en actina con proteínas disponibles comercialmente

Aquí, presentamos métodos para preparar ensamblajes de actina cuasi-bidimensionales (2D) entrelazados, reticulados y de cristal líquido a partir de proteínas purificadas.

Ajuste de los modos de contractilidad y deformación de ensamblajes activos basados en actina in vitro: de redes activas bidimensionales a gotas de cristal líquido

Este estudio describe las técnicas biofísicas, bioquímicas y moleculares para caracterizar la actividad chaperona de Escherichia coli HdeB en condiciones de pH ácido. Estos métodos se han aplicado con éxito para otros chaperones ácido-protectores tales como HdeA y puede ser modificado para trabajar para otros chaperones y condiciones de estrés.

Detección de la actividad dependiente del pH de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Acompañante HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; y<em&gt; En Vivo</em

Aprende a reconstituir la polimerización de F-actina en endosomas tempranos mediante ensayo in vitro basado en microscopía. Este método permite manipulaciones bioquímicas para estudiar la dinámica del actina en células HeLa.

In Vitro Polimerización de la F-actina en endosomas tempranos

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